CN101130765A - 呼吸道合胞病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了保藏号CGMCC 1546的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞株产生的抗呼吸道合胞病毒N蛋白单克隆抗体,及含有该单克隆抗体的呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)。该检测试剂盒可以快速检测呼吸道合胞病毒,特异性、敏感性及准确率高,保存和运输方便,临床及家居使用上极为便利,而且具有产业性。
Description
技术领域
本发明涉及抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体,产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及含有该单克隆抗体的呼吸道合胞病毒检测试剂盒。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV,简称合胞病毒,属副粘病毒科)于1956年首次在伴有感冒症状的猩猩体内分离到。是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原,因其在细胞培养中能形成特殊的细胞融和病变,故名。该病毒的感染可引起间质性肺炎,及毛细支气管炎。在北京,48%的病毒性肺炎和58%的毛细支气管炎系由合胞病毒引起(1980~1984);在广州,小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4%由合胞病毒引起(1973~1986);在美国,20%~25%的婴幼儿肺炎和50%~75%的毛细支气管炎由合胞病毒引起。
RSV在电镜下所见与副流感病毒类似,病毒颗粒大小约为150nm,较副流感病毒稍小,为RNA病毒,对***敏感,无血球凝集性,在人上皮组织培养形成特有的合胞(syncytium),病毒在胞浆内增殖,可见胞浆内包涵体。用分子生物学方法证明合胞病毒有二个亚型。
合胞病毒感染的潜伏期为2~8天(多为4~6天)。合胞病毒肺炎的典型所见是单核细胞的间质浸润。主要表现为肺泡间隔增宽和以单核细胞为主的间质渗出,其中包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。此外肺泡腔充满水肿液,并可见肺透明膜形成。在一些病例,亦可见细支气管壁的淋巴细胞浸润。在肺实质出现伴有坏死区的水肿,导致肺泡填塞、实变和萎陷。
由于母传抗体不能完全地预防感染的发生,合胞病毒肺炎在出生后任何时候都可能发生。多见于3岁以下,1~6个月可见较重病例,男多于女。我国北方多见于冬春季,广东则多见于春夏。由于抗体不能完全防止感染,合胞病毒的再感染极为常见,有人观察10年,再感染发生率高达65%。合胞病毒的传染性很强,有报道家庭成员相继发生感染,在家庭内发生时,年长儿及成人一般为上呼吸道感染。文献报道院内继发合胞病毒感染率高达30%~50%。
合胞病毒感染多见于婴幼儿,其中半数以上为1岁以内婴儿,男多于女,其比例约为1.5~2∶1。潜伏期约4~5日。初期可见咳嗽、鼻堵塞。约2/3的病例有高热,最高可至41℃,但发热一般不是持续性的,较易由解热药退烧,高热时间多数为1~4天,少数为5~8天。约1/3病儿中度发热,多持续1~4天。多数病例的热程为4~10天。轻症病例呼吸困难及神经症状不著,中、重症有较明显的呼吸困难、喘憋、***青紫、鼻扇及三凹征,少数重症病例也可并发心力衰竭。胸部听诊多有细小或粗、中罗音,叩诊一般无浊音,少数有过清音。
临床病人由于不同的呼吸道病毒(如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等)感染引起的疾病症状可以十分相似。这导致了流行诊断比较困难,确诊往往依赖于实验室诊断。快速诊断的方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断,便于阻止疾病的传染及改变流行的爆发。
目前呼吸道合胞病毒感染的检测主要有以下几种方法:
一、常规实验室检测-病毒分离法
实验室诊断呼吸道合胞病毒感染的金标准是病毒分离的方法。采用标本的时间以发病前5天为宜,取病人鼻咽棉拭子或咯痰进行病毒分离培养。该病毒不能在鸡胚内增殖,只能在人和猴细胞如Hep-2,Hela等细胞株中培养增殖,约培养2~3周才出现细胞界线不清、融合成多核巨细胞等的细胞病变,病毒通过出芽释放。但是病毒分离的方法具有严重的缺陷。因为它们既费时又费力,通常需要较长时间才能得到最终结果,这样在临床方面对病人的有效治疗有一定的局限性。
二、快速诊断
直接检查病毒蛋白抗原和病毒核酸可达到快速诊断的目的,常用的方法有免疫荧光法、免疫酶法、放射免疫法、免疫胶体金法、电镜技术、核酸杂交和PCR法等。
1、免疫学方法
1、1免疫酶法免疫酶法(EIA)的基本原理是利用酶与抗体与抗原结合后,形成酶结合物,它既不改变抗体或抗原的免疫学活性,有保留酶本身的酶活性,然后加入酶的相应低物,在酶的催化作用下使原来无色的低物发生水解、氧化或其他反应,生成有色产物。
EIA法敏感性高,特异性强,操作简便,肉眼可观察,便于大规模检测,在呼吸道合胞病毒研究中,它主要用于合胞病毒的快速诊断和单克隆抗体的筛选,较少用于病毒株的抗原性分析。
1、2免疫荧光法将患者的鼻咽分泌物脱落细胞涂片,用免疫荧光法可直接查合胞病毒抗原。免疫荧光是一种高度敏感和特异的技术,但它需要在标本中少量的细胞和专业的技术人员来解释结果。
1、3免疫胶体金胶体金标记,实际上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。目前医学检验中应用的免疫胶体金诊断技术主要有两种,胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法。这两种方法的基本原理都是以微孔滤膜作为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细吸管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上的包被的抗体或抗原结合,在用胶体金结合物标记而达到检测的目的。
免疫胶体金快速诊断技术具有放射免疫法、酶免疫法等诊断方法不可取代的优点:首先,它不需要酶联免疫法中所需要的低物,因此可省去一些操作步骤,使操作简单化;其次,胶体金无污染,不会危害操作者和污染环境;再次,胶体金抗体复合物在冻干状态下室温储存稳定;此外胶体金还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产物显色永久不褪等优点。
由于免疫胶体金快速诊断技术已经日趋成熟,以及它的便捷、灵敏、安全、低成本等优点,使其在诊断领域中迅速推广。目前市场上出售和文献报道主要集中在妇女妊娠系列、病原体抗原或抗体检测系列、药物滥用检测系列、疾病相关蛋白检测系列等。
2、基因诊断
2、1核酸杂交法
此法比电镜、免疫酶标等方法更为特异、敏感,而且可定量。目前常用于呼吸道合胞病毒的快速诊断。核酸分子杂交技术能广泛的用于临床标本中病毒序列的检测,只是因为常规的方法(如免疫学方法)就可以成功的检测临床标本中的病毒,临床就不需要它来诊断疾病。另一方面,核酸分子杂交技术作为诊断疾病的工具仍有一定的困难,如需要一定的设备,费时。故在许多实验室尚不能作为常规诊断方法来应用,因此目前该方法仅用于研究。
2、2RT-PCR
对许多RNA病毒来说RT-PCR诊断方法比传统的病毒分离和抗原诊断方法既快又灵敏。而且RT-PCR可以很容易的同时诊断多种病毒,另一些诊断方法如病毒分离和免疫荧光分析却不能。
尽管基因检测技术有很多优点,但也有不足之处,如PCR技术,最大的优点恰恰带来了它在实际应用中的最大障碍,DNA扩增的高校性导致了极微量的污染既可出现假阳性,因而使结果失真。此外病毒作为外原基因的入侵者,必须在阐明其全部或部分核苷酸序列时,才可以设计引物或探针,进行核酸分子杂交和PCR检测。
从现有的呼吸道合胞病毒的检测方法可见,病毒分离、EIA、RT-PCR诊断方法尽管都有一定的特异性和敏感性的优点,但在操作上需要专业技术人员、专门的仪器设备和特定的条件及费时等缺点,而近年发展成熟的免疫胶体金诊断技术具有特异性高、敏感度高、操作简单而且不需要专业人员和仪器设备,已经成为合胞病毒诊断新的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以快速、准确检验人呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)。
本发明的另一个目的是提供了抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了上述目的,本发明采取的技术方案如下:
本发明所产生的呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A7已于2005年11月28日,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为:CGMCC1546。
本发明抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体,可以用常规技术从保藏号为CGMCC1546的杂交瘤细胞株2A7产生。
本发明呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法),其包含从保藏号为CGMCC1546的杂交瘤细胞株2A7产生的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体。
本发明的优点是:本发明呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)具有以下有点:
①检测快速:10分钟出结果;
②特异性:仅对呼吸道合胞病毒呈阳性,而对其它呼吸道病毒和细菌等13种病原体呈阴性结果;
③敏感性:对呼吸道合胞病毒可以检出3×104TCID50/0.1ml;
④准确率高:经八所三甲医院临床试验共3026例,与病毒培养法比较,总符合率为95.2%;
⑤保存和运输方便:在室温下可以保存18个月;
⑥临床及家居使用极为便利,而且具有产业性。
为了进一步理解本发明的实质,下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。
具体实施方式
实施例1:抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备
(1)骨髓瘤细胞
SP2/0骨髓瘤细胞:购于军事医学科学院微生物流行病研究所。用时将储存在液氮罐中的SP2/0细胞复苏,在含有10%小牛血清DMEM培养液中培养48-72小时,待细胞生长良好,细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐,呈对数***,准备融合。
将Hep-2细胞培养好后,直接涂玻片上,-30℃超低温冰箱保存,供监测抗细胞克隆用。
(2)免疫亲代细胞
免疫用呼吸道合胞病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。将毒株接种在Hep-2细胞中培养,待细胞病变达(+++),立即放入-70℃超低温冰箱保存,以此作为免疫动物的抗原。
呼吸道合胞病毒抗原基质片的制备:将呼吸道合胞病毒接种在Hep-2细胞中培养,待细胞病变达(+++),将细胞从瓶壁上消化下来,离心沉淀,取洁净活胶棉涂的10孔玻片,将病变细胞平铺于玻片孔内,立即用电风扇吹干,丙酮国定,吹干,-30℃超低温冰箱保存,备抗体检测用。
制备的抗原液从-70℃超低温冰箱取出溶解后,用4号针头分别给BALB/C小鼠(购于军事医学科学院动物中心)鼻孔滴入5-6滴,每只二次,间隔10天。融合前3日,在小鼠脾脏和腹腔以抗原0.15ml进行攻击。
(3)细胞融合
融合剂PEG(分子量1500,日本产);培养液:10%小牛血清DMEM。SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的淋巴细胞分别按2×107和1×108比例融合。
(4)阳性孔的监测
将融合孔上清液分别加在上述病毒基质片上和Hep-2细胞片上。放37℃恒温箱内30分钟。以免疫荧光技术羊抗鼠荧光标记物显示。以荧光显微镜观察结果,凡于病毒片反应者又与Hep-2细胞片反应者,为抗细胞阳性,应弃掉。同时用基因重组呼吸道合胞病毒N蛋白10ug/ml包被抗原板,加上融合孔上清,并以羊抗鼠酶标记二抗,以酶联仪测定,凡是大于空白对照2个OD值为阳性。
(5)获得阳性孔
获得阳性孔38孔。
(6)阳性孔进行扩大培养、传代与克隆
将阳性孔立即进行复苏、冻存、进行传代及复苏的冻存工作。
(7)将获得的4个细胞株以有限稀释法进行克隆化,培养传代5个月。约40代,每传一代进行一次检测,并进行反复液氮冻存和复苏。
(8)抗体分泌稳定性实验
以上4株产生抗合胞病毒抗体的杂交瘤细胞株经连续克隆化检测单克隆抗体阳性率达100%,在体外传代5个月,并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体,上清效价:1∶6400-1∶12800(++)IFA,或间接酶联免疫上清效价在1∶25600-1∶51200以上。
(10)细胞核学特征:对上述杂交瘤细胞中期染色体检测为87条;证明它们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。
(11)选取其中的一株产生抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2A7,并于2005年11月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号:CGMCC 1546
实施例2:鼠源病毒检查
为了鉴定制备的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的特异性,即与所使用的鼠源病毒无交叉反应。
检查鼠源病毒包括:出血热病毒(EHFV);淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒(LCMV);3型呼肠弧病毒(Reovirus);仙台病毒;脱脚病毒;小鼠腺病毒(MAV);小鼠肺炎病毒(PVM)。
细胞接种法:将2A7杂交瘤细胞株分泌上清分别接种于Vero(非洲绿猴肾传代细胞);2BS(人胚肺)二倍体细胞,接种量为107。接种细胞后传两代,观察细胞是否有病变,同时制片,用IFA法检测病毒抗原,为阴性。
动物接种法:2A7杂交瘤细胞株接种出生24小时以内乳鼠各10只;体重15-20克成年小鼠各10只;体重300-350克的豚鼠各5只。每只动物腹腔内接种107活细胞,存活率为85%。
实施例3:支原体检查
培养法:2A7杂交瘤细胞株细胞制片加支原体单克隆抗体(购于军事医学科学院微生物流行病研究所)作用30分钟,荧光染色,同时作阴、阳对照。结果:阴性对照结果(-);阳性对照结果(+);检测标本结果:阴性。培养上清进行包被后加单克隆抗体,用ELISA方法检测,同时做阴性对照,标本结果:阴性。
实施例4:单克隆抗体的检定
免疫球蛋白类及亚类:用免疫双扩散法,结果:2A7杂交瘤细胞株产生的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体为IgG2b。
亲和力:2A7杂交瘤细胞株产生的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体用IFA法测定亲和力常数为1.2×10-6M/L。
实施例5:2A7单克隆抗体是针对呼吸道合胞病毒N蛋白单抗的鉴定
采用间接ELISA测定呼吸道合胞病毒细胞株2A7单克隆抗体是针对呼吸道合胞病毒N蛋白的单抗,试验如下:
1.材料和方法
1.1抗体呼吸道合胞病毒细胞株2A7制备纯化的单克隆抗体(批号,200501、200502),由本公司制备。
1.2抗原呼吸道合胞病毒N重组蛋白抗原,由本公司制备。
1.3试剂HRP-羊抗鼠IgG抗体,购自中山科技有限公司;NBT贮存液,0.5g NBT于10ml DMT中,4℃保存;NBT/BCIP溶液,临用前配。
1.4ELISA测定rN用包被液稀释成0.5mg/ml,每孔加入100μl包被于酶标反应板内,并做双复孔
↓4℃冰箱过夜
0.01M PBS洗三次,每次5min,加入3%BSA 100μl封闭
↓室温60min
0.01M PBS洗三次,每次5min,加入1∶1000稀释的鼠抗人呼吸道合胞病毒2A7
↓37℃60min
0.01M PBS洗三次,每次5min,加入3.0μg/ml HRP-兔抗鼠IgG二抗100μl
↓37℃60min
0.01M PBS洗三次,每次5min,加入OPD-H2O2底物液100μl
↓37℃10-20min
加2N H2SO4终止液50μl,在酶标仪上测OD490值
2.结果
用间接ELISA检测呼吸道合胞病毒rN抗原与呼吸道合胞病毒的杂交瘤2A7制备的纯化单克隆抗体(批号,200501、200502)呈现高特异结合免疫活性,结果见表1。
3.结论
以上研究结果证实,呼吸道合胞病毒胶体金快速检测盒选用的杂交瘤2A7制备的单克隆抗体是针对呼吸道合胞病毒N蛋白的抗体。
表1.ELISA测定2A7单抗与呼吸道合胞病毒rN抗原结合的免疫活性
呼吸道合胞病毒抗原 | 呼吸道合胞病毒单抗 | |
2A7(200501) | 2A7(200502) | |
呼吸道合胞病毒rN | 1∶25600 | 1∶25600 |
PBS | - | - |
实施例6:特异性
封闭试验:以兔抗2A7血清封闭,证实2A7分别被不同浓度的异种动物血清封闭。
采用IFA方法:2A7与呼吸道合胞病毒结合,呈阳性反应。与Hep-2细胞结合,呈阴性反应。以上证明单克隆抗体与靶抗原的特异性。
实施例7:交叉试验
2A7产生的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体与流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、呼肠病毒及SARS病毒均呈阴性反应。
效价测定:
间接荧光法IFA测定效价:1∶6400-1∶12800。
间接酶联测定效价:1∶25600-1∶51200。
实施例8:细胞库的建立和抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的产生
单克隆抗体生产场所应符合GLP要求,洁净无污染,工作人员无传染病,不得从事其他可以导致传染源污染单克隆抗体制剂工作;无关人员不得进入生产区内,在同一年内,不得同时生产其他无关单抗。
1、细胞库:建立原始细胞库和生产细胞库及种子批
1、1原始细胞库
2A7杂交瘤细胞:产生抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的2A7杂交瘤细胞。
1、2种子细胞库
2A7杂交瘤细胞,为扩大培养冻存的细胞种子,每批细胞管数20支,贴上标签放入液氮罐中保存。每批留取保存时进行细菌、真菌、支原体及病毒污染检测。
1、3生产细胞库
经检定合格的2A7杂交瘤细胞按生产条件大量培养,冻存的细胞管数为生产细胞库。每一生产细胞批细胞管数10支,每次生产腹水时取生产管1支复苏、扩增及生产、不再回冻。
2、抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备
2、1小鼠腹水法
(1)小鼠:SPF级小鼠,经检查无鼠源病毒污染,在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。
(2)动物实验设施:有北京医学动物管理委员会颁发的医学动物二级以上合格证。
(3)细胞扩大培养:取生产批细胞管1支复苏,加营养液进行扩大培养,1支生产细胞只用一次,不再冻存。
(4)细胞接种:制备腹水均需在无菌条件下进行,注射杂交瘤细胞之前,每只小鼠腹腔注射降植烷0.5ml。一周后每只小鼠注射2A7杂交瘤细胞1-3×105。
(5)腹水的采集:注射细胞后7-10天,或小鼠濒死前一次采集腹水,亦可以多次采集。离心分离出上清既为粗提抗体。注明批号、采集日期,置-20℃保存。
2、2细胞培养法:可用细胞培养瓶培养收集上清液制备单克隆抗体。
(1)种子细胞:来源于生产细胞库。
(2)培养基:牛血清培养基。
(3)抗体收集:可一次性收集,也可以连续收集,每一管种子细胞扩大培养后收集的上清为一个批号。
2、3粗制抗体的检测:
无论是小鼠腹水还是细胞培养法制备的单克隆抗体,都需要进行如下检定(1)无菌试验。(2)支原体检查。(3)鼠源病毒检查。(4)效价测定;以上检测合格后用于抗体的纯化。
2、4抗体纯化
(1)将2A7单克隆抗体分别用50%、33%、33%三种浓度的SAS盐析三次。SAS一般不会引起蛋白质变性,可以去除不需要的白蛋白分子。
(2)DEAE-52纤维素对盐析过的单克隆抗体进行洗脱,可见抗体活性峰与蛋白峰的重叠。
(3)结果:2A7单克隆抗体腹水纯化回收率为100%,免疫电泳结果显示一条清晰的沉淀线。
(4)应用:将纯化的单克隆抗体按效价的4-8单位应用于检测。
连续生产三批,各批产品必须符合质检要求,批间具有良好的重复性。
1)腹水效价的检定:2A7单克隆抗体腹水自小鼠腹腔取出后,立即分别用FluA抗原基片进行效价测定,要求IFA效价达到1∶6400-1∶12800,或间接酶联免疫上清效价达到1∶25600-1∶51200。
2)腹水纯化:随时测定纯化后的效价,要求每次测定(IFA)效价应达1∶6400-1∶12800。
2、5纯化后处理:
(1)灭活:必要时56℃水浴灭活30分钟,离心取上清。
(2)合并:不同亚批的合格制品合格后在2-8℃放置一个月以上,除去部分不稳定蛋白。
(3)除菌分装:将灭活抗体用0.22um滤膜过滤,过滤后,每4-8单位加入青霉素10单位,链霉素1ug/ml,再加入适量的20%甘露醇进行分装,每支2ml,-30℃过夜,次日在进行冷冻干燥。
实施例9:单克隆抗体的大量生产
采用体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
(1)实体瘤法:对数生长期的2A7杂交瘤细胞按1-3×107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2-4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10-20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1-10mg/ml。但采血量有限。
(2)腹水的制备:常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C小鼠,1-2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7-10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠濒于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获5-10ml腹水。也可用注射器抽提腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5-10mg/ml腹水,这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、最多。
实施例10:大量单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄糖球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达90%以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3结合,同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时,1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持抗体的活性至关重要。
实施例11:呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)的制备
(1)胶体金的制备采用化学还原法,向氯化金水溶液中加入柠檬酸三钠还原剂,使金离子聚合成40nm胶体金颗粒。先将0.01%的氯化金溶液500ml加热至沸腾,边搅拌边迅速加入6.5ml 1%柠檬酸三钠水溶液,加热至出现红色后继续煮沸7~10分钟。恢复至室温,恢复体积至500ml。
(2)胶体金-抗体结合物制备及纯化
①、取胶体金颗粒溶液500ml,在磁力搅拌器下用0.2M K2CO3调节PH至8.2。
②、将本发明实施例8或9制备的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体用0.01M PB稀释成1mg/ml。取5支试管各加入1ml胶体金溶液,在前4管分别加入30ul、40ul、45ul、50ul待标记抗体,最后一管作为对照。混匀后室温放置5分钟,前4管中各加入100ul浓度为10%的NaCl。混匀后室温放置10分钟,和对照管对比,以没有变蓝色的一管所加入的抗体量作为最佳蛋白标记量。在此基础上加10%,作为标记使用量。
③、根据体积和标记实用量计算标记所需蛋白量,将1mg/ml的单克隆抗体缓慢加入胶体金溶液中,加入10mg蛋白的时间不超过5分钟。室温下搅拌30分钟。然后进行胶体金-抗体结合物稳定性检定:取出2支试管,每管中加入1ml已经加入抗体的胶体金溶液,其中一管中加入100ul浓度为10%的NaCl,混匀后室温放置10分钟。对比两管的颜色,应无变化。
④、加10%BSA,至终浓度为1%。
⑤、加10%PEG,至终浓度为0.2%,室温搅拌30分钟。
⑥、8500RPM离心30分钟,小心吸去上清,用200ml胶体金保存液悬浮沉淀,再次以8300RPM离心30分钟,小心吸去上清。用50ml胶体金保存液悬浮沉淀,置4℃保存备用。
(3)胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备:
取胶体金-抗体结合物溶液,均匀喷在玻璃纤维上,放在平坦的塑料板上,然后冷冻1小时,放入冷冻干燥机上冻干过夜,至完全干燥。切成0.6-0.8cm宽,30cm长的条,室温避光干燥环境中保存。
(4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备
①、将本发明实施例8或9制备的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体用0.01M PBS稀释成3.5±0.1mg/ml。用喷膜机将以上抗体以1ul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上(检测线)。
②、将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.01M PBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将以上抗体以1ul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上(对照线)。和检测线的间隔为0.5cm。
③、把固定有抗体的硝酸纤维素膜置37℃烤箱中干燥充分干燥。
④、置干燥环境中保存备用。
(5)组装试纸条
①、在塑料板中间位置粘贴抗体固相硝酸纤维素膜。
②、在塑料板上固定硝酸纤维素膜位置的顶端,粘附吸水垫,低端粘附金标记抗体结合物-玻璃纤维素膜条带。吸水垫和胶体金垫应覆盖硝酸纤维素膜边沿约1毫米左右。
③、胶体金垫下方粘附样品垫,样品垫覆盖胶体金垫约1毫米。
④、压平整后,在切条机上切成0.4cm宽的条带。
(6)包装:
(7)成品入库
根据检定结果进行分类,然后将制备的呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)按要求入库。
(8)检定合格成品置常温下保存。
呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)质量保证
1杂交瘤细胞株的质量保证
(1)亲本骨髓瘤细胞购于军事医学科学院微生物流行病研究所,该细胞具有稳定遗传性和无限增值能力。
(2)免疫亲代呼吸道合胞病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所,是经过技术检定符合质量标准的细胞株。
(3)免疫小鼠Balb/C购于军事医学科学院动物中心,该中心具备SPF级饲养场所,并经过国家认证,小鼠经过检定,符合国家标准。
(4)建立单克隆细胞检定方法:检测结果抗体分泌稳定性阳性率为100%,细胞核学特征符合杂交瘤的核学特征,鼠源病毒检查为阴性,无菌试验为阴性。
2单克隆抗体的质量保证
(1)免疫球蛋白类及亚类:用免疫双扩散法,结果符合要求。
(2)亲和力:用IFA法测定亲和力常数为1.1×10-6M/L,符合要求。
(3)特异性:采用IFA法,特异性为100%。
(4)交叉试验:2A7单克隆抗体与流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、SARS病毒均呈阴性反应。
(5)效价测定:用间接荧光法(IFA),不低于1∶6400-1∶12800,符合要求。3粗制抗体的检测
无论是小鼠腹水还是细胞培养法制备的单克隆抗体,都需要进行如下检定。
(1)无菌试验:为无菌生长,阴性。
(2)支原体检查:为阴性。
(3)鼠源病毒检查:为阴性。
(4)效价测定:用IFA法测定或间接酶联免疫法测定,符合纯化要球。
4成品质标准的建立
(1)外观检查
试纸条宽度4mm±0.2mm。
试纸表面平整,边沿整齐。
试纸条各组分粘贴牢固,衔接紧密,以保证加样后液体的移动连续。
(2)液体移动速度
抽提液在硝酸纤维素膜上移动2cm时间不低于15秒。
实验:本发明呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)的检测结果评价
实验1:和呼吸道合胞病毒的反应
和呼吸道合胞病毒的两个株(A和B)呈阳性反应。
实验2:交叉反应
和流感病毒A、B型无交叉反应;副流感病毒1、2、3型无交叉反应;和腺病毒3、7型无交叉反应;和4株SARS病毒无交叉反应。
实验3:呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法)的检测真实性评价。
于三个不同医院共检测病人标本1108份,其中512份阳性样品中检测出阳性504份,596份阴性样品中检测出阴性592份。
灵敏度:512份阳性样品中检测出阳性504份,灵敏度为98.4%。
特异度:596份阴性样品中检测出阴性592份,特异度为99.3%。
Claims (4)
1.具有保藏号为CGMCC 1546的杂交瘤细胞株。
2.抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体,可以从具有保藏号为CGMCC 1546的杂交瘤细胞株产生。
3.呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法),其特征在于:其包含权利要求2所述的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的呼吸道合胞病毒检测试剂盒(胶体金法),其特征在于:权利要求2所述的抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体包附胶体金。
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