CN113252821A - 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 - Google Patents
一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113252821A CN113252821A CN202110540716.0A CN202110540716A CN113252821A CN 113252821 A CN113252821 A CN 113252821A CN 202110540716 A CN202110540716 A CN 202110540716A CN 113252821 A CN113252821 A CN 113252821A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- absorption peak
- retention time
- relative retention
- percent
- peak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明提供一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱建立方法以及通过该方法建立的指纹图谱。所述指纹图谱建立方法包括以水仙苷为参照，采用高效液相色谱法检测银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的相对保留时间和/或相对峰面积。所述指纹图谱包括23个共有峰。本发明还提供上述指纹图谱建立方法和/或建立的指纹图谱在在银杏叶提取中间体和/或其制剂的真伪鉴别和成分检测中的应用。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和药物质量控制领域，具体涉及一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶,性甘、苦、涩、平,归心、肺经，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛等作用。银杏叶提取中间体为银杏叶经加工制成的提取物/液,被广泛应用于药物、保健品、食品添加剂、功能性饮料、化妆品等领域，是现代科学技术开发的植物药中最成功的案例之一。舒血宁注射液是由银杏叶提取中间体经加工制成的灭菌水溶液，用于缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑梗死及脑血管痉挛等。
黄酮类成分是银杏叶提取中间体及其制剂中的最重要的活性成分之一。目前从银杏叶中分离的黄酮类化合物有40种。为了更好地控制银杏叶提取中间体及其制剂的质量，保证临床疗效和用药安全，需要建立能够客观全面反映真实世界银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类化合物含量及分布的方法。指纹图谱是一种综合的、可量化的质量检测手段，主要用于评价植物药(包括中药材)及其制剂质量的真实性、优良性和稳定性。现有技术中已经出现了建立银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的方法。如中国发明专利申请CN110824072A(公开日2020年2月21日)公开了一种基于高效液相色谱构建银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的方法；其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.05-0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，紫外检测波长为265nm，柱温25-40℃，流速0.2-0.45ml/min。该方法以芦丁的色谱峰为参照峰，共标定了36个特征峰，其中18个峰归属为黄酮类成分，3个峰归属为木脂素类成分，1个峰归属为酚酸，其余14个特征峰未进行归属。因此，该专利申请文件公开的指纹图谱并没有真实全面反映出银杏叶提取物或其制剂的黄酮类成分。此外，该方法检测时间约为35分钟(全部出峰)，加上柱平衡时间，检测一个样品总耗时将近50分钟。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱建立方法以及所建立的指纹图谱在银杏叶提取中间体或其制剂质量控制上的应用。本发明提供的基于UPLC-UV的方法，建立了银杏叶提取中间体或其制剂指纹图谱共有模式，标定了23个共有峰，全部为黄酮类化合物，其中22个峰确定了化学成分归属。经检测，10批样品与共有模式之间相似度均大于0.9。本发明的检测时间仅为25分钟(所有23个色谱峰全部出峰)。本发明在节省检测时间、有利于生产操作的同时，提高了银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的质量控制，从而能够更好地评价产品的均一性和稳定性。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱建立方法，包括以水仙苷为参照，采用高效液相色谱法检测银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的相对保留时间和相对峰面积，其中所述高效液相色谱的条件如下：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.23～0.26ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度洗脱：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
柱温为30℃～38℃；
紫外检测波长为360nm；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
以水仙苷色谱峰为参照，共有峰包括：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143。
优选地，所述流速为0.25ml/min。
优选地，所述柱温为35℃。
优选地，所述银杏叶提取中间体通过如下方法制备：
取银杏叶，用乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，调pH值，回收乙醇并浓缩至适量，加水稀释，调pH值，滤液经大孔吸附树脂吸附纯化处理，洗脱液回收乙醇，制成银杏叶提取中间体。
所述银杏叶提取中间体可以是固体，也可以是液体。
所述银杏叶提取中间体选自银杏叶对照提取物、银杏叶提取物和银杏叶提取溶液中的一种。
其中，所述银杏叶对照提取物是指系供中国药典银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊、银杏叶滴丸项下鉴别用的对照提取物，由中国食品药品检定研究院制备，可以通过公开的商业渠道获得。
优选地，所述银杏叶制剂为舒血宁注射液。
优选地，所述指纹图谱的建立方法还包括通过以下方法制备供试品溶液：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述银杏叶提取中间体供试品的制备中，总黄酮醇苷的含量按照《舒血宁注射液国家药品标准》(标准号WS3-B-3707-98-2004-2012)规定的方法测定。
优选地，所述指纹图谱的建立方法还包括参照物溶液的制备，具体操作为：
取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得。
作为一个优选的实施方式，本发明提供所述银杏叶提取中间体和/或舒血宁注射液中黄酮类成分的指纹图谱建立方法，具体的操作步骤包括：
1)参照物溶液的制备：取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得；
2)供试品溶液的制备：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；和/或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1～2μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录25min内的色谱图，得到指纹图谱：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相：由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.25ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度洗脱：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
柱温：35℃；
紫外检测波长为360nm；
4)共有峰的标定：以水仙苷吸收峰为参照峰，共有峰23个，相对保留时间为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143。
上述共有峰的化学归属为：
1号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
2号吸收峰：杨梅素-3-O-芸香糖苷；槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
3号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
4号吸收峰：异鼠李素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
5号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
6号吸收峰：芦丁，
8号吸收峰：3'-甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
9号吸收峰：异槲皮苷，
10号吸收峰：槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
11号吸收峰：山柰酚-3-O-芸香糖苷，
12号吸收峰：水仙苷，
13号吸收峰：丁香亭-3-O-芸香糖苷，
14号吸收峰：紫云英苷，
15号吸收峰：槲皮苷，
16号吸收峰：异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和3',4'-二甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
17号吸收峰：大波斯菊苷，
18号吸收峰：山柰酚-3-O-(2”-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
19号吸收峰：金圣草素-7-O-葡萄糖苷，
20号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
21号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
22号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
23号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷和Biginkgoside A。
本发明的另一个目的在于提供按照上述方法建立的银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱。
优选地，所述银杏叶提取中间体通过如下方法制备：
取银杏叶，用乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，调pH值，回收乙醇并浓缩至适量，加水稀释，调pH值，滤液经大孔吸附树脂吸附纯化处理，洗脱液回收乙醇，制成银杏叶提取中间体。
所述银杏叶提取中间体可以是固体，也可以是液体。
所述银杏叶提取中间体选自银杏叶对照提取物、银杏叶提取物和银杏叶提取溶液中的一种。
其中，所述银杏叶对照提取物是指系供中国药典银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶胶囊、银杏叶滴丸项下鉴别用的对照提取物，由中国食品药品检定研究院制备，可以通过公开的商业渠道获得。
优选地，所述银杏叶提取中间体制剂为舒血宁注射液。
优选地，所述指纹图谱包括23个共有特征峰，以水仙苷吸收峰为参照，所述共有特征峰的相对保留时间和峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积分别为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，相对峰面积0.685±0.281，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，相对峰面积1.212±0.441，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，相对峰面积0.657±0.505，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，相对峰面积1.089±0.085，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，相对峰面积0.837±0.421，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，相对峰面积0.928±0.724，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，相对峰面积0.669±0.461，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143。
上述共有峰的化学归属为：
1号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
2号吸收峰：杨梅素-3-O-芸香糖苷；槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
3号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
4号吸收峰：异鼠李素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
5号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
6号吸收峰：芦丁，
8号吸收峰：3'-甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
9号吸收峰：异槲皮苷，
10号吸收峰：槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
11号吸收峰：山柰酚-3-O-芸香糖苷，
12号吸收峰：水仙苷，
13号吸收峰：丁香亭-3-O-芸香糖苷，
14号吸收峰：紫云英苷，
15号吸收峰：槲皮苷，
16号吸收峰：异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和3',4'-二甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
17号吸收峰：大波斯菊苷，
18号吸收峰：山柰酚-3-O-(2”-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
19号吸收峰：金圣草素-7-O-葡萄糖苷，
20号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
21号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
22号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
23号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6”-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷和Biginkgoside A。
本发明还有一个目的在于提供上述指纹图谱建立方法和/或所建立的指纹图谱在银杏叶提取中间体和/或其制剂的真伪鉴别和成分检测中的应用。
优选的，所述银杏叶提取中间体制剂为舒血宁注射液。
作为一个优选的实施方案，所述应用包括如下步骤：
1)参照物溶液的制备：取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得；
2)对照提取物溶液的制备：取银杏叶对照提取物适量，精密称定，加50％甲醇适量，超声处理10分钟，制成每1ml含0.7mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；
3)供试品溶液的制备：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；和/或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
4)测定：分别精密吸取参照物溶液、对照提取物溶液与供试品溶液各1～2μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录25min内的色谱图，得到指纹图谱：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相：由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.25ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度洗脱：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
柱温：35℃；
紫外检测波长为360nm；
5)共有峰的标定：以水仙苷吸收峰为参照峰，共有峰23个，相对保留时间为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143；
6)将供试品溶液的指纹图谱与对照提取物溶液的指纹图谱比对，经中药色谱指纹图谱相似度评价***软件计算，相似度不低于0.90。
本发明提供的指纹图谱建立方法，以UPLC和紫外光谱联用为分离和鉴别手段，检测时长仅25分钟，得到的指纹图谱标定出23个共有特征峰，均为黄酮类成分，其中22个确定了化学成分归属。因此，本发明的方法建立的指纹图谱更有特征性，能够更***性地体现银杏叶提取中间体或其制剂的黄酮类成分的分布和含量。
银杏叶提取中间体和舒血宁注射液中含有木脂素类成分，该类成分在265nm(CN110824072A披露的检测波长)处有紫外吸收，因此以该波长为检测波长，木脂素类成分会对黄酮类成分造成干扰。通过研究，发明人发现银杏叶提取中间体或其制剂的黄酮类成分在360nm波长附近呈最大吸收，木脂素类成分则没有吸收。所以，本发明的方法避免了木脂素成分对黄酮类成分指纹图谱检测的影响，保证了黄酮类成分指纹图谱检测的专属性，提高了黄酮类成分质量的控制水平。
CN110824072A披露以芦丁吸收峰为参照峰。但是芦丁出峰时间较早，距离芦丁越远的色谱峰的相对保留时间偏差越大，影响共有峰的识别。本发明提供的指纹图谱建立方法，以水仙苷为参照峰，其保留时间居中，峰面积较大，其他共有特征峰与其比较，不同批次之间相对保留时间偏差小，共有特征峰识别更准确。
另外，本发明所述方法建立的所述银杏叶提取中间体或其制剂的指纹图谱，特征峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高(与对照图谱的相似度均大于0.9)，准确可靠。
本发明所述方法对供试品溶液的制备、色谱条件、测定过程、数据采集、处理、分析等都做了详细限定，从而保证不同操作者、不同实验室重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内，体现了所述方法的通用性、实用性和重现性。特别的，以本发明所述方法建立的所述银杏叶提取中间体或舒血宁注射液的指纹图谱中，10批样品的所有共有特征峰相对保留时间的RSD＜3.0％，峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积RSD小于3.0％。
本发明提供的方法建立的银杏叶提取中间体或舒血宁注射液的指纹图谱，能有效地表征银杏叶提取中间体或舒血宁注射液中的黄酮类成分，有利于全面监控产品的质量，更好地保障患者用药安全和治疗效果。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中松脂醇二葡萄糖苷(A)和槲皮素(B)的紫外全波长扫描图。
图2为实施例2中考察色谱柱试验的色谱图，其中，
上方的A：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm，1.8μm)；
中间的B：色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18色谱柱C18(2.1×100mm，1.7μm)；
下方的C：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(2.1×150mm，1.7μm)。
图3为实施例3中考察不同流动相的色谱图，其中：
上方的A：流动相为乙腈-水；
下方的B：流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液。
图4为实施例4中考察不同洗脱程序的色谱图，其中：
上方的A：梯度洗脱程序1；
中间的B：梯度洗脱程序2；
中间的C：梯度洗脱程序3；
中间的D：梯度洗脱程序4；
下方的E：梯度洗脱程序5。
图5为实施例5中考察供试品不同浓度的色谱图，其中：
上方的A：舒血宁注射液未经稀释；
中间的B：舒血宁注射液用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至2倍体积；
下方的C：舒血宁注射液用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至5倍体积。
图6为实施例6中生成的舒血宁黄酮类成分指纹图谱，图中的标号1-23为共有特征色谱峰的标号。
图7为实施例6中20批样品匹配后的色谱图。
图8为实施例7中生成的银杏叶提取中间体黄酮类指纹图谱，图中的标号1-23为共有特征色谱峰的标号。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
其中，部分试剂和仪器购买情况如下：
1.1仪器
Thermo Scientific VanquishTM Flex二元超高效液相色谱仪(WatersCorporation，美国)；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(3.0×150mm，1.8μm)，Waters ACQUITYBEH C18色谱柱C18(2.1×100mm，1.7μm)，Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(2.1×150mm，1.7μm)；
Mettler Toledo MS105电子分析天平(Mettler Toledo,瑞士)；Milli-QAdvantange A10纯水机(Millipore,美国)；KQ-250DE超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试剂
乙腈(色谱纯，Admas，中国)；甲醇(色谱纯，Admas，中国)；甲酸(LC-MS级，FisherScientific，美国)。
1.3对照品
山梨醇(批号101109-201402)、芦丁(批号100080-201811)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号112007-201602)、水仙苷(批号111997-201501)、松脂醇二葡萄糖苷(批号111537-201706)、银杏叶提取物(批号110866-201905)对照品购于中国食品药品检定研究院。槲皮苷、异槲皮苷、紫云英苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，其余对照品由上海医药工业研究院提供，HPLC纯度均在94.0％以上。
1.4供试品
舒血宁注射液(批号A05200509、A05200511、A05200512、A05200513、A05200518、ZSA20190904、ZSA20190912、ZSA20190914、ZSA20190918、ZSA20190920)由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产。
银杏叶提取中间体(批号：G13200403)由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产。
实施例1检测波长的选择
对银杏叶提取中间体中木脂素类成分的代表松脂醇二葡萄糖苷和黄酮类成分的代表槲皮素UV全波长扫描，图谱见图1。
槲皮素对照品溶液制备：精密称定槲皮素对照品适量，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释成每1ml含0.012mg的溶液，摇匀，即得。
松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液的制备：精密称定松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释成每1ml含44.6μg的溶液，摇匀，即得。
从图1可知，黄酮类成分在360nm附近呈特征最大吸收波长(见图1下方的B)；木脂素类成分在360nm下没有吸收，在265nm处有吸收(见图1上方的A)，因此选用360nm作为检测波长，不受木脂素类成分干扰，灵敏度高，专属性强。
实施例2色谱柱的选择
供试品制备：精密量取舒血宁注射液2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以乙腈为A相，0.1％(v/v)甲酸水溶液为B相，梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序(体积百分比)
| 时间(min) | 乙腈(％) | 0.1％甲酸水溶液(％) |
| 0 | 18 | 82 |
| 12 | 21 | 79 |
| 15 | 25 | 75 |
| 25 | 35 | 65 |
流速0.25ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：360nm；
进样量：1μl。
(1)色谱柱1
型号：Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm，1.8μm)。
色谱图见图2的A。
(2)色谱柱2
型号：Waters ACQUITY BEH C18色谱柱C18(2.1×100mm，1.7μm)。
色谱图见图2的B。
(3)色谱柱3
型号：Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(2.1×150mm，1.7μm)。
色谱图见图2的C。
结论：
黄酮类化合物极性相近，若使用100mm长色谱柱，则各化合物出峰时间早，分离效果差(见图2中间的B)；因此宜使用150mm长的色谱柱。比较图2中的A和C两张色谱图，A图保留时间12min之前的色谱峰分离效果最佳，因此采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm，1.8μm)色谱柱。
实施例3流动相的选择
按照实施例2的方法制备供试品溶液，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm，1.8μm)，除流动相外的其他色谱条件同实施例2。
(1)流动相：乙腈-水
梯度洗脱程序见表2。
表2乙腈-水梯度洗脱程序(体积百分比)
| 时间(min) | 乙腈(％) | 水(％) |
| 0 | 18 | 82 |
| 12 | 21 | 79 |
| 15 | 25 | 75 |
| 25 | 35 | 65 |
色谱图见图3上方的A。
(2)流动相甲醇-水
使用甲醇-水流动相，***压力大，接近色谱柱最大承受压力，故不宜使用甲醇-水作为流动相。
(3)流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液
梯度洗脱程序见表1。色谱图见图3下方的B。
结论：
比较图3中的两张图谱，采用乙腈-0.1％甲酸水体系UPLC法测定黄酮指纹图谱，各色谱峰峰形好，分离效果佳，尤其是对保留时间21min以后的成分的分离。
实施例4梯度洗脱程序的选择
在实施例1～3的基础上，对流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液的梯度洗脱程序进行考察。
(1)梯度程序1
| 时间(min) | 乙腈(％) | 0.1％甲酸水溶液(％) |
| 0 | 18 | 82 |
| 20 | 23 | 77 |
| 30 | 45 | 55 |
色谱图见图4上方的A。
(2)梯度洗脱程序2
色谱图见图4中间的B。
(3)梯度洗脱程序3
| 时间(min) | 乙腈(％) | 0.1％甲酸水溶液(％) |
| 0 | 18 | 82 |
| 15 | 21 | 79 |
| 18 | 30 | 70 |
| 25 | 40 | 60 |
色谱图见图4中间的C。
(4)梯度洗脱程序4
| 时间(min) | 乙腈(％) | 0.1％甲酸水溶液(％) |
| 0 | 17 | 83 |
| 25 | 25 | 75 |
| 30 | 45 | 65 |
色谱图见图4中间的D。
(5)梯度洗脱程序5
| 时间(min) | 乙腈(％) | 0.1％甲酸水溶液(％) |
| 0 | 18 | 82 |
| 12 | 21 | 79 |
| 15 | 25 | 75 |
| 25 | 35 | 65 |
色谱图见图4下方的E。
结论：
比较图4中的A～E的色谱图，梯度洗脱程序5得到的色谱图E分离时间短，所有色谱峰分离效果最佳。
实施例5舒血宁注射液供试品浓度的选择
采用如下色谱条件，对舒血宁注射液供试品浓度进行考察：
色谱柱：Agilent SB-C18(3.0×150mm，1.8μm)；
柱温：40℃；
流动相：乙腈-水；程序洗脱程序见表3；
表3实施例5所用流动相洗脱程序
流速：0.35ml/min；
检测波长：360nm。
(1)浓度1：注射液不经稀释，直接进样
色谱图见图5上方的A。
(2)浓度2：注射液用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至2倍体积
色谱图见图5中间的B。
(3)浓度3：注射液用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至5倍体积
色谱图见图5下方的C。
结论
舒血宁注射液中黄酮类化合物的响应高，可将舒血宁注射液稀释至5倍后测定，这样可以减少对色谱柱的污染，延长色谱柱的寿命。
实施例6方法学验证
色谱条件和***适应性：
色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18 3.0mm×150mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相B，按实施例4确定的洗脱程序进行梯度洗脱；流速每分钟为0.25ml；检测波长为360nm；柱温35℃。理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000。
参照物溶液制备：
取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇适量，置热水浴(70～80℃)溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度。精密吸取适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得。
对照提取物溶液制备：取银杏叶对照提取物适量，精密称定，加50％甲醇适量，超声处理10分钟，制成每1ml含0.7mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。
供试品溶液制备：
精密量取舒血宁注射液2ml，置10ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照提取物溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录25分钟内的色谱峰，即得。
生成的指纹图谱见图6。
I.***适用性
精密吸取参照物溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，理论板数按水仙苷峰计算应不低于20000；分离度应大于1.5。
II.精密度
II-1重复性
分别制备6份舒血宁注射液供试品溶液(批号ZSA20190920)，分别精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，以水仙苷(峰12)为参照，计算23个共有峰的相对保留时间，峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积。结果显示，23个共有峰的相对保留时间RSD小于3.0％，峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积RSD小于3.0％，说明方法的重复性良好。结果见表4和表5，
表4相对保留时间考察(重复性)
表5相对峰面积考察(重复性)
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 平均值 | RSD |
| 3 | 0.543 | 0.552 | 0.551 | 0.553 | 0.553 | 0.545 | 0.549 | 0.78％ |
| 10 | 0.430 | 0.418 | 0.419 | 0.421 | 0.420 | 0.450 | 0.426 | 2.90％ |
| 18 | 0.578 | 0.562 | 0.569 | 0.560 | 0.566 | 0.579 | 0.569 | 1.44％ |
| 20 | 0.520 | 0.505 | 0.516 | 0.507 | 0.510 | 0.527 | 0.514 | 1.64％ |
| 21 | 0.384 | 0.376 | 0.377 | 0.374 | 0.373 | 0.382 | 0.378 | 1.17％ |
| 6 | 1.044 | 1.021 | 1.052 | 1.057 | 1.057 | 1.044 | 1.046 | 1.28％ |
| 11 | 1.104 | 1.105 | 1.105 | 1.097 | 1.103 | 1.110 | 1.104 | 0.38％ |
| 12 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00％ |
II-2.仪器精密度
精密吸取舒血宁注射液供试品溶液(批号ZSA20190920)，注入超高效液相色谱仪，连续测定6次。以水仙苷(峰12)为参照，计算23个共有峰的相对保留时间，峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰。结果显示，23个共有峰的相对保留时间RSD小于3.0％，峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积RSD小于3.0％，说明方法的精密度良好。结果表6和表7。
表6相对保留时间考察(仪器精密度)
表7相对峰面积考察(仪器精密度)
| 峰号 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 平均值 | RSD |
| 3 | 0.557 | 0.555 | 0.553 | 0.551 | 0.554 | 0.555 | 0.554 | 0.37％ |
| 10 | 0.428 | 0.409 | 0.426 | 0.440 | 0.432 | 0.417 | 0.425 | 2.61％ |
| 18 | 0.568 | 0.564 | 0.564 | 0.563 | 0.570 | 0.566 | 0.566 | 0.48％ |
| 20 | 0.500 | 0.495 | 0.500 | 0.498 | 0.501 | 0.507 | 0.500 | 0.77％ |
| 21 | 0.376 | 0.374 | 0.373 | 0.374 | 0.375 | 0.375 | 0.375 | 0.30％ |
| 6 | 1.023 | 1.022 | 1.002 | 1.025 | 1.033 | 1.015 | 1.020 | 1.03％ |
| 11 | 1.108 | 1.100 | 1.094 | 1.095 | 1.100 | 1.104 | 1.100 | 0.49％ |
| 12 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00％ |
II-3.稳定性
取批号为ZSA20190920的舒血宁注射液按供试品制备方法制备，分别考察供试品溶液在0、2、4、8、12、18、24小时23个共有峰以水仙苷为参照(峰12，S)下的相对保留时间和峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积。结果见表8和表9。
表8相对保留时间考察(稳定性)
表9相对峰面积考察(稳定性)
| 峰号 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 18h | 24h | 均值 | RSD |
| 3 | 0.557 | 0.554 | 0.555 | 0.553 | 0.549 | 0.548 | 0.549 | 0.489 | 0.64％ |
| 10 | 0.428 | 0.432 | 0.419 | 0.420 | 0.427 | 0.427 | 0.426 | 0.496 | 0.96％ |
| 18 | 0.568 | 0.570 | 0.565 | 0.566 | 0.560 | 0.566 | 0.560 | 0.539 | 0.70％ |
| 20 | 0.500 | 0.501 | 0.512 | 0.510 | 0.525 | 0.521 | 0.518 | 0.443 | 2.17％ |
| 21 | 0.376 | 0.375 | 0.376 | 0.373 | 0.373 | 0.371 | 0.371 | 0.709 | 0.33％ |
| 6 | 1.023 | 1.033 | 1.040 | 1.057 | 1.058 | 1.052 | 1.054 | 1.074 | 1.25％ |
| 11 | 1.114 | 1.100 | 1.105 | 1.103 | 1.100 | 1.099 | 1.098 | 1.052 | 0.52％ |
| 12 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00％ |
II-4.耐用性
分别考察供试品溶液(批号ZSA20190920)在微调柱温(33-40℃)、流速(0.23-0.26ml/min)、有机相比例(17.8-18.2％乙腈)和不同检测波长(360nm±2nm)时，23个共有峰的相对保留时间和峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积RSD小于3.0％，说明该方法的耐用性良好。。
II-5.峰归属
通过LC/HRMS和NMR定性鉴定出指纹图谱中的黄酮类化合物成分，然后采用对照品比对保留时间的方式加以确证。最终，对23个共有峰中的22个进行了归属。具体见表10。
表10共有峰归属
II-6.相似度评价
测定20批舒血宁注射液，并以对照提取物的指纹图谱为对照，经中药色谱指纹图谱相似度评价***软件计算相似度。结果显示，20批舒血宁注射液与对照提取物相似度均大于0.9。结果见图7和表11。
表11 20批舒血宁注射液指纹图谱相似度计算结果
实施例7银杏叶提取中间体黄酮类成分的指纹图谱建立
色谱条件和***适应性：同实施例6。
参照物溶液制备：同实施例6。
对照提取物制备：同实施例6。
供试品溶液制备：
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取稀释液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：同实施例6。
生成的指纹图谱见图8。经中药色谱指纹图谱相似度评价***软件计算相似度。结果显示，该批银杏叶提取中间体与对照提取物相似度为0.984。
Claims (10)
1.一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱建立方法，包括以水仙苷为参照，采用高效液相色谱法检测银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的相对保留时间和/或相对峰面积，其中所述高效液相色谱的条件如下：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.23～0.26ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度洗脱：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
柱温为30℃～38℃；
紫外检测波长为360nm；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
以水仙苷色谱峰为参照，共有峰包括：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述流速为0.25ml/min；
优选地，所述柱温为35℃。
3.根据权利要求1或2所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述银杏叶提取中间体通过如下方法制备：
取银杏叶，用乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，调pH值，回收乙醇并浓缩至适量，加水稀释，调pH值，滤液经大孔吸附树脂吸附纯化处理，洗脱液回收乙醇，制成银杏叶提取中间体；
所述银杏叶提取中间体可以是固体，也可以是液体；
所述银杏叶提取中间体选自银杏叶对照提取物、银杏叶提取物和银杏叶提取溶液中的一种；
优选地，所述银杏叶制剂为舒血宁注射液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的建立方法还包括通过以下方法制备供试品溶液：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱的建立方法还包括参照物溶液的制备，具体操作为：
取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得。
6.一种银杏叶提取中间体和/或舒血宁注射液中黄酮类成分的指纹图谱建立方法，具体的操作步骤包括：
1)参照物溶液的制备：取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得；
2)供试品溶液的制备：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；和/或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1～2μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录25min内的色谱图，得到指纹图谱：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相：由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.25ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度洗脱：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
柱温：35℃；
紫外检测波长为360nm；
4)共有峰的标定：以水仙苷吸收峰为参照峰，共有峰23个，相对保留时间为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143。
7.根据权利要求1或6所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述共有峰的化学归属为：
1号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
2号吸收峰：杨梅素-3-O-芸香糖苷；槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
3号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
4号吸收峰：异鼠李素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
5号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
6号吸收峰：芦丁，
8号吸收峰：3'-甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
9号吸收峰：异槲皮苷，
10号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
11号吸收峰：山柰酚-3-O-芸香糖苷，
12号吸收峰：水仙苷，
13号吸收峰：丁香亭-3-O-芸香糖苷，
14号吸收峰：紫云英苷，
15号吸收峰：槲皮苷，
16号吸收峰：异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和3',4'-二甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，17号吸收峰：大波斯菊苷，
18号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
19号吸收峰：金圣草素-7-O-葡萄糖苷，
20号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
21号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
22号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
23号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷和Biginkgoside A。
8.权利要求1至7中任一项所述指纹图谱建立方法建立的银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分的指纹图谱；
优选地，所述银杏叶提取中间体通过如下方法制备：
取银杏叶，用乙醇溶液加热回流提取，合并提取液，调pH值，回收乙醇并浓缩至适量，加水稀释，调pH值，滤液经大孔吸附树脂吸附纯化处理，洗脱液回收乙醇，制成银杏叶提取中间体；
所述银杏叶提取中间体可以是固体，也可以是液体；
所述银杏叶提取中间体选自银杏叶对照提取物、银杏叶提取物和银杏叶提取溶液中的一种；
优选地，所述银杏叶提取中间体制剂为舒血宁注射液。
9.根据权利要求8所述的指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱包括23个共有特征峰，以水仙苷吸收峰为参照，所述共有特征峰的相对保留时间和峰面积大于总峰面积5％以上色谱峰的相对峰面积分别为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，相对峰面积0.685±0.281，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，相对峰面积1.212±0.441，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，相对峰面积0.657±0.505，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，相对峰面积1.089±0.085，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，相对峰面积0.837±0.421，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，相对峰面积0.928±0.724，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，相对峰面积0.669±0.461，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143；
所述共有峰的化学归属为：
1号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
2号吸收峰：杨梅素-3-O-芸香糖苷；槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
3号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
4号吸收峰：异鼠李素-3-O-(2″,6″-a-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖苷，
5号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖]-7-O-β-D-葡萄糖苷，
6号吸收峰：芦丁，
8号吸收峰：3'-甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，
9号吸收峰：异槲皮苷，
10号吸收峰：槲皮素-3-O-(2″-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
11号吸收峰：山柰酚-3-O-芸香糖苷，
12号吸收峰：水仙苷，
13号吸收峰：丁香亭-3-O-芸香糖苷，
14号吸收峰：紫云英苷，
15号吸收峰：槲皮苷，
16号吸收峰：异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和3',4'-二甲醚-杨梅素-3-O-芸香糖苷，17号吸收峰：大波斯菊苷，
18号吸收峰：山柰酚-3-O-(2″-β-D-葡萄糖基)-a-L-鼠李糖苷，
19号吸收峰：金圣草素-7-O-葡萄糖苷，
20号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
21号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-反式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
22号吸收峰：槲皮素-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷，
23号吸收峰：山柰酚-3-O-[2'-O-(6″-O-对羟基-顺式-香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-鼠李糖苷和Biginkgoside A。
10.权利要求1至7中任一项所述指纹图谱建立方法和权利要求8或9所述的指纹图谱在银杏叶提取中间体和/或其制剂的真伪鉴别和成分检测中的应用；
优选地，所述银杏叶提取中间体制剂为舒血宁注射液；
优选地，所述应用包括如下步骤：
1)参照物溶液的制备：取水仙苷对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇水溶液适量，置70～80℃热水浴至完全溶解，冷至室温，转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，得到储备液；精密吸取储备液适量，加50％甲醇制成每1ml含水仙苷20μg的溶液，即得；
2)对照提取物溶液的制备：取银杏叶对照提取物适量，精密称定，加50％甲醇适量，超声处理10分钟，制成每1ml含0.7mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；
3)供试品溶液的制备：
银杏叶提取中间体供试品的制备
取本品适量加水制备成每1ml含总黄酮醇苷1.0mg的溶液，精密量取所述溶液2.0ml置10ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；和/或
舒血宁注射液供试品的制备
精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用50％(v/v)甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
4)测定：分别精密吸取参照物溶液、对照提取物溶液与供试品溶液各1～2μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录25min内的色谱图，得到指纹图谱：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格3.0mm×150mm，固定相粒径1.8μm；
流动相：由A和B两相组成，其中A相为乙腈，B相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流速0.25ml/min，0～25min按照如下程序进行梯度：
0～12min，按照体积百分比，A:B＝18％:82％匀速地变化为A:B＝21％:79％，
12～15min，按照体积百分比，A:B＝21％:79％匀速地变化为A:B＝25％:75％，
15～25min，按照体积百分比，A:B＝25％:75％匀速地变化为A:B＝35％:65％；
理论塔板数按水仙苷峰计算不应低于20000；
柱温：35℃；
紫外检测波长为360nm；
5)共有峰的标定：以水仙苷吸收峰为参照峰，共有峰23个，相对保留时间为：
1号吸收峰：相对保留时间0.400±0.004，
2号吸收峰：相对保留时间0.446±0.007，
3号吸收峰：相对保留时间0.519±0.008，
4号吸收峰：相对保留时间0.538±0.009，
5号吸收峰：相对保留时间0.573±0.016，
6号吸收峰：相对保留时间0.644±0.007，
7号吸收峰：相对保留时间0.669±0.008，
8号吸收峰：相对保留时间0.689±0.010，
9号吸收峰：相对保留时间0.778±0.005，
10号吸收峰：相对保留时间0.874±0.006，
11号吸收峰：相对保留时间0.925±0.006，
12号吸收峰：相对保留时间1.000，
13号吸收峰：相对保留时间1.030±0.008，
14号吸收峰：相对保留时间1.093±0.013，
15号吸收峰：相对保留时间1.134±0.025，
16号吸收峰：相对保留时间1.180±0.024，
17号吸收峰：相对保留时间1.222±0.025，
18号吸收峰：相对保留时间1.255±0.015，
19号吸收峰：相对保留时间1.356±0.029，
20号吸收峰：相对保留时间1.553±0.064，
21号吸收峰：相对保留时间1.764±0.090，
22号吸收峰：相对保留时间1.805±0.110，
23号吸收峰：相对保留时间2.004±0.143；
6)将供试品溶液的指纹图谱与对照提取物溶液的指纹图谱比对，经中药色谱指纹图谱相似度评价***软件计算，相似度不低于0.90。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110540716.0A CN113252821B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110540716.0A CN113252821B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113252821A true CN113252821A (zh) | 2021-08-13 |
| CN113252821B CN113252821B (zh) | 2023-05-16 |
Family
ID=77182556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110540716.0A Active CN113252821B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113252821B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113899840A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-01-07 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 一种银杏叶提取中间体或银杏叶制剂的木脂素类成分指纹图谱的建立方法及其应用 |
| CN114166980A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-03-11 | 山西振东泰盛制药有限公司 | 银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法 |
| CN114264624A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-01 | 山西振东泰盛制药有限公司 | 一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中总木脂素含量测定的方法 |
| CN114791468A (zh) * | 2022-04-19 | 2022-07-26 | 四川新绿色药业科技发展有限公司 | 一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107884483A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-04-06 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途 |
| CN110824072A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-02-21 | 神威药业集团有限公司 | 一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法 |
| WO2020037737A1 (zh) * | 2018-08-20 | 2020-02-27 | 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 | 一种银杏酮酯及其制备方法 |
-
2021
- 2021-05-18 CN CN202110540716.0A patent/CN113252821B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107884483A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-04-06 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途 |
| WO2020037737A1 (zh) * | 2018-08-20 | 2020-02-27 | 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 | 一种银杏酮酯及其制备方法 |
| CN110824072A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-02-21 | 神威药业集团有限公司 | 一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 梁文琳等: "含量测定和指纹图谱结合LC-MS技术整体评价银杏叶片的质量", 《中国中药杂志》 * |
| 王亚妮等: "银杏叶片UPLC指纹图谱检测方法的建立及其在质量控制中的应用", 《药物分析杂志》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113899840A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-01-07 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 一种银杏叶提取中间体或银杏叶制剂的木脂素类成分指纹图谱的建立方法及其应用 |
| CN114166980A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-03-11 | 山西振东泰盛制药有限公司 | 银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法 |
| CN114264624A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-01 | 山西振东泰盛制药有限公司 | 一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中总木脂素含量测定的方法 |
| CN114791468A (zh) * | 2022-04-19 | 2022-07-26 | 四川新绿色药业科技发展有限公司 | 一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法 |
| CN114791468B (zh) * | 2022-04-19 | 2023-10-24 | 四川新绿色药业科技发展有限公司 | 一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113252821B (zh) | 2023-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113252821B (zh) | 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 | |
| CN108279278B (zh) | 一种分离黄酮类成分的方法及其应用 | |
| CN113049700A (zh) | 五味消毒饮的指纹图谱检测方法 | |
| CN109521103B (zh) | 一种兼具定性与定量评价的三勒浆口服液质量检测方法 | |
| CN111487344B (zh) | 益母草颗粒指纹图谱的检测方法 | |
| CN112730674B (zh) | 一种罗汉茶的质量检测方法 | |
| CN116087392A (zh) | 枳术颗粒指纹图谱及含量测定的检测方法 | |
| CN113655165B (zh) | 产后康膏的指纹图谱检测方法 | |
| CN113341007B (zh) | 一种基于hplc特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法 | |
| CN111896637A (zh) | 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法 | |
| CN113899840B (zh) | 一种银杏叶提取中间体或银杏叶制剂的木脂素类成分指纹图谱的建立方法及其应用 | |
| CN111830150B (zh) | 一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法及其应用 | |
| CN116626199B (zh) | 安宫牛黄丸中10种成分的含量测定方法 | |
| CN113219095B (zh) | 腹可安片剂指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 | |
| CN111474276B (zh) | 一种健阳片制剂的质量控制方法 | |
| CN113899841B (zh) | 银杏叶提取中间体或其制剂中松脂醇二葡萄糖苷的检测方法 | |
| CN116660408B (zh) | 一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法和应用 | |
| CN114252521B (zh) | 中药半边莲指纹图谱的检测方法 | |
| CN117347532B (zh) | 归知糖疽颗粒制剂的hplc特征图谱的检测方法 | |
| CN116539750A (zh) | 一种谷精草及其制剂中香草酸含量的测定方法 | |
| CN117368372A (zh) | 海龙蛤蚧口服液的质量检测方法 | |
| CN118191141A (zh) | 一种用于治疗***及其相关疾病的中药中蒙花苷含量的高效液相色谱检测方法 | |
| CN115372516A (zh) | 一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法 | |
| CN114527218A (zh) | 一种检测黄芩成分的方法 | |
| CN115060812A (zh) | 一种炒山楂药物制剂的指纹图谱及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |