CN113655165B - 产后康膏的指纹图谱检测方法 - Google Patents

产后康膏的指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

一种产后康膏的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：步骤1、制备产后康膏供试品溶液：取适量产后康膏置于具塞锥形瓶中，加入水，振荡溶解，加入乙酸乙酯，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，残渣用甲醇定容，离心后用有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；步骤2、制备产后康膏对照品溶液；步骤3、对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2012A；通过本发明的方法可以控制产后康膏的质量稳定，确保其安全性与有效性，并完善相关制药工艺的优化。

Description

产后康膏的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于中成药检测技术领域，具体地说，涉及一种产后康膏的指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术
产后康膏是由黄芪、党参(炒)、当归(炒)等20味药材组成的复方制剂，具有益气养血、滋肾柔肝、安神敛汉、健脾和胃等功效，用于产后、流产后贫血，恶露不净、头晕目眩，心悸汗多，失眠神疲、食欲不振。
据统计，全国育龄妇女每年大约有2500万人怀孕分娩，接受人流手术的妇女又有数千万人次，因此做好产后(包括引产和流产后)的保健康复工作，对于保障广大妇女儿童的身体健康，提高人体素质具有重要意义。
产后康膏作为一种具有益气养血，安神健脾，滋阴补肝作用的纯中药制剂，能够有效治疗产后贫血，恶露不净，头晕目眩等妇科产后症状。
产后康含有多种黄酮类、酚酸类和生物碱类，现有的含量测定方法并不能全面准确的的评价各有效成分的含量。
因此，很有必要在现有技术的基础上，采用高效液相色谱法建立产后康膏的指纹图谱检测方法，为产后康膏的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，开发一种关于产后康膏的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以控制产后康膏的质量稳定，确保其安全性与有效性，并完善相关制药工艺的优化。
技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种产后康膏的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
步骤1、产后康膏供试品溶液的制备：
取适量产后康膏置于具塞锥形瓶中，加入纯化水，振荡溶解，加入乙酸乙酯，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；
步骤2、产后康膏对照品溶液的制备：
分别取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素的对照品储备液液适量，加甲醇定容至，制成香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素的混合对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取步骤1的产后康膏供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的产后康膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2012A；选择不同批次产后康膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成产后康膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤1、产后康膏供试品溶液的制备方法为：
取产后康膏3ml置于具塞锥形瓶中，加入纯化水10ml，振荡溶解，加入乙酸乙酯20ml，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇2ml定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤2、混合对照品溶液的制备：
分别取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为457μg/ml、591μg/ml、519μg/ml、456.5μg/ml、750μg/ml、423μg/ml、624μg/ml的对照品储备液；分别精密量取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含香草酸45.7μg、丁香酸59.1μg、盐酸益母草碱51.9μg、橙皮苷45.65μg、甘草苷75μg、丹酚酸B42.3μg、槲皮素62.4μg的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm；
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％甲酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml·min-1，柱温30℃，检测波长254nm。
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，梯度洗脱优选如下表：
时间/min 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比
0 95 5
15 95 5
55 90 10
80 85 15
160 70 30
170 65 35
175 95 5
180 95 5
。
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，色谱柱为色谱柱为YMC-Pack ODS-A色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
作为优选方案，以上所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，得到的产后康膏指纹图谱中有13个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为23.162min；共有峰2，保留时间为26.381min；共有峰3，保留时间为37.807min；共有峰4，保留时间为47.379min；共有峰5，保留时间为76.069min；共有峰6，保留时间为88.859min；共有峰7，保留时间为100.243min；共有峰8，保留时间为109.256min；共有峰9，保留时间为117.862min；共有峰10，保留时间为125.050min；共有峰11，保留时间为131.556min；共有峰12，保留时间为135.199min；共有峰13，保留时间为168.875min。
其中，3号峰为香草酸，4号峰为丁香酸，5号峰为盐酸益母草碱，6号峰为橙皮苷，8号峰为甘草苷，10号峰为丹酚酸B，11号峰为槲皮素。
实验方法与指纹图谱检测条件的优化实验：
(1)不同流动相的选择：
本发明通过大量实验筛选了纯水-乙腈、纯水-甲醇、0.1％甲酸水-乙腈、0.1％甲酸水-甲醇、0.1％磷酸水-乙腈、0.1％磷酸水-甲醇等流动相***进行检测，检测结果显示选择含0.1％体积甲酸水和乙腈作为流动相，***基线平稳、峰形、各峰分离度情况最好。故选择以含0.1％体积甲酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B为最佳流动相。
由于产后康膏有效成分不但含有黄酮和酚酸类酸性成分，还含有生物碱类成分，在同一色谱柱上分离难度较大。本发明在确定流动相基础上，为了达到更好的分离度，本发明筛选了不同的梯度洗脱方式，实验结果表明，不同的梯度洗脱方式，对各化合物的分离度影响大，本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目，优选得到最佳的梯度洗脱方式为：流动相B的比例变化为：0～15min，5％～5％乙腈；15～55min，5％～10％乙腈；55～80min，10％～15％乙腈，80～160min，15％～30％乙腈；160～170min，30％～35％乙腈；170～175min，35％～5％乙腈；175～180min，5％～5％乙腈；
(2)不同检测波长的选择：
本发明通过大量实验筛选了不同波长230nm、254nm、280nm、350nm下色谱检测结果，检测结果显示在254nm下各特征峰强度较好，故选择254nm作为检测波长，如图1所示。
本发明的有益效果是：
(1)本发明根据产后康膏中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的参苓酒指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价产后康膏的质量，为保证临床产后康膏疗效具有重要意义。
(2)本发明所建立的指纹图谱，可注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定产后康膏质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
(3)本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。
附图说明
图1为产后康膏供试品在254nm下的色谱图。
图2为对照品溶液在254nm下的色谱图。
图3为10批产后康膏供试品溶液匹配的指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
以下实施例所用仪器
LC-20AT型高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器)(日本岛津公司)，BP211D型万分之一精确分析天平(北京赛多利斯仪器***有限公司)，FA1004N型十万分之一精确电子分析天平(北京赛多利斯仪器***有限公司)，HH-6型数字显视恒温水浴锅(常州市江南实验仪器厂)，SHZ－D(III)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，KQ5200DE型数控超声波清洗器(频率：40KHz，昆山市超声仪器有限公司)。
以下实例所用试药如下：香草酸分析标准品(批号110776-201503，纯度99.8％)、甘草苷分析标准品(批号111610-201607，纯度93.1％)、丹酚酸B分析标准品(批号111562-201917，纯度96.6％)、槲皮素分析标准品(批号100081-201610，纯度99.1％)、盐酸益母草碱分析标准品(批号111823-202005，纯度95.7％)均购自中国食品药品检定研究所、丁香酸分析标准品(纯度98.0％)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司、橙皮苷分析标准品(批号161231，纯度98.0％)购自南京森贝伽生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲酸为分析纯。产后康膏(江苏海昇药业有限公司，批号190301、190401、190402、190501、190502、200101、200102、200301、200401、200601)其它试剂(分析纯)。
实施例1
一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
10批产后康膏(江苏海昇药业有限公司，批号190301、190401、190402、190501、190502、200101、200102、200301、200401、200601)取产后康膏3ml置于具塞锥形瓶中，加入纯化水10ml，振荡溶解，加入乙酸乙酯20ml，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇2ml定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得产后康膏供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：
分别取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为457μg/ml、591μg/ml、519μg/ml、456.5μg/ml、750μg/ml、423μg/ml、624μg/ml的对照品储备液；分别精密量取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含香草酸45.7μg、丁香酸59.1μg、盐酸益母草碱51.9μg、橙皮苷45.65μg、甘草苷75μg、丹酚酸B42.3μg、槲皮素62.4μg的混合对照品溶液。
(3)分别精密吸取步骤1的10批产后康膏供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(4)将步骤3中获得的10批产后康膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2012A；选择10批次产后康膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成产后康膏的对照指纹图谱，如图3所示，相似度评价结果见表2。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图(图2所示，3号峰为香草酸，保留时间为37.807min；4号峰为丁香酸，保留时间为47.379min；5号峰为盐酸益母草碱，保留时间为76.069min；6号峰为橙皮苷，保留时间为88.859min；8号峰为甘草苷，保留时间为117.862min；10号峰为丹酚酸B，保留时间为131.556min；11号峰为槲皮素，保留时间为135.199min)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
色谱条件及***适用性
色谱柱：YMC-Pack ODS-A色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
流动相：A相：0.1体积％甲酸水；B相：乙腈；检测波长：254nm，流速：1.0ml·min-1，柱温：30℃；梯度洗脱程序如下表1：
表1梯度洗脱程序
时间/min 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比
0 95 5
15 95 5
55 90 10
80 85 15
160 70 30
170 65 35
175 95 5
180 95 5
。
表2 10批产后康膏供试品溶液相似度评价结果
Figure BDA0003208371210000071
Figure BDA0003208371210000081
得到的产后康膏指纹图谱中有13个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为23.162min；共有峰2，保留时间为26.381min；共有峰3，保留时间为37.807min；共有峰4，保留时间为47.379min；共有峰5，保留时间为76.069min；共有峰6，保留时间为88.859min；共有峰7，保留时间为100.243min；共有峰8，保留时间为109.256min；共有峰9，保留时间为117.862min；共有峰10，保留时间为125.050min；共有峰11，保留时间为131.556min；共有峰12，保留时间为135.199min；共有峰13，保留时间为168.875min。
其中，3号峰为香草酸，4号峰为丁香酸，5号峰为盐酸益母草碱，6号峰为橙皮苷，8号峰为甘草苷，10号峰为丹酚酸B，11号峰为槲皮素。
实施例2指纹图谱检测的方法学研究：
1、方法学考察
1.1精密度考察
取批号为200601的产后康膏样品，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于3.42％，共有峰峰面积RSD均小于1.89％，说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取批号为200601的产后康膏样品，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，4，8，12，16，24h进样，记录色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.22％，共有峰峰面积RSD均小于2.76％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取批号为200601的产后康膏样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中6个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于0.59％，共有峰峰面积RSD均小于2.56％，说明该方法重复性良好。
由以上实验结果表明，本发明建立的产后康膏指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，能有效地表征产后康膏的质量，有利于全面监控其质量。

Claims (5)

1.一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、产后康膏供试品溶液的制备：
取适量产后康膏置于具塞锥形瓶中，加入水，振荡溶解，加入乙酸乙酯，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液；
步骤2、产后康膏对照品溶液的制备：
分别取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素的对照品储备液适量，加甲醇定容，制成香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素的混合对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取步骤1的产后康膏供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的产后康膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2012A；选择不同批次产后康膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成产后康膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
所述的步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：色谱柱为YMC-Pack ODS-A色谱柱，规格为50mm×4.6mm，5µm，以0.1%甲酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1ml·min-1，柱温30℃，检测波长254nm；
梯度洗脱如下表：
时间/min 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比 0 95 5 15 95 5 55 90 10 80 85 15 160 70 30 170 65 35 175 95 5 180 95 5
。
2.根据权利要求1所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤1、产后康膏供试品溶液的制备方法为：
取产后康膏3ml置于具塞锥形瓶中，加入纯化水10ml，振荡溶解，加入乙酸乙酯20ml，振荡萃取，静置，上下分层清晰后，取上层萃取液，重复萃取两次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇2ml定容，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得待测供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤2、混合对照品溶液的制备：
分别取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为457μg/ml、591μg/ml、519μg/ml、456.5μg/ml、750μg/ml、423μg/ml、624μg/ml的对照品储备液；分别精密量取香草酸、丁香酸、盐酸益母草碱、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B和槲皮素对照品储备液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含香草酸45.7μg、丁香酸59.1μg、盐酸益母草碱51.9μg、橙皮苷45.65μg、甘草苷75μg、丹酚酸B42.3μg、槲皮素62.4μg的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，得到的产后康膏指纹图谱中有13个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为23.162min；共有峰2，保留时间为26.381min；共有峰3，保留时间为37.807min；共有峰4，保留时间为47.379min；共有峰5，保留时间为76.069min；共有峰6，保留时间为88.859min；共有峰7，保留时间为100.243min；共有峰8，保留时间为109.256min；共有峰9，保留时间为117.862min；共有峰10，保留时间为125.050min；共有峰11，保留时间为131.556min；共有峰12，保留时间为135.199min；共有峰13，保留时间为168.875min。
5.根据权利要求4所述的一种产后康膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中，3号峰为香草酸，4号峰为丁香酸，5号峰为盐酸益母草碱，6号峰为橙皮苷，8号峰为甘草苷，10号峰为丹酚酸B，11号峰为槲皮素。
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