CN112481286B - 提高重组牛奶蛋白异源表达效率的氨基酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促使蛋白高效表达的多肽。实验结果表明，通过将该多肽的基因与靶标蛋白基因用融合表达的方式共同表达，能够促使原本无法进行体外表达的蛋白基因获得体外重组表达的功能，从而实现靶标蛋白的高效合成。

Description

提高重组牛奶蛋白异源表达效率的氨基酸序列
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达效率的氨基酸序列及其应用。
背景技术
具有生物活性的可溶重组蛋白是蛋白质结构和功能研究的基础。但是，可溶性蛋白表达量偏低已成为限制研究目标蛋白质结构与功能的重大阻碍。
随着合成生物学和基因工程技术的发展，越来越多的科研工作者利用DNA重组方法生产有用的蛋白质，这需要高活性、高产量的蛋白质表达***。但在常规表达中异源性重组蛋白难以高效表达，甚至不能正确折叠为具有生物活性的构象，已成为基础科学研究，免疫医学，工业及农业酶制剂及蛋白产品研发和生产上的难题。
因此，提高重组蛋白体外表达效率是需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提高重组蛋白体外表达效率。
本发明发现了一段氨基酸序列PEP(Peptide for Expression-Promoting)，具有促进重组蛋白体外高效表达的作用。
因此，本发明提供了一种提高真核生物蛋白高效表达的方法，通过将编码多肽PEP的基因与靶标蛋白基因通过融合表达的方式共同表达，以提高靶标蛋白尤其是真核生物来源基因翻译蛋白的表达量，实现靶标蛋白的高效合成。
本发明首次发现，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽PEP可用于高效蛋白异源表达***的构建，应用于基础科学研究，免疫医学，工业及农业酶制剂及蛋白产品等领域。
本发明选取体外难以重组表达的三种蛋白基因：牛αS2-酪蛋白基因csn1s2、牛κ-酪蛋白基因csn3和牛α-乳白蛋白基因LALBA为研究对象，鉴定了多肽PEP提高重组乳蛋白体外高效表达功能，具体发明内容如下：
1、PEP多肽提高αS2-酪蛋白的高效表达
将αS2-酪蛋白基因csn1S2为靶标基因进行体外重组表达。将csn1S2连接pET28a载体并转化大肠杆菌BL21，获得阳性表达菌株BL21-CSN1S2。分别在16℃、22℃、30℃条件下进行诱导表达，利用SDS-PAGE检测靶标蛋白的表达情况。
研究结果显示：αS2-酪蛋白无法表达，体外表达失败。同时，将多肽PEP与αS2-酪蛋白基因csn1S2融合表达，利用相同表达体系，分别在不同条件进行诱导表达，经过SDS-PAGE检测显示，重组菌株BL21-PEP-CSN1S2中靶标蛋白高效表达。Western杂交结果证实，高表达蛋白条带为靶标蛋白重组αS2-酪蛋白，大部分为可溶性蛋白(详见实施例2)。
2、PEP多肽提高κ-酪蛋白的高效表达
将κ-酪蛋白基因csn3为靶标基因进行体外重组表达。利用载体pET28a和表达菌株BL21构建表达体系，获得阳性表达菌株BL21-CSN3。分别在16℃、22℃、30℃不同条件下尝试诱导表达。
研究结果显示：κ-酪蛋白同样无法表达。同时，将多肽PEP与κ-酪蛋白基因csn3融合表达，利用相同表达体系构建表达菌株，分别在不同条件进行诱导表达，经过SDS-PAGE检测显示，重组菌株BL21-PEP-CSN3中靶标蛋白高效表达。Western杂交结果证实，高表达蛋白条带为靶标蛋白重组κ-酪蛋白，并全部为可溶性蛋白(详见实施例3)。
3、PEP多肽提高α-乳白蛋白的高效表达
对同样体外无法重组表达α-乳白蛋白基因LALBA进行改造。将多肽PEP与α-乳白蛋白基因LALBA融合表达，利用载体pET28a和表达菌株BL21构建表达体系，获得阳性表达菌株BL21-PEP-LALBA。
研究结果显示：经过不同条件的诱导表达，SDS-PAGE检测显示，α-乳白蛋白在体外无法重组表达，而重组菌株中靶标蛋白高效表达。Western杂交结果同样证实，高表达蛋白条带为靶标蛋白重组α-乳白蛋白，几乎都为可溶性蛋白(详见实施例4)。
以上用三种蛋白基因进行的对比研究，结果证实，
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽PEP，能够促使真核生物蛋白基因进行体外表达，对原来无法进行体外表达的蛋白基因赋予了体外重组表达的功能。
能够显著的增强靶标蛋白尤其是真核生物来源蛋白的表达量，实现靶标蛋白的高效合成。
多肽PEP可用于高效蛋白异源表达***的构建，应用于基础科学研究，免疫医学，工业及农业酶制剂及蛋白产品等领域。
附图说明：
图1真核基因csn1s2、csn3和LALBA的异源表达的SDS-PAGE电泳结果比较。
图中，M，marker；1，对照菌株未诱导；2，对照菌株IPTG诱导；3，BL21-CSN1S2菌株未诱导；4，BL21-CSN1S2菌株IPTG诱导；5，BL21-CSN3菌株未诱导；6，BL21-CSN3菌株IPTG诱导；7，BL21-LALBA菌株未诱导；8，BL21-LALBA菌株IPTG诱导。
图2转录水平分析基因csn1s2、csn3和LALBA诱导后的表达量。
图3BL21-PEP-CSN1S2菌株靶标蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果比较。
图中，M，marker；1，30℃菌株未诱导；2，30℃菌株IPTG诱导；3，22℃菌株未诱导；4，22℃菌株IPTG诱导；5，16℃菌株未诱导；6，16℃菌株IPTG诱导。
图4Western杂交检测靶标蛋白PEP-CSN1S2。
图5BL21-PEP-CSN3菌株靶标蛋白的表达的SDS-PAGE电泳结果比较。
图中，M，marker；1，30℃菌株未诱导；2，30℃菌株IPTG诱导；3，22℃菌株未诱导；4，22℃菌株IPTG诱导；5，16℃菌株未诱导；6，16℃菌株IPTG诱导。
图6Western杂交检测靶标蛋白PEP-CSN3。
图7BL21-PEP-LALBA菌株靶标蛋白的表达的SDS-PAGE电泳结果比较。
图中，M，marker；1，30℃菌株未诱导；2，30℃菌株IPTG诱导；3，22℃菌株未诱导；4，22℃菌株IPTG诱导；5，16℃菌株未诱导；6，16℃菌株IPTG诱导。
图8Western杂交检测靶标蛋白PEP-LALBA。
序列表说明
SEQ ID NO.1是多肽PEP的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2是多肽PEP的蛋白氨基酸序列；
具体实施方式
为了证明PEP多肽提高真核生物蛋白表达效率，本发明通过融合表达的方式将编码多肽PEP的核苷酸序列与真核生物来源靶标蛋白基因共同表达，通过SDS-PAGE电泳检测靶标蛋白的的表达量，以此证明PEP多肽实现靶标蛋白的高效合成的应用。
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
原核表达载体pET-28a：为全式金公司市售产品；
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)：为全式金公司市售产品。
实施例1 PEP多肽的序列分析
氨基酸序列分析显示，多肽PEP(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)由342个核苷酸编码的114个氨基酸组成，分子量为11.38kDa。核苷酸序列如SEQ ID NO.1；含有负电荷氨基酸8个，正电荷氨基酸5个，预测等电点为4.51，极性氨基酸残基占23％，疏水氨基酸残基占20％。二级结构分析显示含有一段无规则卷曲，4段β折叠和2段α螺旋组成。
实施例2 PEP多肽提高αS2-酪蛋白的高效表达
一、实验材料
原核表达载体pET-28a：为全式金公司市售产品；
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)：为全式金公司市售产品。
二、实验方法
1.载体构建。以本实验室保存的重组质粒pUC-CSN1S2为模板，加入PCR特异性引物，扩增完整的αS2-酪蛋白基因CSN1S2的核苷酸序列，以戈壁异常球菌基因组DNA为模板，扩增PEP多肽的DNA，PCR产物进行胶回收。使用Nco I/Xho I双酶切pET28a载体以及含有相邻片段互补序列目的基因片段进行同源重组连接。
2.表达菌株获得。将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-PEP-CSN1S2。同时，将不含有融合片段PEP多肽的CSN1S2同样连接pET28a载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-CSN1S2。挑取单菌落进行PCR验证，提取重组质粒进行酶切，测序进行验证。
3.靶标蛋白诱导表达。以1％的接种量将重组菌种接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。以OD600为0.1的初始浓度接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8。加入IPTG(终浓度0.5μmol/L)在分别在16℃、22℃、30℃条件进行蛋白诱导表达，超声波破碎细胞，利用SDS-PAGE检测靶标蛋白的表达情况。
4.基因表达分析。采用innuPREP RNA Mini Kit对目的IPTG诱导后重组表达菌株进行总RNA提取，去除基因组DNA后，反转录合成cDNA。根据靶标基因序列特征设计特异性qRT-PCR引物，内参基因为16SrDNA基因。利用荧光定量PCR反应测定菌株中靶标基因的表达情况，每个样品设置3个平行。
5.Western杂交。收集菌株，超声波破碎细胞，进行SDS-PAGE电泳。将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，封闭处理3小时后进行抗体孵育，按照二抗的标记进行显色反应，检测靶标蛋白表达情况。
三、实验结果
SDS-PAGE电泳结果显示，重组菌株BL21-CSN1S2在不同诱导条件下都没有表达靶标蛋白，如图1第3、4泳道所示。研究结果表明，真核来源的αS2-酪蛋白CSN1S2基因在重组表达时收到了影响，不能被诱导表达。荧光实时定量PCR结果显示(图2)，重组菌株BL21-CSN1S2中，csn1S2基因发生了转录，表明菌株中csn1S2的mRNA翻译过程受到阻断，导致无法合成靶标αS2-酪蛋白。相比之下，PEP多肽融合表达的重组菌株BL21-PEP-CSN1S2中，能够看到明显的蛋白诱导表达条带。图3显示，16℃、22℃、30℃条件蛋白都有表达，其中22℃、30℃条件最佳。Western杂交结果显示，诱导表达的蛋白条带为靶标蛋白PEP-CSN1S2。
四、实验结论
真核αS2-酪蛋白基因csn1S2无法进行体外重组表达；PEP多肽与靶标csn1S2基因的融合表达能够完成真核αS2-酪蛋白csn1S2基因的高效表达。
实施例3 PEP多肽提高κ-酪蛋白的高效表达
一、实验材料
原核表达载体pET-28a：为全式金公司市售产品；
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)：为全式金公司市售产品。
二、实验方法
1.载体构建。以本实验室保存的重组质粒pUC-CSN3为模板，加入PCR特异性引物，扩增完整的κ-酪蛋白基因CSN3的核苷酸序列，以戈壁异常球菌基因组DNA为模板，扩增PEP多肽的DNA，PCR产物进行胶回收。使用Nco I/Xho I双酶切pET28a载体以及含有相邻片段互补序列目的基因片段进行同源重组连接。
2.表达菌株获得。将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-PEP-CSN3。同时，将不含有融合片段PEP多肽的CSN3同样连接pET28a载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-CSN3。挑取单菌落进行PCR验证，提取重组质粒进行酶切，测序进行验证。
3.靶标蛋白诱导表达。以1％的接种量将重组菌种接种到添加抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。以OD600为0.1的初始浓度接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8。加入IPTG(终浓度0.5μmol/L)在分别在16℃、22℃、30℃条件进行蛋白诱导表达，超声波破碎细胞，利用SDS-PAGE检测靶标κ-酪蛋白的表达情况。
4.基因表达分析。采用innuPREP RNA Mini Kit对目的IPTG诱导后重组表达菌株进行总RNA提取，去除基因组DNA后，反转录合成cDNA。根据靶标基因序列特征设计特异性qRT-PCR引物，内参基因为16SrDNA基因。利用荧光定量PCR反应测定菌株中靶标基因的表达情况，每个样品设置3个平行。
5.Western杂交。收集菌株，超声波破碎细胞，进行SDS-PAGE电泳。将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，封闭处理3小时后进行抗体孵育，按照二抗标记进行显色反应，检测靶标蛋白表达情况。
三、实验结果
SDS-PAGE电泳结果显示，重组菌株BL21-CSN3在不同诱导条件下都没有表达靶标蛋白如图1的5、6泳道，研究结果表明，真核来源的κ-酪蛋白基因csn3在重组表达时收到了影响，不能被诱导表达。图2荧光实时定量PCR结果显示，重组菌株BL21-CSN3中，csn3基因能够正常转录，诱导表达后上调100倍以上，表明菌株中csn3的mRNA翻译过程受到阻断，导致无法合成靶标κ-酪蛋白。相比之下，PEP多肽融合表达的重组菌株BL21-PEP-CSN3中，能够看到明显的蛋白诱导表达条带，如图5。在16℃、22℃、30℃的不同诱导条件下靶标蛋白PEP-LALBA表达量相似。Western杂交结果图6显示，诱导表达的蛋白条带为靶标蛋白PEP-CSN3，表达的蛋白几乎都存在与细胞破碎上清液中，为可溶性蛋白。
四、实验结论
真核κ-酪蛋白基因csn3无法进行体外重组表达；PEP多肽与靶标csn3基因的融合能够完成真核κ-酪蛋白的高效表达。
实施例4 PEP多肽提高α-乳白蛋白的高效表达
一、实验材料
原核表达载体pET-28a：为全式金公司市售产品；
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)：为全式金公司市售产品。
二、实验方法
1.载体构建。以本实验室保存的重组质粒pUC-LALBA为模板，加入PCR特异性引物，扩增完整的α-乳白蛋白基因LALBA的核苷酸序列，以戈壁异常球菌基因组DNA为模板，扩增PEP多肽的DNA，PCR产物进行胶回收。使用Nco I/Xho I双酶切pET28a载体以及含有相邻片段互补序列目的基因片段进行同源重组连接。
2.表达菌株获得。将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-PEP-LALBA。同时，将不含有融合片段PEP多肽的LALBA同样连接pET28a载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21，经PCR、酶切，测序验证***序列正确，将该菌株命名为BL21-LALBA。挑取单菌落进行PCR验证，提取重组质粒进行酶切，测序进行验证。
3.靶标蛋白诱导表达。以1％的接种量将重组菌种接种到添加抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。以OD600为0.1的初始浓度接到500mL加了卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液浓度0.6～0.8。加入IPTG(终浓度0.5μmol/L)在分别在16℃、22℃、30℃条件进行蛋白诱导表达，超声波破碎细胞，利用SDS-PAGE检测靶标κ-酪蛋白的表达情况。
4.基因表达分析。采用innuPREP RNA Mini Kit对目的IPTG诱导后重组表达菌株进行总RNA提取，去除基因组DNA后，反转录合成cDNA。根据靶标基因序列特征设计特异性qRT-PCR引物，内参基因为16SrDNA基因。利用荧光定量PCR反应测定菌株中靶标基因的表达情况，每个样品设置3个平行。
5.Western杂交。收集菌株，超声波破碎细胞，进行SDS-PAGE电泳。将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，封闭处理3小时后进行抗体孵育，按照二抗标记进行显色反应，检测靶标蛋白表达情况。
三、实验结果
SDS-PAGE电泳结果显示，重组菌株BL21-在16℃、22℃、30℃的不同诱导条件下都没有表达靶标蛋白，研究结果表明，真核来源的α-乳白蛋白基因LALBA在重组表达时收到了影响，不能被诱导表达，如图1的7、8泳道。荧光实时定量PCR结果显示(图2)，重组菌株BL21-LALBA中，α-乳白蛋白基因LALBA能够正常转录，诱导后基因表达提高22倍，表明菌株中LALBA的mRNA翻译蛋白过程受到阻断，导致α-乳白蛋白无法合成。而PEP多肽融合表达的重组菌株BL21-PEP-LALBA中，能够看到明显的蛋白诱导表达条带，如图7。在16℃、22℃、30℃的不同诱导条件下靶标蛋白PEP-LALBA表达量相似。图8Western杂交结果显示，诱导表达的蛋白条带为靶标蛋白PEP-LALBA，且大部分都为可溶性蛋白。
四、实验结论
真核酪α-乳白蛋白基因LALBA无法进行体外重组表达；PEP多肽与靶标LALBA基因的融合能够完成真核α-乳白蛋白的高效表达。
以上三种不同蛋白的实验表明：PEP多肽能够促使真核生物蛋白基因进行体外表达，使原来无法进行体外表达的蛋白基因获得体外重组表达的功能。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 提高重组牛奶蛋白异源表达效率的氨基酸序列
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 342
<212> DNA
<213> 戈壁射异常球菌（Deinococcus gobiensis）
<400> 1
tgcggaacct cgactacccc catggcccag acgccggccc agggcagcgc cccggccgcc 60
gacagcggtc tggcccccct gcgcggcacc gacaacccca gcgccatcgc cgggcagtac 120
atcgtggtcc tcaaggaagg cacccagagc gccctgagcg cccagagcgc cggcggcctg 180
atcggcagcc tgggtctgga cccgcagggc atcacggtcc tgagcgtgta cggtcaggcc 240
attgagggct tcgccgccaa gctcagcgcc cagaacctgg agaaggtgcg cgccaacgcg 300
aacgtcgcct acgtcgagca ggacggcatg atgtacgcct cc 342
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 戈壁射异常球菌（Deinococcus gobiensis）
<400> 2
Cys Gly Thr Ser Thr Thr Pro MET Ala Gln Thr Pro Ala Gln Gly Ser
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Asp Ser Gly Leu Ala Pro Leu Arg Gly Thr Asp Asn
20 25 30
Pro Ser Ala Ile Ala Gly Gln Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu Gly Thr
35 40 45
Gln Ser Ala Leu Ser Ala Gln Ser Ala Gly Gly Leu Ile Gly Ser Leu
50 55 60
Gly Leu Asp Pro Gln Gly Ile Thr Val Leu Ser Val Tyr Gly Gln Ala
65 70 75 80
Ile Glu Gly Phe Ala Ala Lys Leu Ser Ala Gln Asn Leu Glu Lys Val
85 90 95
Arg Ala Asn Ala Asn Val Ala Tyr Val Glu Gln Asp Gly MET MET Tyr
100 105 110
Ala Ser

Claims (5)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽在促进大肠杆菌异源蛋白高效表达中的应用，方法是将所述多肽的基因与靶标蛋白基因用融合表达的方式共表达。
2.权利要求1所述的应用，多肽编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的应用，所述高效表达，是指所述多肽能够促使原本无法进行的大肠杆菌异源表达的蛋白基因获得表达，或者提高蛋白的表达效率。
4.包含氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示多肽的编码基因的质粒在促进大肠杆菌异源表达重组蛋白中的应用，方法是将所述多肽的基因与靶标蛋白基因用融合表达的方式共表达。
5.一种促进大肠杆菌高效表达异源蛋白的方法，其特征是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示多肽的基因与靶标蛋白基因用融合表达的方式共表达。
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