CN112538492B - 一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑*** - Google Patents

一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑*** Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑***。本发明的SpCas9n变体融合ABE的碱基编辑***入生物体或生物细胞内，使所述SpCas9n变体、sgRNA和ABE的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑；所述sgRNA靶向所述靶点序列；所述靶点序列的PAM序列为NRTH，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。本发明利用SpCas9n变体融合ABE的碱基编辑***在水稻中实现了更多的靶点序列中由A:T到G:C的替换，如PAM序列为NRTH的靶点序列，扩展了ABE介导的碱基替换***的编辑范围，具有广泛的应用前景。

Description

一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑***
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效水稻碱基编辑***及应用。
背景技术
越来越多的研究表明，大部分生物性状的改变都存在着相关基因的突变，其中以碱基置换突变即点突变最为常见。寻求高效的单碱基编辑技术一直以来都是植物研究的热点和难点。基因编辑技术CRISPR/Cas9自诞生以来，在基因敲除、敲入、碱基修复等领域得到了广泛的应用。在2017年，刘如谦团队开发出了腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors, ABEs)，该工具能够实现腺嘌呤A到鸟嘌呤G的单碱基转换。ABE***由gRNA和融合蛋白构成，其中，融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白(Cas9 nickase, Cas9n)和腺嘌呤脱氨酶组成。其原理为脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9n)的N末端融合，在gRNA引导下，使非靶链中的腺苷脱氨，暴露为单链DNA (single-stranded, ssDNA)，然后将腺嘌呤A转化为肌苷I(A-to-I)，最后，DNA聚合酶将肌苷I识别为鸟嘌呤G进行复制，而互补链上原来与腺嘌呤A互补的胸腺嘧啶T将会变成胞嘧啶C，进而完成碱基置换过程。
目前该***仍然存在一定的缺陷，主要表现为在植物中碱基编辑效率低下。目前有不少研究致力于提升现有的ABE碱基编辑***的效率，如改变核定位信号的种类和位置、不断升级ABE版本等。但是目前碱基编辑的效率提升有限。而且，基于CRISPR-Cas9***的一些碱基编辑***，PAM序列依赖性对靶向范围的限制更大。尽管近些年已经挖掘了很多识别不同PAM序列的Cas9蛋白或者变体用于基因组编辑，使它们识别位点由从NGG扩展到大多数NG位点，但在基因组中缺乏G碱基的位置仍然很难进行靶向编辑。所以有必要提供一种识别更多位点，且高效的单碱基编辑***，从而拓宽ABE的打靶范围。
发明内容
本发明提供一种能识别非G序列，且高效的碱基编辑***，要解决的技术问题是如何将生物体或生物细胞中PAM序列为NRTH的靶点序列中的A:T突变成G:C。
为解决上述技术问题，本发明首先提供一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体，其特征在于，所述SpCas9n变体包含：
（a）序列表中SEQ ID NO：1所示序列；
（b）在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；
（c）在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
（d）SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种水稻碱基编辑***，其特征在于，所述水稻碱基编辑***包括所述SpCas9n变体的编码基因、转录sgRNA的DNA分子以及腺嘌呤脱氨酶ABE的编码基因；
所述sgRNA靶向目标靶点序列；
所述目标靶点序列的PAM序列为NRTH，其中，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。
优选地，碱基编辑***还包括融合蛋白；所述融合蛋白由SpCas9n蛋白变体和腺嘌呤脱氨酶ABE组成；所述SpCas9n蛋白变体基因如序列表中SEQ ID NO：1所示；腺嘌呤脱氨酶ABE基因如序列表中SEQ ID NO：2所示。
另一方面，本发明提供一种用于所述的水稻碱基编辑***的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达权利要求2中所述的融合蛋白；所述表达盒二表达权利要求2中所述的sgRNA和目标靶点序列。
另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒表达权利要求3中所述的融合蛋白或sgRNA和目标靶点序列。
另一方面，本发明提供一种所述的水稻碱基编辑***的应用，其特征在于：所述应用包括利用所述碱基编辑***中的SpCas9n变体的编码基因、转录sgRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述SpCas9n变体、所述sgRNA和所述ABE的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为NRTH的PAM序列附近的A:T 突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
另一方面，本发明提供一种所述的重组表达载体的应用，其特征在于：所述应用包括利用所述的重组表达载体中的SpCas9n变体的编码基因、转录sgRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述SpCas9n变体、所述sgRNA和所述ABE的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为NRTH的PAM序列附近的A:T 突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
优选地：所述受体可为植物愈伤组织。
优选地，“导入受体”的过程可经过侵染、共培养、筛选步骤来实现，进而得到编辑后的植物愈伤组织，然后利用愈伤组织分化成植株。
本发明将SpCas9n变体的编码基因、转录sgRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述SpCas9n变体、所述sgRNA和所述ABE和的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑。
所述PAM序列为与所述靶点序列3′端相连的一段DNA序列。所述PAM序列中的N与所述靶点序列3′端相连。
优选地，所述的SpCas9n蛋白变体基因由序列表中SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列构成。
所述的腺嘌呤脱氨酶基因由SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列构成。
所述靶点序列的长度可为20bp。
本发明利用SpCas9n变体融合ABE的碱基编辑***在水稻中实现了更多的靶点序列中由A:T到G:C的替换，如PAM序列为NRTH的靶点序列，扩展了ABE介导的碱基替换***的编辑范围。本发明的SpCas9Tn变体融合ABE的碱基编辑***具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为pHUN411THABE载体质粒示意图。
图2为pHUN411THABE靶向突变植株中的突变形式。
具体实施方式
以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2 ；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies 等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1——pHUN411THABE重组表达载体的构建
为了拓宽可识别的目标位点，尤其是找到更多能够对缺乏G碱基的位置进行编辑的方式，本申请的尝试各种不同方向的突变，获得各种不同的突变序列，在对SpCas9n进行突变时，找到了一种能够对非G碱基进行编辑的突变序列。下面申请人将对该突变序列以及其使用过程进行详细描述。
本申请中的SpCas9n变体和ABE的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，为了构建SpCas9n变体介导的ABE编辑***，我们首先将SpCas9n蛋白的第10位氨基酸由A突变成T，产生SpCas9n变体，其序列如SEQ ID NO:1所示，SpCas9n变体在切割序列时形成单链缺口。人工合成SpCas9n变体和ABE的融合蛋白序列，并且为了进一步提高单碱基编辑***的效率，分别在ABE的5’端及SpCas9n变体的3’加上一个核定位信号NLS。融合蛋白基因命名为SpCas9TnABE，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。合成的SpCas9TnABE基因连接于PUC57-AMP载体上，两端带上NotI/SacI酶切位点，形成PUC57-AMP-SpCas9TnABE载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收SpCas9TnABE片段。用NotI/SacI酶切植物表达载体pHUN900载体并回收，由于合成的SpCas9TnABE序列两端加有NotI/SacI 酶切位点，可以利用T4连接酶将SpCas9TnABE连接到含有sgRNA表达框的pHUN900载体，得到植物表达载体pHUN411THABE，其载体图见图1。
实施例 2——打靶载体的获得
分别选择水稻Pi37基因中的核苷酸序列GACGTCAGGATATGGGTCTGCATC，Pi36基因中的核苷酸序列ATGTAATGGTATGGAGGATTATT，SPL18基因中的核苷酸序列GATTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCA（下划线部分为所述5’-NRTH-3’结构的PAM序列或反向互补序列），作为打靶位点。将靶位点序列与pHUN411THABE融合形成pHUN411THABE-Pi37、pHUN411THABE-Pi36和pHUN411THABE-SPL18。利用冻融法将这三个植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。
实施例 3——以pHUN411THABE-Pi37等为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤组织转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、***旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pHUN411THABE-Pi37等载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min，其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
按照上面的培养方式，对于pHUN411THABE-Pi37、pHUN411THABE-Pi36和pHUN411THABE-SPL18这三个打靶载体，每个载体均获得了50株植株。在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。设计3对PCR引物用于扩增靶点附近的DNA序列。其中，引物5’-TTACCTGCTGGTAATAGTCTTG-3’及5’-AAGTACATCTCGTCTAGAAGTC-3’用于扩增Pi37基因靶标附近的540bp左右的序列，引物5’-CCTCCATGAGGGCGATCAGATA-3’及5’-TTCAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3’用于扩增SPL18基因靶标附近的500bp左右的序列，引物5’-ATGGATATGAAGAAAGTGAGGT-3’及5’-CATCTCCAATCTGCGAGGAATA -3’用于扩增Pi36基因靶标附近的350bp左右的序列。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃ 45秒、56℃ 45 秒、72℃ 45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对。
比对结果表明，在pHUN411THABE-Pi37、pHUN411THABE-Pi36和pHUN411THABE-SPL18这三个打靶载体获得的植株中，所有植株都出现了不同位置的A突变成G，或T突变成C，突变效率可达100%，具体的突变率见表1，明显高于现有的ABE碱基编辑***。
在检测Pi36的靶标突变植株中，分别在第5、6、11位的A突变成G，未发现其他形式的突变方式。同样的，在pHUN411THABE-Pi37获得的植株中，分别在第2、7、12位的A突变成G，未发现其他形式的突变方式；pHUN411THABE-SPL18获得的植株中，分别在第3、5、7、9、10位的T突变成C，也未发现其他形式的突变方式（图2）。由此可见，本发明的pHUN411THABE单碱基编辑***能获得很高的单碱基突变率，而且是在非G的PAM位置附近进行靶向突变，获得突变均为A:T到G:C的替换，并未出现其他的碱基缺失、***、其他形式的碱基替换等，也即获得“干净”突变植株效率很高。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表1 pHUN411THABE获得的靶向突变植株突变类型
序列表
<110> 安徽省农业科学院水稻研究所
<120> 一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体及相应碱基编辑***
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4107
<212> DNA
<213> SpCas9Tn
<400> 1
atggacaaga agtactccat cggcctcacc atcggcacca attctgttgg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gccgtccaag aagttcaagg tcctcggcaa caccgaccgc 120
cactccatca agaagaatct catcggcgcc ctgctgttcg actctggcga gacagccgag 180
gctacaaggc tcaagaggac cgctagacgc aggtacacca ggcgcaagaa ccgcatctgc 240
tacctccaag agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300
ctcgaggaga gcttcctcgt cgaggaggac aagaagcacg agcgccatcc gatcttcggc 360
aacatcgtgg atgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctccgcaag 420
aagctcgtcg actccaccga taaggccgac ctcaggctca tctacctcgc cctcgcccac 480
atgatcaagt tcaggggcca cttcctcatc gagggcgacc tcaacccgga caactccgat 540
gtggacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600
atcaacgcct ctggcgttga cgccaaggct attctctctg ccaggctctc taagtcccgc 660
aggctcgaga atctgatcgc ccaacttccg ggcgagaaga agaatggcct cttcggcaac 720
ctgatcgccc tctctcttgg cctcaccccg aacttcaagt ccaacttcga cctcgccgag 780
gacgccaagc tccagctttc caaggacacc tacgacgacg acctcgacaa tctcctcgcc 840
cagattggcg atcagtacgc cgatctgttc ctcgccgcca agaatctctc cgacgccatc 900
ctcctcagcg acatcctcag ggtgaacacc gagatcacca aggccccact ctccgcctcc 960
atggtgaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctcacac tcctcaaggc cctcgtgaga 1020
cagcagctcc cagagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080
ggctacatcg atggcggcgc ttctcaagag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctc 1140
gagaagatgg acggcaccga ggagctgctc gtgaagctca atagagagga cctcctccgc 1200
aagcagcgca ccttcgataa tggcattatc ccgcaccaga tccacctcgg cgagcttcat 1260
gctatcctcc gcaggcaagg cgacttctac ccgttcctca aggacaaccg cgagaagatt 1320
gagaagatcc tcaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctcgccag gggcaactcc 1380
aggttcgcct ggatgaccag aaagtccgag gagacaatca ccccctggaa cttcgaggag 1440
gtggtggata agggcgcctc tgcccagtct ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500
aacctcccga acgagaaggt gctcccgaag cactcactcc tctacgagta cttcaccgtg 1560
tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggga tgaggaagcc agctttcctt 1620
agcggcgagc aaaagaaggc catcgtcgac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680
gtgaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtcgagatc 1740
tccggcgtcg aggataggtt caatgcctcc ctcgggacct accacgacct cctcaagatt 1800
atcaaggaca aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg acatcctcga ggacatcgtg 1860
ctcaccctca ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctcaa gacatacgcc 1920
cacctcttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc tgcgctatac cggctggggc 1980
aggctctcta ggaagctcat caacggcatc cgcgacaagc agtccggcaa gacgatcctc 2040
gacttcctca agtccgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctcat ccacgacgac 2100
tccctcacct tcaaggagga catccaaaag gcccaggtgt ccggccaagg cgattccctc 2160
catgaacata tcgccaatct cgccggctcc ccggctatca agaagggcat tctccagacc 2220
gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcggcc acaagccaga gaacatcgtg 2280
atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccaca cagaagggcc aaaagaactc ccgcgagcgc 2340
atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctgggctccc agatcctcaa ggagcaccca 2400
gtcgagaaca cccagctcca gaacgagaag ctctacctct actacctcca gaacggccgc 2460
gacatgtacg tggaccaaga gctggacatc aaccgcctct ccgactacga cgtggaccat 2520
attgtgccgc agtccttcct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct cacccgctcc 2580
gacaagaaca ggggcaagtc cgataacgtg ccgtccgaag aggtcgtcaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctcct caacgccaag ctcatcaccc agaggaagtt cgacaacctc 2700
accaaggccg agagaggcgg cctttccgag cttgataagg ccggcttcat caagcgccag 2760
ctcgtcgaga cacgccagat cacaaagcac gtggcccaga tcctcgactc ccgcatgaac 2820
accaagtacg acgagaacga caagctcatc cgcgaggtga aggtcatcac cctcaagtcc 2880
aagctcgtgt ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctcaat gccgtggtgg gcacagccct catcaagaag 3000
tacccaaagc tcgagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060
atgatcgcca agtccgagca agagatcggc aaggcgaccg ccaagtactt cttctactcc 3120
aacatcatga atttcttcaa gaccgagatc acgctcgcca acggcgagat taggaagagg 3180
ccgctcatcg agacaaacgg cgagacaggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240
gccacagtgc gcaaggtgct ctccatgccg caagtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtt 3300
cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctcccaaagg gcaactccga caagctgatc 3360
gcccgcaaga aggactggga cccgaagaag tatggcggct tcaactctcc gaccgtggcc 3420
tactctgtgc tcgtggttgc caaggtcgag aagggcaaga gcaagaagct caagtccgtc 3480
aaggagctgc tgggcatcac gatcatggag cgcagcagct tcgagaagaa cccaatcggc 3540
ttcctcgagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tcatcatcaa gctcccgaag 3600
tacagcctct tcgagcttga gaacggccgc aagagaatgc tcgcctctgc tagcgtgctt 3660
cataagggca acgagcttgc tctcccgtcc aagtacgtga acttcctcta cctcgcctcc 3720
cactacgaga agctcaaggg ctccagcgag gacaacaaac aaaagcagct gttcgtcgag 3780
cagcacaagc actacctcga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtg 3840
atcctcgccg atgccaacct cgataaggtg ctcagcgcct acaacaagca ccgcgataag 3900
ccaattcgcg agcaggccga gaacatcatc cacctcttca ccctcaccaa cctcggcgct 3960
agcgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcggccgca agctgtacac ctctaccaag 4020
gaggttctcg acgccaccct catccaccag tctatcacag gcctctacga gacacgcatc 4080
gacctctcac aactcggcgg cgattga 4107
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> ABE
<400> 2
atgagcgagg tggagttcag ccacgagtac tggatgaggc atgccctcac actcgcaaag 60
agggcgcgcg atgagaggga ggtgcctgtc ggcgcggtgc tcgtcctgaa caatcgcgtg 120
atcggagagg gatggaaccg ggcaattggc ctccatgacc caacagcaca tgccgagatc 180
atggccctca ggcagggcgg cctggtcatg cagaattacc ggctcattga tgccaccctc 240
tacgtgacat tcgagccatg cgtcatgtgc gcgggagcca tgatccactc acggattggc 300
agggtggtct tcggagtgag gaactcaaag cgcggcgccg cgggctctct catgaacgtg 360
ctgaattacc caggcatgaa tcatcgggtc gagatcacag agggcattct ggcggatgag 420
tgcgcagccc tcctgtgcga tttctaccgc atgcctcggc aggtcttcaa cgcccagaag 480
aaggcgcagt ccagcatcaa ttccggcggc tcatctggcg gctccagcgg cagcgagaca 540
ccaggcacat cagagtctgc gacaccggag tcatctggcg ggtcctccgg tggttcctga 600

Claims (8)

1.一种识别PAM序列为NRTH的SpCas9n变体，其特征在于，其中，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C，所述SpCas9n变体为：序列表中SEQ ID NO：1所示序列。
2.一种水稻碱基编辑***，其特征在于，所述水稻碱基编辑***包括融合蛋白和转录sgRNA的DNA分子，所述融合蛋白由SpCas9n蛋白变体和腺嘌呤脱氨酶ABE组成，所述SpCas9n蛋白变体的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，腺嘌呤脱氨酶ABE基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA靶向目标靶点序列；
所述目标靶点序列的PAM序列为NRTH，其中，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。
3.一种用于权利要求2所述的水稻碱基编辑***的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达权利要求2中所述的融合蛋白；所述表达盒二表达权利要求2中所述的sgRNA。
4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒表达权利要求2中所述的融合蛋白。
5.一种权利要求2所述的水稻碱基编辑***的应用，其特征在于：所述应用包括将权利要求2所述的碱基编辑***导入目标受体内，提高水稻基因组上为NRTH的PAM序列附近的A:T 突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
6.一种权利要求3所述的重组表达载体的应用，其特征在于：所述应用包括将权利要求3所述的重组表达载体导入目标受体内，提高水稻基因组上为NRTH的PAM序列附近的A:T 突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述目标受体为植物愈伤组织。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：导入受体的过程为经过侵染、共培养、筛选步骤来实现，进而得到编辑后的植物愈伤组织，然后利用愈伤组织分化成植株。
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