CN113238053B - 一种用于检测stat3二聚化的质粒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测STAT3二聚化的质粒，属于分子生物学技术领域。本发明的质粒包括如下3种片段：(1)启动子；(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；其中，(1)和(2)通过2A肽的基因相连；所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同。本发明的质粒在细胞中可1∶1的翻译出带有不同标签的STAT3蛋白，通过其中一个标签纯化蛋白后，再针对另一标签进行检测，即可客观反映STAT3二聚化水平。

Description

一种用于检测STAT3二聚化的质粒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。
背景技术
信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator oftranscription 3，STAT3)是具有转录活性的癌基因，其单体首先在胞浆中磷酸化，随后磷酸化的STAT3单体二聚化形成二聚体，变成有活性的STAT3。活化的STAT3二聚体向细胞核移位进而调控肿瘤的增殖、生存、转移、血管生成、免疫应答等过程。
STAT3二聚体已经成为抗肿瘤新药筛选的重要靶标之一，研究表明，G-四联体寡核苷酸类(G-quartet oligo-nucleotides)可形成一个复杂的三级结构抑制STAT3的二聚化，从而在体外和小鼠模型中抑制鳞癌的生长(刘俊等.STAT3信号通路及其肿瘤分子靶向治疗的研究进展.中国神经精神疾病杂志，2011年第37卷第7期)。为了提高这类抑制STAT3二聚化的药物的筛选效率，需要建立相关的细胞模型，来反映药物的抑制STAT3二聚化的能力。
陈俊生等分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体，利用脂质体转染技术将二者共转入HEK-293T细胞，利用ECFP(作为供体分子)和EYFP(作为受体分子)两种荧光蛋白之间能量共振转移，检测STAT3分子的二聚化水平(陈俊生等.基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型的建立.中国海洋药物，2018年37卷第3期)。但是，该方法需要构建2种载体，共转入细胞后两种载体的数量很难保持一致，那么二聚体形成可能因为其中一种载体数量不足而受到抑制，导致假阳性。此外，虽然非变性聚丙酰胺凝胶电泳结合免疫印迹可检测蛋白多聚体，但存在检测敏感度低，实验条件不易控制等问题。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种用于检测STAT3二聚化的质粒，以及检测STAT3二聚化的方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测STAT3二聚化的质粒，所述质粒包括如下3种片段：
(1)启动子；
(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；
(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；
其中，(2)和(3)通过2A肽相连；
所述2A肽又叫2A自剪切肽，是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。这种肽都有一段序列模体，经常会在最后甘氨酸(G)和脯氨酸(P)连接处导致核糖体无法连接，翻译蛋白时提前终止，从而造成“剪切”的效果。
所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同；
质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。
进一步地，所述标签蛋白A为FLAG标签，所述标签蛋白B为Myc标签；
或，所述标签蛋白A为Myc标签，所述标签蛋白B为FLAG标签。
进一步地，所述质粒是以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体为空载体骨架，于多克隆位点***片段(1)～(3)得到的质粒。
前述质粒的制备方法，包括如下步骤：
1)使用序列如SEQ ID NO.1～2所述引物对STAT3的cDNA进行PCR扩增，得到Flag-STAT3片段；
2)将Flag-STAT3***空载体骨架，得pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro；
3)使用序列如SEQ ID NO.6～7所述的引物对STAT3的eDNA进行PCR扩增，得到Myc-STAT3-T2A片段；
4)将Myc-STAT3-T2A片段通过NheI酶切后***pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro，即得。
进一步地，步骤2)为：Flag-STAT3片段、空载体骨架通过NheI、NotI酶切后，通过T4连接酶连接。
进一步地，步骤4)为：pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro通过NheI酶切后，通过同源重组，将其与Myc-STAT3-T2A片段连接成环。
一种检测细胞内STAT3二聚化水平的方法，包括：
a)将权利要求1～3任一所述质粒转染至细胞；
b)根据标签蛋白A分离蛋白；
c)以分离的蛋白为样品，对标签蛋白B进行检测。
进一步地，步骤b)的分离为使用免疫沉淀方法进行分离。
进一步地，步骤c)的检测为使用Western blot检测。
前述质粒在用于筛选STAT3二聚化抑制剂中的用途。
本发明的有益效果：
本发明的质粒在细胞中可1∶1地翻译出带有不同标签的STAT3蛋白，若形成STAT3二聚体，则二聚体同时带有两种不同的标签(如图1)。通过其中一个标签纯化蛋白后，再针对另一标签进行检测，即可客观反映STAT3二聚化水平。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：带有不同标签的STAT3二聚体示意图。
图2：pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体结构示意图。
图3：pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro质粒示意图。
图4：pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro质粒示意图。
图5：Flag-STAT3的PCR产物条带。左起第一泳道为DL15000DNA Marker(从上到下为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)，第二泳道为目标条带，第三泳道为Spark2000DNA Marker(从上到下为2000、1000、750、500、250、100bp)。
图6：Flag抗体免疫印迹(IB)检测结果和Myc抗体免疫共沉淀(IP)后再进行Flag免疫印迹检测的结果。
图7：Myc抗体免疫印迹(IB)检测结果和Flag抗体免疫共沉淀(IP)后再进行Myc免疫印迹检测的结果。
具体实施方式
实施例1本发明质粒的构建
构建过程为：使用pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro为空载体骨架(lifescience-market，香港)(如图2所示)，在其多克隆位点(MCS)，通过双酶切，***Flag-STAT3片段，得到pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro(如图3所示)；在pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro的基础上，在Flag-STAT3片段的上游相邻位置***Myc-STAT3-T2A片段，得到本发明的质粒pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro(如图4所示)。
T2A即为2A肽的基因。
详细步骤如下：
一、pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro构建
1.引物设计
根据GenBank中NM_139276.2的序列，设计如下PCR引物，其中上游引物带NheI酶切位点，并且加Kozak序列(翻译增强序列)，起始密码子，以及Flag标签编码序列，以及STAT3起始序列；下游引物带NotI酶切位点，终止密码子以及STAT3末端序列。然后使用从DNA文库中STAT3的cDNA为模板，进行PCR扩增出目的片段。(引物序列如下)
Flag-STAT3正向引物(SEQ ID N0.1)：
CTA(酶切保护碱基)GCTAGC(NheI序列)ACC(Kozac序列：翻译增强序列)ATG(起始密码子)GACTACAAGGACGACGATGATAAG(Flag序列)GCCCAATGGAATCAGCTACAGC(扩增STAT3的序列)
Flag-STAT3反向引物(SEQ ID N0.2)：
AAT(酶切保护碱基)GCGGCCGC(Not工序列)TCA(终止密码子)CATGGGGGAGGTAGCGCACTC(扩增STAT3的序列)
2.PCR反应
反应体系如表1所示。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003050344180000041
注：DDW，双蒸水，下同。
反应条件如下：
Figure BDA0003050344180000042
反应结束后，用1.0％Agarose电泳鉴定并回收目的片段，如图5所示。
3.酶切实验
用NheI、NotI将表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro和PCR回收产物进行双酶切，体系如表2、3所示，酶切反应条件：37℃，1h。
表2载体酶切反应体系
Figure BDA0003050344180000051
表3 STAT3回收产物酶切反应体系
Figure BDA0003050344180000052
加入6×Loading Buffer 3μl，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并凝胶回收目的条带。
4.连接实验
将酶切回收后的载体片段和STAT3片段进行T4 DNA连接酶连接，体系如表4所示，反应条件：轻轻混匀后，22℃连接1h。
表4连接反应体系
Figure BDA0003050344180000053
5.转化实验
将连接的混合液直接转入Stb13感受态细胞，转化步骤如下：
(1)将连接液20μl全部加入100μl感受态细菌中，置冰上30min；
(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；
(3)全部涂布于含Amp抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜。
6.阳性克隆鉴定
随机挑取4个单克隆至含Amp抗性的400μl LB培养液的EP管中，37℃220rpm振摇4h，取1μl菌液做模板，进行PCR鉴定(选择STAT3其中一段序列(大小约1KB)设计正反引物，进行PCR，阳性条带为阳性克隆)。
引物序列：
Forward：CTAGCTAGCACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCCCAATGGAATCAGCTACAGC(SEQ ID NO.3)
Reverse：ATGGGCATGCAGGGCTGCCG(SEQ ID NO.4)
7.DNA测序
将经菌落PCR鉴定为阳性克隆测序。
测序结果：
Figure BDA0003050344180000061
Figure BDA0003050344180000071
测序结果显示pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro构建成功。
二、pCDH-CMV--Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro构建
1.引物设计
根据NM_139276.2的序列，设计如下PCR引物，其中上下游引物都带NheI酶切位点，以及和pCDH-CMV-Flag-STAT3-GFP-Puro经NheI线性化之后的同源臂并且上游加Kozak序列，起始密码子，Myc标签编码序列，STAT3的起始序列，下游加T2A序列，STAT3的末端序列。然后使用从DNA文库中STAT3的cDNA为模板，进行PCR扩增出目的片段。(引物序列如下)
Myc-STAT3正向引物(SEQ ID NO.6)：
Atagaagattctaga(同源臂)GCTAGC(NheI序列)GCCACC(Kozak增强序列)ATG(起始密码子)GAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACCTG(Myc序列)GCCCAATGGAATCAGCTACAGC(STAT3)
Myc-STAT3反向引物(SEQ ID NO.7)：
CTTGTAGTCCATGGT(同源臂)GCTAGC(NheI序列)AGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTC(T2A序列)CATGGGGGAGGTAGCGCACTCC(STAT3序列)
2.PCR反应
PCR反应体系和反应时间同第一部分第2节。
3.酶切反应。
用NheI将表达载体pCDH-CMV-Flag-STAT3-GFP-Puro进行单酶切，体系参照上文表2(去除表2中的NotI)。
4.同源重组反应
将Myc-STAT3-T2A的片段和线性化的pCDH-CMV-Flag-STAT3-GFP-Puro进行重组反应，反应体系如表5所示，反应条件为：轻轻混匀后，50℃反应30min。
表5同源重组反应体系
Figure BDA0003050344180000072
5.转化实验
参照上文。
6.阳性克隆鉴定
随机挑取2个单克隆至含Amp抗性的400μl LB培养液的EP管中，37℃220rpm振摇4h，然后转接到4ml含Amp抗性的LB培养液种，37℃220rpm振摇过夜，第二天抽提质粒，然后经NheI单酶切，选取切下来2300bp左右目的条带的克隆送测序。
测序所得序列(SEQ ID NO.8)为：
Figure BDA0003050344180000081
Figure BDA0003050344180000091
测序结果显示pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro构建成功。
实施例2本发明质粒用于检测STAT3二聚化的应用
转染实施例1的pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro质粒至HEK293T细胞，48小时后提取细胞总蛋白，对Myc或Flag进行免疫共沉淀(IP)，总蛋白和IP得到的蛋白均进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，再用免疫印迹(IB)检测Flag或Myc。
如图6所示，直接用Myc抗体做免疫印迹检测，显示有条带(input)，可见Myc-STAT3表达出了蛋白；由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳会将二聚体变性成单体，所以input泳道是单一条带。对Flag进行免疫共沉淀后，用Myc抗体做免疫印迹，显示有条带(IP)，如果在细胞内未形成二聚体，则带Myc的STAT3不能被免疫共沉淀收集到，则不会出现条带；该结果表明，带有Myc和Flag的STAT3蛋白在细胞内被连接到了一起，形成了STAT3二聚体。
类似的，如图7所示，直接用Flag抗体做免疫印迹检测，显示有条带(input)，可见Flag-STAT3表达出了蛋白；对Myc进行免疫共沉淀后，用Flag抗体做免疫印迹，显示有条带(IP)，表明带有Myc和Flag的STAT3蛋白连接到了一起，形成了STAT3二聚体。
实施例2的结果表明，本发明构建的pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro质粒在进入目的细胞后，在2A肽的作用下会形成两个STAT3单体(分别带有Myc和Flag标签)，摩尔比为1∶1，对于STAT3二聚化水平高的细胞，质粒表达的带Myc与Flag标签的STAT3会形成二聚体，进而容易被免疫共沉淀和免疫印迹方法检测出来。
可将本发明的质粒转入细胞，建立细胞模型，便于对细胞二聚化水平的变化进行监测，能用于STAT3二聚化抑制剂的筛选，或者研究某种因子对STAT3二聚化的影响。本发明的优势在于仅需要转染一个质粒即可实现STAT3二聚化相关研究，可大幅度提高转染效率，同时简化实验流程，方便可行。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种用于检测STAT3二聚化的质粒
<130> GYKH1891-2021P0112721CC
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
ctagctagca ccatggacta caaggacgac gatgataagg cccaatggaa tcagctacag 60
c 61
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aatgcggccg ctcacatggg ggaggtagcg cactc 35
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
ctagctagca ccatggacta caaggacgac gatgataagg cccaatggaa tcagctacag 60
c 61
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
atgggcatgc agggctgccg 20
<210> 5
<211> 2489
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagattctag agctagcacc atggactaca 60
aggacgacga tgataaggcc caatggaatc agctacagca gcttgacaca cggtacctgg 120
agcagctcca tcagctctac agtgacagct tcccaatgga gctgcggcag tttctggccc 180
cttggattga gagtcaagat tgggcatatg cggccagcaa agaatcacat gccactttgg 240
tgtttcataa tctcctggga gagattgacc agcagtatag ccgcttcctg caagagtcga 300
atgttctcta tcagcacaat ctacgaagaa tcaagcagtt tcttcagagc aggtatcttg 360
agaagccaat ggagattgcc cggattgtgg cccggtgcct gtgggaagaa tcacgccttc 420
tacagactgc agccactgcg gcccagcaag ggggccaggc caaccacccc acagcagccg 480
tggtgacgga gaagcagcag atgctggagc agcaccttca ggatgtccgg aagagagtgc 540
aggatctaga acagaaaatg aaagtggtag agaatctcca ggatgacttt gatttcaact 600
ataaaaccct caagagtcaa ggagacatgc aagatctgaa tggaaacaac cagtcagtga 660
ccaggcagaa gatgcagcag ctggaacaga tgctcactgc gctggaccag atgcggagaa 720
gcatcgtgag tgagctggcg gggcttttgt cagcgatgga gtacgtgcag aaaactctca 780
cggacgagga gctggctgac tggaagaggc ggcaacagat tgcctgcatt ggaggcccgc 840
ccaacatctg cctagatcgg ctagaaaact ggataacgtc attagcagaa tctcaacttc 900
agacccgtca acaaattaag aaactggagg agttgcagca aaaagtttcc tacaaagggg 960
accccattgt acagcaccgg ccgatgctgg aggagagaat cgtggagctg tttagaaact 1020
taatgaaaag tgcctttgtg gtggagcggc agccctgcat gcccatgcat cctgaccggc 1080
ccctcgtcat caagaccggc gtccagttca ctactaaagt caggttgctg gtcaaattcc 1140
ctgagttgaa ttatcagctt aaaattaaag tgtgcattga caaagactct ggggacgttg 1200
cagctctcag aggatcccgg aaatttaaca ttctgggcac aaacacaaaa gtgatgaaca 1260
tggaagaatc caacaacggc agcctctctg cagaattcaa acacttgacc ctgagggagc 1320
agagatgtgg gaatgggggc cgagccaatt gtgatgcttc cctgattgtg actgaggagc 1380
tgcacctgat cacctttgag accgaggtgt atcaccaagg cctcaagatt gacctagaga 1440
cccactcctt gccagttgtg gtgatctcca acatctgtca gatgccaaat gcctgggcgt 1500
ccatcctgtg gtacaacatg ctgaccaaca atcccaagaa tgtaaacttt tttaccaagc 1560
ccccaattgg aacctgggat caagtggccg aggtcctgag ctggcagttc tcctccacca 1620
ccaagcgagg actgagcatc gagcagctga ctacactggc agagaaactc ttgggacctg 1680
gtgtgaatta ttcagggtgt cagatcacat gggctaaatt ttgcaaagaa aacatggctg 1740
gcaagggctt ctccttctgg gtctggctgg acaatatcat tgaccttgtg aaaaagtaca 1800
tcctggccct ttggaacgaa gggtacatca tgggctttat cagtaaggag cgggagcggg 1860
ccatcttgag cactaagcct ccaggcacct tcctgctaag attcagtgaa agcagcaaag 1920
aaggaggcgt cactttcact tgggtggaga aggacatcag cggtaagacc cagatccagt 1980
ccgtggaacc atacacaaag cagcagctga acaacatgtc atttgctgaa atcatcatgg 2040
gctataagat catggatgct accaatatcc tggtgtctcc actggtctat ctctatcctg 2100
acattcccaa ggaggaggca ttcggaaagt attgtcggcc agagagccag gagcatcctg 2160
aagctgaccc aggtagcgct gccccatacc tgaagaccaa gtttatctgt gtgacaccaa 2220
cgacctgcag caataccatt gacctgccga tgtccccccg cactttagat tcattgatgc 2280
agtttggaaa taatggtgaa ggtgctgaac cctcagcagg agggcagttt gagtccctca 2340
cctttgacat ggagttgacc tcggagtgcg ctacctcccc catgtgagcg gccgcgaagg 2400
atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag 2460
aagttggggg gaggggtcgg caatgaacc 2489
<210> 6
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
atagaagatt ctagagctag cgccaccatg gagcaaaagc tcatttctga agaggacctg 60
gcccaatgga atcagctaca gc 82
<210> 7
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
cttgtagtcc atggtgctag cagggccggg attctcctcc acgtcaccgc atgttagaag 60
acttcctctg ccctccatgg gggaggtagc gcactcc 97
<210> 8
<211> 2506
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
tcggagggga tatagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 60
acgctgtttt gacctccata gaagattcta gagctagcgc caccatggag caaaagctca 120
tttctgaaga ggacctggcc caatggaatc agctacagca gcttgacaca cggtacctgg 180
agcagctcca tcagctctac agtgacagct tcccaatgga gctgcggcag tttctggccc 240
cttggattga gagtcaagat tgggcatatg cggccagcaa agaatcacat gccactttgg 300
tgtttcataa tctcctggga gagattgacc agcagtatag ccgcttcctg caagagtcga 360
atgttctcta tcagcacaat ctacgaagaa tcaagcagtt tcttcagagc aggtatcttg 420
agaagccaat ggagattgcc cggattgtgg cccggtgcct gtgggaagaa tcacgccttc 480
tacagactgc agccactgcg gcccagcaag ggggccaggc caaccacccc acagcagccg 540
tggtgacgga gaagcagcag atgctggagc agcaccttca ggatgtccgg aagagagtgc 600
aggatctaga acagaaaatg aaagtggtag agaatctcca ggatgacttt gatttcaact 660
ataaaaccct caagagtcaa ggagacatgc aagatctgaa tggaaacaac cagtcagtga 720
ccaggcagaa gatgcagcag ctggaacaga tgctcactgc gctggaccag atgcggagaa 780
gcatcgtgag tgagctggcg gggcttttgt cagcgatgga gtacgtgcag aaaactctca 840
cggacgagga gctggctgac tggaagaggc ggcaacagat tgcctgcatt ggaggcccgc 900
ccaacatctg cctagatcgg ctagaaaact ggataacgtc attagcagaa tctcaacttc 960
agacccgtca acaaattaag aaactggagg agttgcagca aaaagtttcc tacaaagggg 1020
accccattgt acagcaccgg ccgatgctgg aggagagaat cgtggagctg tttagaaact 1080
taatgaaaag tgcctttgtg gtggagcggc agccctgcat gcccatgcat cctgaccggc 1140
ccctcgtcat caagaccggc gtccagttca ctactaaagt caggttgctg gtcaaattcc 1200
ctgagttgaa ttatcagctt aaaattaaag tgtgcattga caaagactct ggggacgttg 1260
cagctctcag aggatcccgg aaatttaaca ttctgggcac aaacacaaaa gtgatgaaca 1320
tggaagaatc caacaacggc agcctctctg cagaattcaa acacttgacc ctgagggagc 1380
agagatgtgg gaatgggggc cgagccaatt gtgatgcttc cctgattgtg actgaggagc 1440
tgcacctgat cacctttgag accgaggtgt atcaccaagg cctcaagatt gacctagaga 1500
cccactcctt gccagttgtg gtgatctcca acatctgtca gatgccaaat gcctgggcgt 1560
ccatcctgtg gtacaacatg ctgaccaaca atcccaagaa tgtaaacttt tttaccaagc 1620
ccccaattgg aacctgggat caagtggccg aggtcctgag ctggcagttc tcctccacca 1680
ccaagcgagg actgagcatc gagcagctga ctacactggc agagaaactc ttgggacctg 1740
gtgtgaatta ttcagggtgt cagatcacat gggctaaatt ttgcaaagaa aacatggctg 1800
gcaagggctt ctccttctgg gtctggctgg acaatatcat tgaccttgtg aaaaagtaca 1860
tcctggccct ttggaacgaa gggtacatca tgggctttat cagtaaggag cgggagcggg 1920
ccatcttgag cactaagcct ccaggcacct tcctgctaag attcagtgaa agcagcaaag 1980
aaggaggcgt cactttcact tgggtggaga aggacatcag cggtaagacc cagatccagt 2040
ccgtggaacc atacacaaag cagcagctga acaacatgtc atttgctgaa atcatcatgg 2100
gctataagat catggatgct accaatatcc tggtgtctcc actggtctat ctctatcctg 2160
acattcccaa ggaggaggca ttcggaaagt attgtcggcc agagagccag gagcatcctg 2220
aagctgaccc aggtagcgct gccccatacc tgaagaccaa gtttatctgt gtgacaccaa 2280
cgacctgcag caataccatt gacctgccga tgtccccccg cactttagat tcattgatgc 2340
agtttggaaa taatggtgaa ggtgctgaac cctcagcagg agggcagttt gagtccctca 2400
cctttgacat ggagttgacc tcggagtgcg ctacctcccc catggagggc agaggaagtc 2460
ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccgtctgctg cagcac 2506

Claims (10)

1.一种用于检测STAT3二聚化的质粒，其特征在于：所述质粒包括如下3种片段：
(1)启动子；
(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；
(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；
其中，(2)和(3)通过T2A相连，T2A是编码2A肽的核苷酸； 所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同；
质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。
2.如权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述标签蛋白A为FLAG标签，所述标签蛋白B为Myc标签；
或，所述标签蛋白A为Myc标签，所述标签蛋白B为FLAG标签。
3.如权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述质粒是以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体为空载体骨架，于多克隆位点***片段(1)～(3)得到的质粒。
4.权利要求3所述质粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)使用序列如SEQ ID NO.1～2所述引物对STAT3的cDNA进行PCR扩增，得到Flag-STAT3片段；
2)将Flag-STAT3***空载体骨架，得pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro；
3)使用序列如SEQ ID NO.6～7所述的引物对STAT3的cDNA进行PCR扩增，得到Myc-STAT3-T2A片段；
4)将Myc-STAT3-T2A片段通过NheI酶切后***pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro，即得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)为：Flag-STAT3片段、空载体骨架通过NheI、NotI酶切后，通过T4连接酶连接。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤4)为：pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro通过NheI酶切后，通过同源重组，将其与Myc-STAT3-T2A片段连接成环。
7.一种检测细胞内STAT3二聚化水平的方法，其特征在于：包括：
a)将权利要求1～3任一所述质粒转染至细胞；
b)根据标签蛋白A分离蛋白； c)以分离的蛋白为样品，对标签蛋白B进行检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤b)的分离为使用免疫沉淀方法进行分离。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤c)的检测为使用Western blot检测。
10.权利要求1～3任一所述质粒在用于筛选STAT3二聚化抑制剂中的用途。
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