ES2296423B1 - Construccion de adn para la produccion de proteinas de fusion dimericas y sus aplicaciones. - Google Patents
Construccion de adn para la produccion de proteinas de fusion dimericas y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Una construcción de ADN caracterizada porque comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante; b) una segunda secuencia de ácido nucleico que cor tiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y c) una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-hernolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli; en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
Description
Construcción de ADN para la producción de
proteínas de fusión diméricas y sus aplicaciones.
Esta invención se relaciona con la producción de
proteínas recombinantes diméricas mediante el empleo de un sistema
de expresión de proteínas basado en el sistema de transporte de
hemolisina de Escherichia coli.
Desde hace algún tiempo se está investigando en
la producción de proteínas de fusión que comprenden fragmentos de
anticuerpos recombinantes bi- o multifuncionales (minianticuerpos).
Estas proteínas de fusión presentan algunas ventajas y pueden ser
utilizadas con fines terapéuticos o de diagnóstico. Por este motivo,
se han ido desarrollando diversos sistemas de expresión de
fragmentos de anticuerpos. Algunos de estos sistemas de expresión
se basan en el empleo de Escherichia coli.
Habitualmente se seleccionan diferentes
fragmentos de anticuerpos y se producen en E. coli tras la
donación de fragmentos de las regiones variable (V) y constante (C)
de inmunoglobulinas (Ig) en vectores de fagos filamentos o
fagomidios [Hoogenboom, H. R. 1997. Designing and optimizing
library selection strategies for generating
high-affinity antibodies Trends in Biotechnology.
15:62-70; Hoogenboom, H. R. 2002.
Overview of antibody phage-display technology and
its applications Methods Mol Biol. 178:1-37;
Winter, G., A. D. Griffiths, R. E. Hawkins, and H. R.
Hoogenboom 1994. Making antibodies by phage display technology
Annual Rev. Immunol. 12:433-455]. Estos
fragmentos reconstruyen el sitio de unión al antígeno del
anticuerpo original que, en general, se ensambla mediante el
contacto de los dominios V de las cadenas pesadas (H) y ligeras (L)
[Ay, J., T. Keitel, G. Kuttner, H. Wessner, C. Scholz, M. Hahn,
and W. Hohne 2000. Crystal structure of a phage
library-derived single-chain Fv
fragment complexed with turkey egg-white lysozyme at
2.0 A resolution J Mol Biol. 301:239-46].
Este es el caso de las moléculas Fab, que consisten en la
asociación de dos polipéptidos que contienen los dominios
V_{H}-C_{Hl} y V_{L}-C_{L} y
de las moléculas Fv (scFv) de cadena simple, en las que los
dominios V_{H} y V_{L} se unen en un único polipéptido. Las
moléculas de Fab y scFv tienen ventajas importantes, tales como
niveles de expresión más elevados en E. coli y una mejor
distribución y aclaramiento más rápido cuando se administran in
vivo para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas [Carter, P.,
and A. M. Merchant 1997. Engineering antibodies for imaging and
therapy Current Opinion in Biotechnology.
8:449-454; Marasco, W. A., and S. Dana
Jones 1998. Antibodies for targeted gene therapy: extracellular
gene targeting and intracellular expression Adv Drug Deliv Rev.
31:153-170; Yokota, T., D. E. Milenic, M.
Whitlow, and J. Schlom 1992. Rapid tumor penetration of a
singlechain Fv and comparison with other immunoglobulin forms
Cancer Res. 52:3402-8].
También se han producido en E. coli
fragmentos de anticuerpo basados en un único dominio de Ig
[Nuttall, S. D., R. A. Irving, and P. J. Hudson 2000.
Immunoglobulin VH domains and beyond: design and selection of
single-domain binding and targeting reagents Curr
Pharm Biotechnol. 1:253-63; Riechmann, L.,
and S. Muyldermans 1999. Single domain antibodies: comparison
of camel VH and camelised human VH domains J Immunol Methods.
231:25-38; Sheriff, S., and K. L.
Constantine 1996. Redefining the minimal
antigen-binding fragment Nat Struct Biol.
3:733-6]. Este progreso se realizó gracias al
hallazgo de que en las especies de camélidos (por ejemplo, llamas,
camellos) una proporción de sus anticuerpos naturales carece de
cadena ligera, construyendo por tanto sus superficie de unión a
antígenos con un único dominio V de la cadena pesada (V_{HH}).
Además de los beneficios de scFv y Fabs, los dominios V_{HH} han
demostrado una estabilidad y solubilidad superiores y una
inmunogenicidad inferior [Cortez-Retamozo, V., M.
Lauwereys, G. Hassanzadeh Gh, M. Gobert, K. Conrath, S.
Muyldermans, P. De Baetselier, and H. Revets 2002. Efficient
tumor targeting by single-domain antibody fragments
of camels Int J Cancer. 98:456-62;
Nuttall, S. D., R. A. Irving, and P. J. Hudson 2000.
Immunoglobulin VH domains and beyond: design and selection of
single-domain binding and targeting reagents Curr
Pharm Biotechnol. 1:253-63; Riechmann, L.,
and S. Muyldermans 1999. Single domain antibodies: comparison
of camel VH and camelised human VH domains J Immunol Methods.
231:25-38]. Sin embargo, todos estos
fragmentos de anticuerpo pierden la bivalencia de unión a antígenos
(o multivalencia) mostrada por los anticuerpos completos. Su
carácter monovalente se refleja por una disminución en la afinidad
funcional (avidez) para sus antígenos correspondientes. Para
solventar este problema, se obtuvieron por ingeniería genética
cortos dominios de oligomerización (por ejemplo, hélices
anfipáticas) en los extremos C terminales para producir
minianticuerpos bivalentes y tetravalentes con avidez idéntica a
los anticuerpos completos [Pack, P., M. Kujau, V. Schroeckh, U.
Knupfer, R. Wenderoth, D. Riesenberg, and A. Plückthun 1993.
Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole
antibodies, producec. by high cell density fermentation of
Escherichia coli Biotechnology (N Y).
11:1271-7; Pack, P., K. Muller, R. Zahn,
and A. Plückthun 1995. Tetravalent miniantibodies with high
avidity assembling in Escherichia coli J Mol Biol.
246:28-34; Pack, P., and A. Plückthun
1992. Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce
functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity
in Escherichia coli Biochemistry.
31:1579-84; Plückthun, A., and P.
Pack 1997. New protein engineering approaches to multivalent
and bispecific antibody fragments Immunotechnology.
3:83-105; Rheinnecker, M., C. Hardt, L.
L. Ilag, P. Kufer, R. Gruber, A. Hoess, A. Lupas, C. Rottenberger,
A. Plückthun, and P. Pack 1996. Multivalent antibody fragments
with high functional affinity for a
tumor-associated carbohydrate antigen J Immunol.
157:2989-97].
En casi todos los casos, los fragmentos de
anticuerpos monovalentes y multivalentes se han producido en el
espacio periplásmico de E. coli fusionándoles un péptido
señal en el extremo N terminal (N-SP) que es
reconocido por la maquinaria celular de la ruta de secreción
general (Sec) [Plückthun, A., C. Krebber, U. Krebber, U. Horn,
U. Knüpfer, R. Wenderoth, L. Nieba, K. Proba, and D. Riesenberg
1996. Producing antibodies in Escherichia coli: from PCR to
fermentation, p. 203-252. In J. McCafferty,
and H. R. Hoogenboom (eds), Antibody Engineering: A Practical
Approach. IRL Press, Oxford]. Recientemente se ha descrito un método
alternativo para la producción de scFvs funcionales en el medio
extracelular de cultivos de E. coli que emplean el
transportador de la hemolisina \alpha (Hly) [Fernández, L. A.,
I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000. Specific
secretion of active single-chain Fv antibodies into
the supernantants of Escherichia coli cultures by use of the
hemolysin system Appl Environ Microbiol.
66:5024-5029]. Este sistema de secreción es
independiente de los genes sec celulares y consta de dos componentes
de membrana interna (IM), HlyB y HlyD, y el poro de la membrana
externa (OM), TolC, que se ensamblan en un gran complejo proteico
con un canal hidrófilo interno [Gentschev, I., G. Dietrich, and
W. Goebel 2002. The E. coli
alpha-hemolysin secretion system and its use in
vaccine development Trends Microbiol.
10:39-45; Koronakis, V., C. Andersen, and
C. Hughes 2001. Channel-tunnels Curr Opin Struct
Biol. 11:403-7; Koronakis, V., A. Sharff,
E. Koronakis, B. Luisi, and C. Hughes 2000. Crystal structure
of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux
and protein export Nature. 405:914-919;
Thanabalu, T., E. Koronakis, C. Hughes, and V. Koronakis
1998. Substrate-induced assembly of a contiguous
channel for protein export from E. coli: reversible bridging
of an inner-membrane translocase to an outer
membrane exit pore EMBO J. 17:6487-96]. El
sustrato natural de este sistema, la toxina de la hemolisina a
(HlyA), se expulsa a través de este canal directamente desde el
citoplasma hacia el medio extracelular sin un intermediario
periplásmico y de una forma dependiente de ATP. La señal reconocida
por la maquinaria de secreción de Hly se localiza en el extremo C
terminal de HlyA. Se ha demostrado que los híbridos scFv- HlyA, que
contienen una molécula de scFv que carece del N-SP
unido al último HlyA de aproximadamente 23 kDa, se secretan de una
forma funciona; y oxidada por el transportador de Hly
[Fernández, L. A., and V. De Lorenzo 2001. Formation of
disulphide bonds during secretion of proteins through the
periplasmic-independent type I pathway Mol
Microbiol. 40:332-46; Fernández, L. A., I.
Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion
of active single-chain Fv antibodies into the
supernantants of Escherichia coli cultures by use of the
hemolysin system Appl Environ Microbiol.
66:5024-5029].
Por otra parte, la dimerización es una propiedad
que con frecuencia se desea conseguir por ingeniería genética en
las proteínas cuando está implicada una actividad de unión (por
ejemplo, en las interacciones proteína-ADN o
antígeno-anticuerpo), puesto que puede intensificar
su afinidad funcional (avidez) [Baxevanis, A. D., and C. R.
Vinson 1993. Interactions of coiled coils in transcription
factors: where is the specificity? Curr Opin Genet Dev.
3:278-85; Busch, S. J., and P.
Sansone-Corsi 1990. Dimers, leucine zippers and
DNA-binding domains Trends Genet.
6:36-40; Crothers, D. M., and H.
Metzger 1972. The influence of polyvalency on the binding
properties of antibodies Immunochemistry.
9:341-357; Plückthun, A., and P. Pack
1997. New protein engineering approaches to multivalent and
bispecific antibody fragments Immunotechnology.
3:83-105]. Un procedimiento para la
producción de proteínas diméricas que comprenden dos proteínas de
fusión monoméricas en una interacción no covalente ha sido descrito
en la patente norteamericana US 5.910.573. Las proteínas diméricas
así obtenidas se acumulan dentro de la célula en el espacio
periplásmico, sin secretarse al medio extracelular. Esto conduce a
una mayor toxicidad de su expresión para la bacteria E. coli,
induciendo un menor rendimiento en los cultivos (peso seco de
células por litro), y dificultando la posterior purificación del
anticuerpo dimérico al tener que lisar (romper) las bacterias.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de
desarrollar sistemas alternativos para la producción de proteínas
diméricas.
La invención proporciona una solución a la
necesidad existente basada en el desarrollo de una construcción de
ADN que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica
para la \alpha-hemolisina (HlyA) de Escherichia
coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la
señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema
transportador de hemolisina (Hly) de E. coli; (ii) una
secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de
dimerización; y (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica
para un producto de interés. Mediante el empleo de dicho sistema de
expresión y secreción de proteínas se obtienen proteínas diméricas
en el medio. La eficacia de dicho sistema de secreción ha sido
demostrada mediante la producción de minianticuerpos de alta avidez
derivados de los anticuerpos de camello V_{HH} (Ejemplo 1).
El translocador de hemolisina de E. coli
se había usado anteriormente para la secreción de polipéptidos
heterólogos, especialmente toxinas y antígenos de patógenos, así
como para la secreción de anticuerpos recombinantes scFv. Sin
embargo, los resultados ahora obtenidos han puesto de manifiesto que
la incorporación de una hélice anfipática de autodimerización en el
extremo N terminal de C-HlyA no interfiere con la
secreción de Hly y permite la dimerización del polipéptido
secretado. Asimismo, la dimerización intensifica la avidez de la
unión del polipéptido secretado derivado de C- HlyA. Además, también
puede tener otras aplicaciones, como la asociación molecular de
varios antígenos y/o adyuvantes producidos por cepas bacterianas
vivas, o la combinación de diversas actividades biológicas para la
generación de moléculas biespecíficas (por ejemplo, la unión a un
antígeno y el reclutamiento del complemento).
Por tanto, un aspecto de esta invención se
relaciona con una construcción de ADN que comprende (i) una
secuencia de nucleótidos que codifica para la
\alpha-hemolisina (HlyA) de Escherichia
coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la
señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema.
transportador de hemolisina (Hly) de E. coli; (ii) una
secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de
dimerización; y (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para
un producto de interés.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un cassette de expresión que comprende dicha construcción de ADN
operativamente unida a una secuencia de control de expresión de la
secuencia de nucleótidos que codifica para el producto de
interés.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una bacteria que comprende dicha construcción de ADN o dicho
cassette de expresión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para producir un producto de interés, en forma de una
proteína de fusión dimérica, que comprende crecer dicha bacteria
bajo condiciones que permiten la producción y excreción al medio de
cultivo de dicho producto de interés en forma de una proteína de
fusión dimérica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de la
secuencia de ácido nucleico contenida dicha construcción de
ADN.
La Figura 1 ilustra la secreción del polipéptido
C-HlyA que contiene el dominio ZIP. La Figura 1A
muestra una representación esquemática de la estructura de los
polipéptidos EHlyA y ZEHlyA que contienen la señal de secreción de
23 kDa ('hlyA) del transportador de Hly de E. coli
marcado con el epítopo E. La masa de dichos polipéptidos (en kDa),
deducida de su secuencia de aminoácidos, se muestra a la derecha.
Se indica la composición del dominio ZIP (bisagra de Ig, cremallera
de leucina, marca de 6xhis). También se muestra la secuencia de
aminoácidos de la región N terminal de ambos polipéptidos EHlyA y
ZEHlyA. La Figura 1B es una representación esquemática del
polipéptido C-HlyA (monomérico - marcado con el
epítopo E y del polipéptido C-HlyA (dimérico)
marcado con el epítopo E y que contiene el dominio ZIP (bisagra de
Ig, cremallera de leucina, marca de 6xhis). La Figura I C muestra
el resultado de la inmuno-transferencia desarrollada
can un anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD
de las proteínas secretadas (5) y celulares (C) producidas tras la
inducción de 4 h con IPTG 0,3 mM de cultivos de células de E.
coli HB2151, crecidas a 37ºC, que contienen el plásmido pVDL9.3
(que codifica para HlyB y HlyD) y uno de los plásmidos indicados,
pEHlyA o pZEHlyA. Las proteínas cargadas por carril representan las
encontradas en aproximadamente 5 \mul de los sobrenadantes (S)
del cultivo y las de las células de E. coli (C) presentes en
aproximadamente 100 \mul de los mismos cultivos (DO_{600 \ nm}
aproximadamente 2).
La Figura 2 ilustra el entrecruzamiento de los
polipéptidos C-HlyA secretados con glutarato de
disuccinimidilo (DSG). Los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA secretados
(10 \mug/ml en PBS aproximadamente) se incubaron con DSG, a las
concentraciones indicadas, y se sometieron a
SDS-PAGE desnaturalizante y a inmunotransferencia
con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD
(véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los Materiales y Métodos,
para más detalles). Tal como se muestra, ZEHlyA se entrecruzó con
DSG formando una banda proteica en SDS-PAGE de
aproximadamente 66 kDa, unas dos veces el tamaño de su
monómero.
La Figura 3 muestra los resultados de la
cromatografia de filtración en gel de los polipéptidos de
C-HlyA monoméricos y diméricos. La Figura 3A es un
gráfico que representa el volumen de elución de los polipéptidos
EHlyA (círculo) y ZEHlyA (triángulo) separados por cromatografia de
filtración en gel (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los
Materiales y Métodos, para más detalles) junto con patrones de
proteínas de masa conocida (cuadrados). Los patrones de masa
utilizados fueron la tiroglobulina (Mr 670.000), la gammablobulina
bovina (Mr 158.000), la ovoalbúmina de pollo (Mr 44.000) y la
mioglobina equina (Mr 17.000). La presencia de EHlyA o ZEHlyA en
las fracciones eluídas se determinó por inmunotransferencia con
anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD. La
Figura 3B muestra el resultado de l a inmunotransferencia
desarrollada con un anticuerpo monoclonal anti-E
marcado con POD de los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA. Una
representación esquemática de EHlyA (monomérico) y de ZEHlyA
(dimérico) se muestra en la parte superior.
La Figura 4 ilustra la secreción de polipéptidos
V_{HH}-HlyA. monoméricos
(V_{amy}-HlyA) y diméricos
(V_{amy}-ZHlyA). La Figura 4A es una
representación esquemática de la estructura de los polipéptidos
V_{amy}-HlyA y V_{amy}-ZhlyA que
contienen la señal de secreción de 23 kDa ('hlyA) del
transportador de Hly de E. coli marcado con el epítopo E. La
masa de dichos polipéptidos (en kDa), deducida de su secuencia de
aminoácidos, se muestra a la derecha. La Figura 4B es una
representación esquemática del polipéptido
V_{amy}-ZHlyA (monomérico) marcado con el epítopo
E y del polipéptido V_{amy}-ZHlyA (dimérico)
marcado con el epítopo E y que contiene el dominio ZIP (bisagra de
Ig, cremallera de leucina, marca de 6xhis). La Figura 4C muestra los
resultados de un Western blot en donde se pone de manifiesto la
secreción de híbridos proteicos que tienen dominios V_{HH} y
-EHlyA o -ZEHlyA. Las células de E. coli HB2151 (pVDL9.3)
que llevan uno de los plásmidos indicados (pV_{amy}HlyA o
pV_{amy}ZHlyA) se indujeron con IPTG (véase el Ejemplo 1,
apartado relativo a los Materiales y Métodos, para más detalles), a
la temperatura indicada, y la presencia de polipéptidos secretados
marcados con el epítopo E en sobrenadantes de cultivos se determinó
por inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal
anti-E marcado con POD. Los polipéptidos
V_{amy}HlyA y V_{amy}ZHlyA de longitud completa se detectaron
en los sobrenadantes de cultivos, junto con algunos fragmentos
proteolíticos derivados de ellos. La Figura 4D es un gráfico del
volumen de elución de los polipéptidos V_{amy}HlyA (círculo) y
V_{amy}ZHlyA (triángulo) separados por cromatografia de
filtración en gel, junto con patrones de proteínas de masa conocida
(cuadrados) y detectados con inmunotransferencia con anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con POD. Los patrones de
masa utilizados fueron los mismos que los utilizados en relación
con la Figura 3.
\newpage
La Figura 5 es una gráfica que ilustra la
actividad de unión de los polipéptidos VHH-HlyA
monoméricos y diméricos. La unión de la
\alpha-amilasa mediante los polipéptidos
V_{amy}HlyA y V_{amy}ZhlyA, a las concentraciones indicadas, se
determinó mediante ELISA (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a
los Materiales y Métodos, para más detalles). Los minianticuerpos
marcados con el epítopo E unidos se detectaron con anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con POD y lectura de la
D.O. a 490 nm. Como controles de la especificidad se emplearon
V_{ttx}HlyA y V_{ttx}ZhlyA. La unión previa a un antígeno
control no relacionado (ovoalbúmina) se ha sustraído (DO_{490 \
nm} \leq 0,05). Los datos presentados son la media de los
triplicados de cada punto. Se realizaron dos experimentos
adicionales independientes, que demostraron valores similares a los
mostrados en la figura.
La Figura 6 muestra el mapa del plásmido
pZEHlyA.
La Figura 7 muestra el mapa del plásmido
pZEHlyA2-SD.
La Figura 8 muestra el mapa del plásmido
pV_{amy}HlyA.
La Figura 9 muestra el mapa del plásmido
pV_{amy}ZhlyA.
En un aspecto, la invención proporciona una
construcción de ADN, en adelante construcción de ADN de la
invención, que comprende:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés;
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y
- c)
- una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la \alpha-hemolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli;
en donde el extremo 3' de dicha primera
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de
dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
La primera secuencia de ácido nucleico
contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto
de interés (gen de interés). El producto de interés puede ser
eucarótico, procariótico, viral, etc. Prácticamente cualquier
péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma
recombinante puede ser utilizado en la construcción de ADN de la
invención, por ejemplo, enzimas, inhibidores enzimáticos, hormonas,
moléculas implicadas en la adhesión y/o señalización celular y
compuesta por dominios, por ejemplo, inmunoglobulinas, etc. A modo
ilustrativo, dicho producto de interés puede ser un antígeno
inmunogénico tal como una proteína o un fragmento antigénico de la
misma procedente de un patógeno, por ejemplo, de un patógeno viral,
bacteriano, de un parásito, etc., que puede causar infecciones en
seres humanos o animales; un agente terapéutico, por ejemplo, un
antígeno específico de tumor, un antígeno de una enfermedad
auto-inmune, etc.; o una molécula inmunoreguladora,
por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas, tales como
interleuquinas, interferones, etc. En una realización particular,
dicho producto de interés es un minianticuerpo.
La segunda secuencia de ácido nucleico
contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio
de dimerización. Un dominio de dimerización es una secuencia
peptídica que promueve la dimerización en las proteínas que lo
contienen. Prácticamente cualquier dominio de dimerización puede
ser utilizado en la construcción de ADN de la invención, por
ejemplo, hélices peptídicas, que contienen, al menos, una hélice, o
una estructura formada por una hélice, una vuelta y otra hélice,
etc., estructuras de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil),
y, en general, cualquier secuencia peptídica que promueva la
dimerización en las proteínas que la contengan. En una realización
particular, dicho dominio de dimerización comprende la cremallera de
leucina del factor de transcripción GCN4 de levadura.
La tercera secuencia de ácido nucleico
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la
\alpha-hemolisina (HlyA) de E. coli o para
un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de
reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador
de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que
codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que
codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un
fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del
mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E.
coli. La señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del
sistema transportador de Hly de E. coli parece estar
comprendida en el extremo carboxilo terminal
(C-terminal), concretamente dentro de los últimos
60 aminoácidos de HlyA. La secuencia de aminoácidos y nucleótidos
de la HlyA de E. coli puede obtenerse de GeneBank, número de
acceso M10133, donde también puede obtenerse la secuencia de
nucleótidos de aminoácidos de Hlyb y HlyD. En una realización
particular, dicha tercera secuencia de ácido nucleico está
constituida por la secuencia de nucleótidos que codifica para la
HlyA de E. coli. En otra realización particular, dicha
tercera secuencia de ácido nucleico comprende un fragmento de la
HlyA de E. coli que contiene la señal de reconocimiento del
mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E.
coli, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica para
los 60 últimos aminoácidos del extremo C- terminal de HlyA de E.
coli. En este caso, dicha tercera secuencia de ácido nucleico
está constituida por, o comprende, la secuencia de nucleótidos que
codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo
C-terminal de HlyA de E. coli.
En una realización concreta de la invención,
dicha tercera secuencia de ácido nucleico contiene la secuencia de
nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1 que codifica para un
péptido de aproximadamente 23 kDa del extremo carboxilo terminal de
HlyA de E. coli cuya secuencia de aminoácidos se muestra en
la SEQ ID NO: 2.
En general, el dominio de dimerización no se
fusiona directamente al gen que codifica el producto de interés
sino que es ventajoso introducir un péptido espaciador (flexible)
entre el extremo del gen que codifica para el producto de interés y
el comienzo del dominio de dimerización. Por tanto, si se desea, la
construcción de ADN de la invención también puede contener, además,
una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica para un
péptido espaciador situada entre dichas primera y segunda
secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha cuarta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha
primera secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha cuarta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico. De esta manera, la secuencia
codificante del producto de interés está unida al dominio de
dimerización mediante un péptido espaciador. Ventajosamente, dicho
péptido espaciador es un péptido con flexibilidad estructural.
Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede
ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede
contener repeticiones de restos de aminoácidos, tales como
Gly-Gly-Gly-Ser, o
cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien
la región bisagra de un anticuerpo. En una realización particular,
dicho péptido espaciador flexible comprende la región bisagra de un
anticuerpo y la construcción de ADN de la invención contiene la
secuencia codificante para dicho péptido flexible. En una
realización concreta de la invención, dicha cuarta secuencia de
ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos identificada
como SEQ ID NO: 3 que codifica para un péptido de 10 aminoácidos que
comprende la región bisagra de un anticuerpo cuya secuencia de
aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 4.
Para facilitar el aislamiento y purificación del
péptido o proteína de fusión obtenida mediante la presente
invención, la construcción de ADN de la invención puede contener,
si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un
péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
purificación del péptido o proteína de fusión. Por tanto, en una
realización particular, la construcción de ADN de la invención
contiene, si se desea, una quinta secuencia de ácido nucleico
que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines
de aislamiento o purificación.
Prácticamente cualquier péptido o secuencia
peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o
proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia
de polihistidina, una secuencia peptídica reconocida por un
anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína
de fusión resultante por cromatografia de inmunoafinidad, por
ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E,
FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and
David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New Cork.
Capítulo: Tagging proteins. pp. 347-377] y, en
general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo.
Dicha quinta secuencia de ácido nucleico puede
estar situada en cualquier posición de la construcción de ADN de la
invención excepto en la región correspondiente al extremo
C-terminal de HlyA ya que, en ese caso, rompería la
señal de secreción. A modo ilustrativo, dicha quinta secuencia de
ácido nucleico podría estar situada entre dichas segunda y tercera
secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha
quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de
dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha
quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de
dicha tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dicha
quinta secuencia de ácido nucleico podría estar situada en la
región correspondiente al extremo N-terminal de la
proteína de fusión resultante o entre el producto de interés y el
dominio de dimerización.
Para facilitar el reconocimiento de la proteína
o péptido de fusión obtenido, la construcción de ADN de la
invención también puede contener, si se desea, una sexta
secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido
susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento.
Prácticamente cualquier péptido o secuencia
peptídica que permita el reconocimiento del péptido o proteína de
fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia peptídica
reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para
reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografía de
inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como
c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra
secuencia reconocida por un anticuerpo.
Dicha sexta secuencia de ácido nucleico puede
estar situada en cualquier posición de la construcción de ADN de la
invención excepto en la región correspondiente al extremo
C-terminal de HlyA para evitar que se rompa la señal
de secreción. A modo ilustrativo, dicha sexta secuencia de ácido
nucleico podría estar situada entre dichas segunda y tercera
secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unida al extremo 3' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dicha sexta
secuencia de ácido nucleico podría estar situada en la región
correspondiente al extremo N-terminal de la proteína
de fisión resultante o entre el producto de interés y el dominio de
dimerización.
Dichas quinta y sexta secuencias de ácido
nucleico pueden estar separadas entre si. Alternativamente, en una
realización particular, dichas quinta y sexta secuencias de ácido
nucleico pueden estar unidas entre sí. En este caso, a modo
ilustrativo, dicha sexta secuencia de ácido nucleico que codifica
para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de
reconocimiento puede estar situada entre dichas tercera y quinta
secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha
quinta secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dichas
secuencias pueden estar unidas entre sí en el orden inverso, en
cuyo caso, dicha sexta secuencia de ácido nucleico que codifica
para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de
reconocimiento está situada entre dichas segunda y quinta
secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 3' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 5' de dicha sexta
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha
quinta secuencia de ácido nucleico.
Si se desea, la construcción de ADN de la
invención puede contener, además, una secuencia de nucleótidos que
codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser
escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos con el
fin de liberar el producto de interés una vez aislada la proteína de
fisión. En este caso, la construcción de ADN de la invención puede
incluir, además, una séptima secuencia de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una
secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida
específicamente por medios enzimáticos o químicos. Prácticamente
cualquier secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida
específicamente por medios enzimático o químicos puede ser
utilizada. En una realización particular, dicha séptima secuencia
de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica para un sitio de reconocimiento de una proteasa, por
ejemplo, una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa,
Glu-C endoproteasa, Lys-C
endoproteasa, Factor de coagulación Xa y similares. En otra
realización particular, dicha séptima secuencia de ácido nucleico
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio
susceptible de ser específicamente escindido por un reactivo
químico tal como, por ejemplo, bromuro de cianógeno que escinde
restos de metionina o cualquier otro reactivo químico
apropiado.
Dicha séptima secuencia de ácido nucleico se
encuentra, generalmente, a continuación del extremo 3' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para el dominio de
dimerización de manera que por medios enzimáticos o químicos se
pueda escindir la proteína dimérica.
La construcción de ADN de la invención puede
obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular
cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3] Dicha
construcción de ADN de la invención puede incorporar,
operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión ,
constituyendo de este modo un cassette de expresión.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un cassette de expresión que comprende la construcción
de ADN de la invención operativamente unida a una secuencia de
control de expresión . Las secuencias de control son secuencias que
controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción
del producto de interés, e incluyen secuencias promotoras (pT7,
plac, pBAD, ptet, etc.), secuencias codificantes para
reguladores transcripcionales (laCI, tetR, araC, etc.),
secuencias de unión a ribosomas (RBS), y/o secuencias terminadoras
de transcripción (t1t2, etc.), etc. En una realización
particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en
bacterias, en particular, en bacterias Gram negativas.
Ventajosamente, dicho cassette de expresión
comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o
para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora
transformada con dicho cassette de expresión. Ejemplos ilustrativos
de dichos marcadores que podrían estar presentes en el cassette de
expresión de la invención incluyen genes de resistencia a
antibióticos, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, kanamicina,
cloranfenicol, espectinomicina, etc., genes de resistencia a
compuestos tóxicos (telurito, mercurio, etc.).
La construcción de ADN de la invención, o el
cassette de expresión proporcionado por esta invención, pueden ser
insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se relaciona con un vector, tal como un vector de
expresión, que comprende dicha construcción de ADN o dicho cassette
de expresión. La elección del vector dependerá de la célula
hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de
ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede
ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula
hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La
obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok
et al., 1989, citado supra].
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una bacteria, en particular, una bacteria Gram negativa, que
comprende una construcción de ADN de la invención o un cassette de
expresión de la invención, en adelante bacteria de la invención.
Dicha bacteria debe tener el sistema exportador de hemolisina (Hly)
de E. coli para lo cual, si no lo tiene de forma nativa, se
debe proporcionar dicho sistema a la bacteria transformándola con
un vector que contenga los genes HlyB y HlyD, por ejemplo, el
plásmido pVDL9.3 [Fernández, L.A. et al., Applied and
Environmental Microbiology, Nov. 2000, 5024-5029].
Prácticamente cualquier bacteria Gram negativa, por ejemplo, E.
coli, Salmonella tiphymurium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
putida, etc., puede ser transformada con la construcción de ADN
de la invención o con el cassette de expresión de la invención.
Para ello, las señales promotoras, reguladoras, marcadoras y
origenes de replicación deben ser optimizados para cada especie
bacteriano. En una realización particular, dicha bacteria Gram
negativa es Escherichia coli.
La construcción de ADN de la invención puede ser
utilizada para producir productos de interés. Por tanto, en otro
aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un
producto de interés, en forma de una proteína de fusión dimérica,
que comprende crecer una bacteria de la invención bajo condiciones
que permiten la producción y excreción al medio de cultivo de dicho
producto de interés en forma de una proteína de fusión dimérica.
Las condiciones para optimizar el cultivo de la bacteria de la
invención dependerán de la bacteria utilizada.
Si se desea, el método para producir un producto
de interés proporcionado por esta invención incluye, además, el
aislamiento y purificación de dicha proteína de fusión dimérica. En
este caso, la construcción de ADN de la invención incluye, además,
dicha séptima secuencia de ácido nucleico previamente definida que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una
secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida
específicamente por medios enzimáticos o químicos con el fin de
liberar el producto de interés una vez aislada la proteína de
fusión. En una realización particular, dicha secuencia de
nucleótidos codifica para un sitio de reconocimiento de una
proteasa, por ejemplo, una enteroquinasa, Arg-C
endoproteasa, Glu-C endoproteasa,
Lys-C endoproteasa, Factor de coagulación Xa y
similares. En otra realización particular, dicha secuencia de
nucleótidos codifica para un sitio susceptible de ser
específicamente escindido por un reactivo químico tal como, por
ejemplo, bromuro de cianógeno que asciende restos de metionina o
cualquier otro reactivo químico apropiado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de la
secuencia de ácido nucleico contenida en la construcción de ADN de
la invención, caracterizada porque cada monómero comprende:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de la HlyA de E. coli o de un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli;
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de dimerización; y
- (iii)
- la secuencia de aminoácidos de un producto de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma más concreta, cada monómero de la
proteína de fusión dimérica de la invención comprende
- (i)
- la secuencia completa de aminoácidos de HlyA de E. coli, o alternativamente, un fragmento de HlyA de E. coli que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli
- (ii)
- un dominio de dimerización, tal como una hélice peptidica, una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil), o, en general, cualquier secuencia peptídica que promueva la dimerización en las proteínas que la contengan. En una realización particular, dicho dominio de dimerización comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción GCN4 de levadura; y
- (iii)
- un producto de interés, por ejemplo, una enzima, un inhibidor enzimático, una hormona, una molécula implicada en la adhesión y/o señalización celular y compuesta por dominios, por ejemplo, una inmunoglobulina, un antígeno inmunogénico, tal como una proteína o un fragmento antigénico de la misma procedente de un patógeno, por ejemplo, de un patógeno viral, bacteriano, de un parásito, etc., que puede causar infecciones en seres humanos o animales, un agente terapéutico, por ejemplo, un antígeno específico de tumor. un antígeno de una enfermedad auto-inmune, etc., o una molécula inmunoreguladora, por ejemplo, un factor de crecimiento, una citoquina, tal como una interleuquina, un interferón, etc.; en una realización particular, dicho producto de interés es un minianticuerpo susceptible de ser utilizado con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación.
Cada monómero de La proteína de fusión dimérica
de la invención también puede contener, si se desea, (a) un péptido
espaciador entre el producto de interés y el dominio de
dimerización; ventajosamente, dicho péptido espaciador es un péptido
con flexibilidad estructural, por ejemplo, un péptido que contiene
repeticiones de restos de aminoácidos, tales como
Gly-Gly-Gly-Ser, o
cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien
la región bisagra de un anticuerpo; en una realización particular,
dicho péptido espaciador flexible comprende la región bisagra de un
anticuerpo; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o
purificación del péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una
secuencia de polihistidina, o una secuencia peptidica reconocida
por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografia de inmunoafinidad,
por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc,
HA, E, FLAG, y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por
un anticuerpo; y/o (c) un péptido que permita el reconocimiento del
péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia peptidica
reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para
reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografia de
inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como
c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra
secuencia reconocida por un anticuerpo; y/o (d) una secuencia de
aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios
enzimáticos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que
constituye un sitio de reconocimiento de una proteasa, por ejemplo,
una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa,
Glu-C endoproteasa, Lys-C
endoproteasa, Factor de coagulación Xa y similares, o una secuencia
de aminoácidos susceptible de ser específicamente escindida por un
reactivo químico tal como, por ejemplo, bromuro de cianógeno y
similares.
El sistema de producción de proteínas de fusión
diméricas proporcionado por esta invención es particularmente útil
para la producción de proteínas implicadas en una actividad de
unión, por ejemplo, en las interacciones
proteína-ADN o antígeno-anticuerpo,
puesto que puede intensificar su avidez.
Una ventaja del sistema proporcionado por esta
invención radica en que permite producir proteínas tóxicas para un
huésped bacteriano que, de no ser por ese sistema, no se podrían
expresar en dicho huésped bacteriano debido a su toxicidad. Como es
conocido, la expresión por métodos recombinantes de proteínas
tóxicas para un huésped bacteriano es muy complicada o
prácticamente imposible cuando dicha proteína tóxica expresada no
es exportada desde la bacteria hacia el exterior. Con el método
proporcionado por esta invención se puede expresar una proteína
tóxica o previamente inexpresable, o expresada a bajos niveles,
para producir la proteína deseada en cantidades utilizables.
El siguiente ejemplo ilustra la invención sin
que deba ser considerado como limitativo del alcance de la
misma.
En este ejemplo se describe la secreción de
minianticuerpos diméricos en sobrenadantes de cultivos de E.
coli que emplean el sistema de transporte de hemolisina (Hly).
En primer lugar, se demostró que la dimerización puede conseguirse
por ingeniería genética en el sistema de transporte de la Hly. Para
ello se insertó una hélice a anfipática (es decir, el dominio de
cremallera de leucina del factor de transcripción de levaduras
GCN4) en el extremo N terminal de una versión marcad;
(E-tag) del dominio C terminal de 23 kDa de la
hemolisina (EHlyA). Se comprobó que el polipéptido resultante
(ZEHlyA) se secretaba eficazmente por las células de E. coli
y se acumulaba en el medio de cultivo como un dímero estable.
Después se utilizaron los vectores derivados de 'EHlyA y 'ZEHlyA
para la secreción de los dominios V_{HH} de inmunoglobulinas
obtenidos de anticuerpos de camello. Se secretaron los híbridos VHH-
EHlyA y V_{HH}-ZEHlyA y se encontraron en el medio
extracelular como monómeros y dímeros, respectivamente. Cuando se
compararon con sus homólogos monoméricos, las moléculas diméricas
V_{HH}-ZEHlyA mostraron propiedades superiores de
unión a su antígeno relacionado, con un aumento de 10 veces en su
afinidad funcional (avidez). Este procedimiento permite obtener
fácilmente minianticuerpos V_{HH} monoméricos y diméricas con
alta avidez a partir de los sobrenadantes de cultivos de E.
coli, facilitando así la selección y la purificación de alto
rendimiento de clones de V_{HH} a partir de grandes
librerías.
Cepas bacterianas, crecimiento y condiciones
de inducción. Las cepas de E. coli K-12
empleadas eran DH5\alphaF' (supE44
\Delta(lacZYA-argF)U169
\Phi80(lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi1
relA1; Invitrogen) para la donación y la propagación de los
plásmidos y HB2151 (\Deltalac-pro, ara,
nal^{r}, thi, F'proAB lac1^{q} lzcZ\DeltaM15) [Carter,
P., H. Bedouelle, and G. Winter 1985. Improved oligonucleotide
site-directed mutagenesis using M13 vectors.
Nucleic Acids Res. 13:4431-4443] para la
expresión de proteínas. Las bacterias que contenían los plásmidos
indicados en cada caso se hicieron crecer a 30ºC en placas de agar
LB [Miller, J. H. 1992. A short course in bacterial
genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia
coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York] que contenía glucosa al 2% (p/v)
(para reprimir el promotor lac) y los antibióiticos
apropiados para la selección de plásmidos. Para la inducción de los
híbridos HlyA, se inocularon colonias individuales en el medio LB
líquido que contenía glucosa al 2% (p/v) y se hicieron crecer a
30ºC o a 37ºC hasta que a la densidad óptica a 600 nm (DO_{600 \
nm}) alcanzó un valor de 0,5 aproximadamente. En ese punto, las
bacterias se recogieron por centrifugación, se resuspendieron a la
misma densidad en LB que contenía
isopropil-1-tio-\beta-D-galactósido
(IPTG) 0,3 mM y se incubaron (a 30ºC o a 37ºC) con agitación (160
r.p.m.) durante un periodo de tiempo comprendido entre 4 y 16 h. Se
recogieron los sobrenadantes del cultivo tras la eliminación de las
células de E. coli por centrifugación (10.000xg, 10 min) y
se añadió 1/10 del volumen de tampón fosfato salino (PBS) 10X
concentrado [PBS: Na_{2}HPO_{4} 8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM,
KCl 3 mM, NaCl 137 mM, pH 7,0]. Los sobrenadantes del cultivo se
emplearon directamente para realizar inmunoensayos o se almacenaron
a -80ºC hasta su utilización. Los antibióticos añadidos al medio de
cultivo para la selección de plásmidos fueron la ampicilina (Ap;
150 \mug/ml) y el cloranfenicol (Cm; 30 \mug/ml).
Plásmidos y oligonucleótidos. Se
emplearon métodos estándar para la manipulación y el aislamiento
del ADN, la amplificación por PCR y la secuenciación del ADN
[Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G.
Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl 1994. Current Protocols in
Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York; Sambrook,
J., E. Fritsch, and T. Maniatis 1989. Molecular cloning. A
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York].
Los oligonucleótidos se obtuvieron de Sigma Genosys (Reino Unido) o
de Isogen Bioscience BV (Países Bajos). Los plásmidos pEHlyA
(Ap^{r}), pEHlyA2-SD (Ap^{r}) y pVDL9.3
(Cm^{r}) ya han sido descritos [Fernández, L. A., and V. De
Lorenzo 2001. Formation of disulphide bonds during secretion of
proteins through the periplasmic-independent type I
pathway Mol Microbiol. 40:332-46;
Fernández, L. A., I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo
2000. Specific secretion of active single-chain Fv
antibodies into the supernantants of Escherichia coli
cultures b y use of the hemolysin system Appl Environ Microbiol.
66:5024-5029; Tzschaschel, B. D., C. A.
Guzman, K. N. Timmis, and V. de Lorenzo 1996. An Escherichia
coli hemolysin transport system- based vector for the export of
polypeptides: Export of Shiga-like toxin IIeB
subunit by Salmonella typhimurium aroA. Nature
Biotechnology. 14:765-769]. El plásmido
pZEHlyA (Ap^{r}) se obtuvo insertando en el sitio único
SalI de pEHlyA un fragmento de ADN de 170 pb que codifica
para el dominio ZIP amplificado por PCR y digerido con SalI.
El mapa del plásmido pZEHlyA se muestra en la Figura 6. La
amplificación por PCR del dominio ZIP se llevó a cabo con la ADN
polimerasa Vent (New England Biolabs), usando como molde 1 ng de
pCLZIP (Codon Genetic Systems, GmbH), y como cebadores los
oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6,
que incorporaban dos sitios SalI flanqueando el producto
amplificado. El plásmido pZEHlyA2-SD (Ap^{r}) se
obtuvo insertando en el sitio único SalI de
pEHlyA2-SD el fragmento de ADN de 170 pb que
codifica para ZIP obtenido por digestión con SalI de
pZEHlyA. El mapa del plásmido pZEHlyA2-SD se muestra
en la Figura 7. Se seleccionó la orientación del fragmento de ADN
ZIP que producía una inserción interna en el dominio
C-HlyA marcado con E de pZEHlyA y
pZEHlyA2-SD tras la secuenciación del ADN. Los
fragmentos de ADN de aproximadamente 0,3 kb que codificaban para
los dominios V_{HH}, V_{amy} y V_{ttx}, se amplificaron por
PCR con la ADN polimerasa Vent, usando como molde 1 ng de los
fagémidos A100R3A2 (anti-\alpha- amilasa) o R3E5
(vacuna antitetánica), respectivamente, y como cebadores los
oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
Los productos amplificados de ADN que codifican
para V_{amy} y V_{ttx} contenían los sitios de restricción
flanqueantes NcoI y SfiI, lo que permitía su donación
en los mismos sitios de pEHlyA2-SD y
pZEHlyA2-SD, generando así pV_{amy}HlyA,
pV_{ttx}HlyA, pV_{amy}ZhlyA y pV_{ttx}ZHlyA. Los mapas de los
plásmidos pV_{amy}HlyA y pV_{amy}-ZhlyA se
muestran en las Figuras 8 y 9, respectivamente. Los fagémidos
A100R3A2 y R3E5 fueron proporcionados por el Dr. Hennie Hoogenboon
(Dyax Co., EE. UU.). Ambos fagémidos son derivados de pCANTAB6
(Cambridge Research Biochemicals) que contienen los dominios
V_{HH} de camélidos donados entre los sitios SfiI y
NotI.
Electroforesis e inmunotransferencia de
proteínas. Se llevó a cabo la electroforesis en geles de
dodecil sulfato sódico - poliacrilamida (SDS-PAGE)
usando geles de apilamiento al 4% y de separación al 10%
(acrilamida:bisacrilamida 29:1; Bio-Rad),
utilizando el sistema de electroforesis Miniprotean®
(Bio-Rat) y siguiendo los protocolos estándar
[Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G.
Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl 1994. Current Protocols in
Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York; Fraile, S.,
F. Roncal, L. A. Fernández, and V. de Lorenzo 2001. Monitoring
Intracellular Levels of XylR in Pseudomonas putida with a
Single-Chain Antibody Specific for
Aromatic-Responsive Enhancer-Binding
Proteins J Bacteriol. 183:5571-9]. Para la
inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron a una membrana
de difloruro de polivinilideno (Immobilon-P,
Millipore) usando un aparato de electroforesis por transferencia
semiseca (Bio-Rad). La membrana se bloqueó en
tampón MTP (leche desnatada al 3% p/v, Tween 20 al 0,1% v/v en PEAS)
y se detectaron los polipéptidos marcados con E con anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con peroxidasa (0,2
\mug/ml en tampón MTP; Amersham Bioscience). El conjugado
anticuerpo-POD unido se reveló mediante
quimioluminiscencia, ta; como ya se ha descrito [Fraile, S., F.
Roncal, L. A. Fernandez, and V. de Lorenzo 2001. Monitoring
Intracellular Levels of XylR in Pseudomonas putida with a
Single-Chain Antibody Specific for
Aromatic-Responsive Enhancer-Binding
Proteins J Bacteriol. 183:5571-9]. La
membrana se expuso a una película de rayos X
(X-OMAT®, Kodak) o a ChemiDoc®
(Bio-Rad) para la cuantificación por
quimioluminiscencia (software Quantity-one®;
Bio-Rad). Las concentraciones de los polipéptidos
HlyA marcados con E secretados presentes en los sobrenadantes del
cultivo de E. coli se determinaron por la intensidad de sus
bandas de proteínas correspondientes en geles de
SDS-poliacrilamida teñidos con plata [Ansorge,
W. 1985. Fast and sensitive detection of protein and DNA bands
by treatment with potassium permanganate J. Biochem. Biophys.
Methods. 11:13-20] y mediante
inmuno-transferencia usando anticuerpo monoclonal
anti-E marcado con POD. Se usaron diluciones
seriadas de scFvs marcados con E purificados, de concentración
conocida, como patrones en estos experimentos.
Entrecruzamiento de proteínas. Antes de
su incubación con el agente de entrecruzamiento bifuncional
glutarato de disuccinimidilo (DSG, 7.7 \ring{A} spacer; Pierce),
los polipéptidos de HlyA marcados con E presentes en los
sobrenadantes de los cultivos se equilibraron en el mismo volumen
de PBS por ultrafiltración a través de una membrana con punto de
corte de 10 kDa (Microcon 10, Millipore) que eliminó los compuestos
pequeños con grupos amino libres presentes en el medio de cultivo.
El entrecruzamiento se llevó a cabo durante 30 minutos a
temperatura ambiente añadiendo DBS 40 o 130 \muM a muestras de
proteínas de 50 \mul equilibradas en PBS. Tras esta incubación,
el agente de entrecruzamiento se inactivo con
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) durante 15 minutos y se
añadió un volumen de tampón de muestra SDS-PAGE 2X
concentrado [Fraile, S., F. Roncal, L. A. Fernandez, and V. de
Lorenzo 2001. Monitoring Intracellular Levels of XylR in
Pseudomonas putida with a Single-Chain
Antibody Specific for Aromatic-Responsive
Enhancer-Binding Proteins J Bacteriol.
183:5571-9]. Tras hervir durante 5 minutos,
se cargaron 10 \mul para el SDS-PAGE.
Cromatografía por exclusión de tamaño.
Los sobrenadantes del cultivo (aproximadamente 0,2 ml) que
contenían PBS 1X se mezclaron con 2 mg de proteína patrón de masa
conocida (disuelta en 60 \mul de H_{2}O) y se hicieron pasar a
través de una resina Bio-Gel A de 1,5m
(Bio-Rad) empaquetada en una columna de 1 m de
longitud y 1,5 cm de ancho (Bio-Rad). Los patrones
de filtración del gel (Bio-Rad) fueron la
tiroglobulina (PM 670.000), la gammablobulina bovina (PM 158.000),
la ovoalbúmina de pollo (PM 44.000), la mioglobina equina (PM
17.000) y la vitamina B-12 (PM 1.350). La velocidad
de flujo de la muestra a través de la columna se fijó a 0,2 ml/min
usando una bomba peristáltica (P-1, Amersharn
Bioscience). El volumen de vacío de la columna se calculó mediante
la elución de azul de dextrano 2000 (Amersham Bioscience). La
elución de los patrones de proteínas a través de la columna se
monitorizó mediante absorción de luz UV (Uvicord S II, Amersham
Bioscience). Se recogieron fracciones de 1 ml (colector RediFrac,
Amersham Bioscience) y se concentraron 10 veces mediante
precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v) y 10
\mug de albúmina sérica bovina (BSA, Roche) que actuaba como
transportador. La presencia de proteínas HlyA marcadas con E en
estas fracciones se detectó por Western blot utilizando un
anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (véase
más arriba).
\newpage
Ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima
(ELISA). Los antígenos (\alpha-amilasa u
ovoalbúmina; Sigma) se adsorbieron durante 1 h a 37ºC a inmunoplacas
de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb, Nunc) a 200 \mug/ml
en PBS. Se lavó el exceso de antígeno y las placas se bloquearon
durante 16 h a 4ºC en tampón MTP (véase anteriormente). Los
minianticuerpos se diluyeron en tampón MTP, se añadieron a los
pocillos a las concentraciones indicadas en cada caso y se incubaron
durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los anticuerpos
no unidos se eliminaron mediante cuatro lavados de los pocillos con
PBS que contenía Tween 20 al 0,1% (v/v). El conjugado anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con POD (0,2 \mug/ml en
tampón MTP) se añadió a los pocillos y se incubó adicionalmente
durante 1 h a temperatura ambiente para detectar los
minianticuerpos unidos marcados con E. Tras lavar como antes, las
placas se revelaron usando o-fenilenediamina (Sigma). Se dejó
continuar la reacción durante 10 minutos en oscuridad, se paró con
HCl 0,6 N y se determinó la DO a 490 nm de los pocillos (lector de
microplacas Benchmark, Bio-Rad).
Dimerización por ingeniería genética de la
señal de secreción de HlyA. En primer lugar, se investigó si la
dimerización de C-HlyA podría realizarse por
ingeniería genética sin afectar a su secreción. Se seleccionó un
corto dominio de unos 6 kDa aproximadamente, denominado ZIP, que se
había utilizado para la dimerización de scFvs en el periplasma de
E. coli [Kerschbaumer, R. J., S. Hinschl, A. Kaufmann, M.
Ibl, R. Koenig, and G. Himmler 1997.
Single-chain Fv fusion proteins suitable as coating
and detecting reagents in a double antibody sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay Anal Biochem.
249:219-27; Pack, P., and A. Plückthun
1992. Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce
functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity
in Escherichia coli Biochemistry.
31:1579-84] para su inserción en
C-HlyA. El dominio ZIP consta de una hélice
anfipática que forma la cremallera de leucina del factor de
transcripción de levaduras GCN4, flanqueado en su extremo N
terminal por una zona bisagra peptídica derivada de la IgG3 del
ratón, y en su extremo C terminal por un marcador de polihistidina
(Sxhis). Se insertó un fragmento de ADN que codificaba para el
dominio ZIP internamente cerca del extremo N terminal de la versión
de aproximadamente 27 kDa marcada con E de C-HlyA
(EHlyA) presente en el plásmido pEHlyA (Figura 1A). El plásmido
resultante, pZEHlyA, codifica para un polipéptido de
aproximadamente 33 kDa (denominado ZEHlyA) que contiene los
dominios ZIP y C-HlyA marcados con E (Figuras 1A y
1B).
La producción de ZEHlyA y EHlyA, como control
sin ZIP, se indujo en cultivos de células TolC+ de tipo salvaje de
E. coli (por ejemplo, la cepa HB2151) que llevaban pVDL9.3,
que codifica para HlyB y HlyD, y que alojaban pZEHlyA o pEHlyA,
respectivamente. Como se muestra en la Figura 1C, se encontraron
ambos polipéptidos en niveles similares (aproximadamente 10
\mug/ml) en los sobrenadantes de los cultivos de E. coli
crecidos a 37ºC tras la inducción de 4 h con IPTG 0,3 mM. Estas
proteínas se detectaron en virtud del péptido marcado con E
incorporado en sus secuencias con anticuerpo monoclonal
anti-E marcado con POD (Métodos). La secreción de
ambos polipéptidos derivados de HlyA fue específica y dependiente
de la expresión de los componentes HlyB y HlyD por E. coli
(datos no mostrados) [Fernández, L. A., and V. De Lorenzo
2001. Formation of disulphide bonds during secretion of proteins
through the periplasmic-independent type I pathway
Mol Microbiol. 40:332-46]. Este resultado
indicaba que la presencia del dominio de dimerización ZIP no tenía
efecto en la eficacia de la exportación de la señal de
C-HlyA.
A continuación, se investigó el estado de
oligomerización d los polipéptidos secretados. Se incubaron
muestras de alícuotas que contenía los polipéptidos secretados
EHlyA o ZEHlyA con el agente de entrecruzamiento bifuncional
glutarato de disuccinimidilo (DSG) y luego se sometieron a
SDS-PAGE desnaturalizante y a inmunotransferencia
con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD
(Métodos). En este experimento, sólo se entrecruzaron las muestras
de ZEHlyA a baja concentración de DSG (40 \muM) para formar una
banda de proteínas con una masa molecular (Mr) aparente de
aproximadamente 66 kDa (Figura 2, carril 5), lo que estaba de
acuerdo con el tamaño esperado para un dímero de ZEHlyA. La
concentración más elevada de DSG (130 \muM) intensificó la
intensidad de la banda correspondiente a ZEHlyA dimérico (Figura 2,
carril 6) mientras que sólo tenía una reactividad menor sobre EHlyA
control (Figura. 2, carril 3).
También se demostró la dimerización de ZEHlyA
mediante cromatografia por exclusión de tamaño. Se separaron
muestras de alícuotas de sobrenadantes de cultivos que contenían
EHlyA o ZEHlyA secretados en una columna de filtración en gel, con
un límite de exclusión de 1.500 kDa, junto con proteínas de masa
conocida utilizadas como patrones (Métodos). Como se muestra en la
Figura 3A, ZEHlyA mostró una Mr aparente de aproximadamente 66 kDa
en la cromatografia de filtración en gel, mientras que EHlyA tuvo
una Mr aparente de aproximadamente 32 kDa en las mismas
condiciones. Es importante que se detectara un único pico para cada
proteína (Figura 3B), lo que indica que ambos polipéptidos estaban
presentes como monómeros (EHlyA) y dímeros (ZEHlyA) estables en
disolución. Considerados juntos, estos resultados demostraron que
podría obtenerse la dimerización de proteínas mediante la
incorporación de hélices anfipáticas en C-HlyA sin
interferir con su secreción por el transportador de Hly.
Secreción de minianticuerpos diméricos por el
sistema de la Hly de E. coli . A la vista de los
resultados previamente obtenidos se procedió a estudiar si los
fragmentos de anticuerpos diméricos podían secretarse mediante el
sistema de la Hly. En primer lugar, se construyó un plásmido,
denominado pZEHlyA2-SD, para generar fusiones
internas entre los fragmentos de anticuerpos recombinantes que
carecen del dominio N-SP y ZEHlyA. Este plásmido es
un derivado de pEHlyA2-SD [Fernández, L. A., L
Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion
of activé single-chain Fv antibodies into the
supernantants of Escherichia coli cultures by use of the
hemolysin system Appl Environ Microbiol.
66:5024-5029] en el que se insertó un
fragmento de ADN que codifica para el dominio ZIP en un único sitio
SalI, entre la secuencia de poliunión y el dominio
C-HlyA marcado con E (Métodos). Se seleccionaron dos
anticuerpos de camello V_{HH}, frente a
\alpha-amilasa (amy) o la vacuna
antitetánica (ttx), para determinar su expresión como
híbridos con los restos 'EHlyA y 'ZEHlyA (Figuras 4A y 4B). El
empleo de anticuerpos de camello V_{HH} como pares de fusión se
debió a su pequeño tamaño (aproximadamente 15 kDa) y a su baja
tendencia a formar agregados de proteínas [Muyldermans, S.
2001. Single domain camel antibodies: current status J Biotechnol.
74:277-302; Plückthun, A., and P. Pack
1997. New protein engineering approaches to multivalent and
bispecific antibody fragments Immunotechnology.
3:83-105], lo que podría interferir con el
análisis de la dimerización obtenida por el dominio ZIP (véase
Discusión). Las células de E. coli HB2151 (pVDL9.3) se
transformaron con un plásmido que codificaba para el híbrido
V_{HH}-HlyA (pV_{amy}HlyA, pV_{amy}ZHlyA,
pV_{ttx}VHlyA o pV_{ttx}ZHlyA) y se indujeron 4 h por la adición
de IPTG 0,3 mM a los cultivos líquidos crecidos en LB a 30 ó 37ºC.
Los polipéptidos secretados V_{amy}HlyA y V_{amy}ZHlyA se
detectaron posteriormente en los sobrenadantes de los cultivos
correspondientes de E. coli por Western blot con anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con POD (Figura 4C). En
estas condiciones, la concentración final de V_{amy}HlyA y
V_{amy}ZHlyA fue de aproximadamente 2 \mug/ml a 37ºC, y se
redujo aproximadamente en 2 veces en los cultivos que crecieron a
30ºC. Resultados similares se obtuvieron con V_{ttx}HlyA y
V_{ttx}ZHlyA
(datos no mostrados).
(datos no mostrados).
El estado de oligomerización de los híbridos
V_{HH}-HlyA secretados se sometió a ensayo
mediante cromatografia de filtración en gel (Figura 4D). Muestras de
alícuotas de sobrenadantes de cultivos de E. coli que
contenían V_{amy}HlyA o V_{amy}ZHlyA se cargaron en una columna
de filtración en gel (límite de exclusión & 1.500 kDa), junto
con proteínas de masa conocida. A partir de sus perfiles de elución
puede deducirse (Figura 4D) que el híbrido V_{amy}HlyA tenía una
Mr aparente de aproximadamente 40 kDa, lo que estaba completamente
de acuerdo con la masa esperada para un monómero de este
polipéptido. Por el contrario, V_{amy}ZHlyA mostró una Mr aparente
de aproximadamente 95 kDa, que es aproximadamente el doble de la
masa esperada de su monómero (es decir, 47 kDa). Hay que mencionar
que la temperatura a la que se indujeron los cultivos de E.
coli (30ºC ó 37ºC) no tuvo ninguna influencia en el
comportamiento cromatográfico de estas muestras. Por lo tanto, la
secreción de los anticuerpos de camello V_{HH} monoméricos o
diméricos pueden producirse fusionándolos a los restos EHlyA o
ZEHlyA, respectivamente.
A continuación, se probó si la dimerización
mejoraba las propiedades de unión funcional de V_{amy}ZHlyA. Para
este fin, se comparó la unión a la \alpha-amilasa
de V_{amy}HlyA monomérico y de V_{amy}ZHlyA dimérico mediante
ELISA. En estos experimentos, se incubaron diluciones seriadas de
sobrenadantes de cultivos de E. coli que contenían
cantidades idénticas de V_{amy}HlyA o V_{amy}ZHlyA con placas de
ELISA recubiertas con \alpha-amilasa u
ovoalbúmina (como antígeno control). Tras el lavado, los
minianticuerpos unidos se detectaron con el conjugado anticuerpo
monoclonal anti-E marcado con POD y se realizó la
lectura a la DO_{490 \ nm} (Métodos). La unión especifica de la
\alpha-amilasa se demostró incubando estas placas
con V_{ttx}HlyA y V_{ttx}ZHlyA. En la Figura 5 se muestra el
resultado de un ELISA prototipo de estos experimentos. La unión
previa a ovoalbúmina (en todos los casos la DO_{490 \ nm} \leq
0,05) se ha sustraído de los valores presentados. Tal como se
indica, la molécula V_{amy}ZHlyA dimérica presentó una afinidad
funcional mayor frente a la \alpha-amilasa, que
V_{amy}HlyA monomérica. No se observó unión a
\alpha-amilasa con los derivados control de
V_{ttx} (Figura 5) ni con los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA (datos
no mostrados). En general, al menos se requirió una concentración
diez veces mayor de V_{amy}HlyA monomérico para lograr señales de
unión a la \alpha-amilasa similares a las
obtenidas con V_{amy}ZHlyA. Además, en la concentración de
saturación de ambos minianticuerpos (aproximadamente 0,5 \mug/ml)
la unión obtenida con V_{amy}ZHlyA alcanzó un nivel meseta
superior. Por tanto, la dimerización de V_{amy}ZHlyA induce un
efecto de avidez sobre este minianticuerpo que se refleja en una
mayor afinidad de unión funcional a su antígeno.
La dimerización es una propiedad que con
frecuencia se desea conseguir por ingeniería genética en las
proteínas cuando está implicada una actividad de unión (por
ejemplo, en las interacciones proteína-ADN o
antígeno-anticuerpo), puesto que puede intensificar
su afinidad funcional (avidez).
Este ejemplo ilustra la obtención por ingeniería
genética, por primera vez, de la dimerización de las proteínas
secretadas por el sistema de transporte de hemolisina de E.
coli y se ha empleado esa tecnología para producir
minianticuerpos de alta avidez derivados de los anticuerpos de
camello V_{HH}.
Los resultados obtenidos demuestran que la
incorporación de una hélice anfipática de autodimerización en el
extremo N terminal de C-HlyA no interfiere con la
secreción de Hly y permite la dimerización del polipéptido
secretado. Tal como se muestra, la dimerización puede intensificar
la avidez de la unión del polipéptido secretado derivado de
C-HlyA. Además, también puede tener otras
aplicaciones, como la asociación molecular de varios antígenos y/o
adyuvantes producidos por cepas bacterianas vivas, o la combinación
de diversas actividades biológicas para la generación de moléculas
biespecíficas (por ejemplo, la unión a un antígeno y el
reclutamiento del complemento).
El scFvs dimérico de alta avidez se ha producido
en el periplasma de las células de E. coli insertando
hélices anfipáticas en su extremo C terminal. Inicialmente parecía
sencillo probar si scFv dimérico podía secretarse fusionándolos a
'ZEHlyA. Sin embargo, la tendencia reconocida de scFvs a formar
dímeros y agregados de proteínas de elevado peso molecular indujo a
utilizar fragmentos más pequeños de anticuerpos. De hecho, cuando
se investigó el estado de oligomerización de un híbrido
scFv-HlyA (6AC3HlyA) mediante cromatografia de
filtración en gel, se encontró que forma un número discreto de
especies moleculares que difieren en su masa aparente [es decir, a
30ºC aproximadamente el 50% tenía la masa del monómero, Mr 55 kDa
aproximadamente, mientras que el resto tenía una Mr aparente de
aproximadamente 115, aproximadamente 170 e igual o superior a 350
kDa (datos no publicados)].
\newpage
Los anticuerpos de camello V_{HH} han recibido
mucha atención debido a su mejor solubilidad y a su estructura más
simple, lo que facilita su amplificación y clonaje. Merece la pena
destacar que los cambios efectuados no disminuyen la afinidad ni la
especificidad de los anticuerpos de camello V_{HH}, debido a la
presencia de regiones determinantes de la complementaridad (CDR)
extremadamente variables que compensan la pérdida de diversidad
provocada por la ausencia de un dominio V_{L}. Los anticuerpos de
camello también han demostrado un potencial extraordinario como
inhibidores enzimáticos puesto que sus grandes CDR pueden alcanzar
los sitios activos escondidos en las enzimas. Además, la similitud
entre los anticuerpos de camello V_{HH} y las secuencias de la
familia VH3 humana está permitiendo la ,generación de librerías
presentadas en fagos de los dominios V_{H} humanos camelizados y
de los anticuerpos de camello V_{HH} humanizados.
Los beneficios expuestos anteriormente motivaron
a los inventores a utilizar los dominios V_{HH} para su secreción
por el translocador de hemolisina de E. coli. Los resultados
obtenidos muestran que los anticuerpos de camello funcionales, tanto
en la forma monomérica como en la dimérica, pueden recuperarse de
los sobrenadantes del cultivo de E. coli a niveles similares
a los obtenidos en su expresión periplásmica (aproximadamente 1
mg/litro de cultivo a
D.O._{600 \ nm} =1). Además, la dimerización provocada por ZEHlyA indujo un aumento de diez veces en la afinidad funcional de V_{amy}. Este valor está dentro del intervalo esperado producido por el cambio de anticuerpos monovalentes a divalentes. En conclusión, estos datos demuestran que el sistema de secreción de Hly puede emplearse para la secreción 1 de polipéptidos y minianticuerpos diméricos de alta avidez. La simplicidad de esta tecnología puede ser extremadamente útil para la selección de alto rendimiento de las librerías de anticuerpos.
D.O._{600 \ nm} =1). Además, la dimerización provocada por ZEHlyA indujo un aumento de diez veces en la afinidad funcional de V_{amy}. Este valor está dentro del intervalo esperado producido por el cambio de anticuerpos monovalentes a divalentes. En conclusión, estos datos demuestran que el sistema de secreción de Hly puede emplearse para la secreción 1 de polipéptidos y minianticuerpos diméricos de alta avidez. La simplicidad de esta tecnología puede ser extremadamente útil para la selección de alto rendimiento de las librerías de anticuerpos.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sistema para la producción de
proteínas diméricas basado en el sistema de transporte de
hemolisina de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región bisagra de anticuerpo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtccgaag ccttccactc cgcccgggtc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Región bisagra de anticuerpo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\sa{Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador
BACKHINGE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcgacgt ccggcggtcc gaagccttcc act
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador FORHIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcgacgc atggtgatgg tgatggtgac cacc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador VHHA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgcggcc cagccggcca tggctcaggt gcagctggtg gagtctt
\hfill47
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211>47
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador
VHHASfi1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcgacgcg gcccccgagg ccgttgagga gacggtgacc tgggtccc
\hfill48
Claims (43)
1. Una construcción de ADN caracterizada
porque comprende:
- a)
- una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante;
- b)
- una segunda secuencia de ácido nucleico que cor tiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y
- c)
- una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la \alpha-hernolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli;
en donde el extremo 3' de dicha primera
secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de
dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
2. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque dicho péptido o proteína susceptible
de ser expresado de forma recombinante se selecciona entre enzimas,
inhibidores enzimáticos, hormonas, moléculas implicadas en la
adhesión y/o señalización celular y compuesta por dominios,
antígenos inmuiogénicos, agentes terapéuticos, y moléculas
inmunoreguladoras.
3. Construcción de ADN según la reivindicación
2, caracterizada porque dicho antígeno inmunogénico o
molécula inmunoreguladora se selecciona entre antígenos específicos
de tumor, antígenos de enfermedades auto-inmune,
factores de crecimiento, citoquinas, interleuquinas, interferones y
minianticuerpos.
4. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque dicho dominio de dimerización
comprende una hélice peptídica o una estructura de doble
arrollamiento helicolidal (coiled coil).
5. Construcción de ADN según la reivindicación
4, caracterizada porque dicho dominio de dimerización
comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción GCN4
de levadura.
6. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque dicha tercera secuencia de ácido
nucleico comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la
\alpha-hemolisina (HlyA) de E. coli o para
un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de
reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador
de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que
codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que
codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un
fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del
mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E.
coli.
7. Construcción de ADN según la reivindicación
6, caracterizada porque dicha tercera secuencia de ácido
nucleico se selecciona entre:
- a)
- la secuencia de nucleótidos que codifica para la HlyA de E. coli;
- b)
- una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C-terminal de HlyA de E. coli;
- c)
- una secuencia de ácido nucleico constituida por una secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C-terminal de HlyA de E. coli;
- d)
- la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1; y
- e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 2.
8. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque comprende, además, una cuarta
secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido
espaciador situada entre dichas primera y segunda secuencias de
ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha cuarta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha primera secuencia
de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha cuarta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia
de ácido nucleico.
9. Construcción de ADN según la reivindicación
8, caracterizada porque dicho péptido espaciador comprende
repeticiones de restos de aminoácidos, preferentemente,
repeticiones
Gly-Gly-Gly-Ser.
10. Construcción de ADN según la reivindicación
8, caracterizada porque dicho péptido espaciador es una
región bisagra de un anticuerpo.
11. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque comprende, además, una quinta
secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido
susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
purificación.
12. Construcción de ADN según la reivindicación
11, caracterizada porque dicho péptido susceptible de ser
utilizado con fines de aislamiento o purificación comprende una
secuencia de polihistidina o una secuencia peptidica reconocida por
un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografia de
inmunoafinidad.
13. Construcción de ADN según la reivindicación
11, caracterizada porque dicha quinta secuencia de ácido
nucleico está situada entre dichas segunda y tercera secuencias de
ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha quinta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia
de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha quinta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia
de ácido nucleico.
14. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque comprende, además, una sexta
secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido
susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento.
15. Construcción de ADN según la reivindicación
14, caracterizada porque dicho péptido susceptible de ser
utilizado con fines de reconocimiento comprende una secuencia
peptidica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir
para reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografia
de inmunoafinidad.
16. Construcción de ADN según la reivindicación
15, caracterizada porque dicho péptido susceptible de ser
utilizado con fines de reconocimiento comprende la secuencia del
epítopo E.
17. Construcción de ADN según la reivindicación
14, caracterizada porque dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está situada entre dichas segunda y tercera secuencias de
ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia
de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de
ácido nucleico.
18. Construcción de ADN según la reivindicación
11 ó 14, caracterizada porque dichas quinta y sexta
secuencias de ácido nucleico están separadas entre sí.
19. Construcción de ADN según la reivindicación
11 ó 14, caracterizada porque dichas quinta y sexta
secuencias de ácido nucleico están unidas entre si.
20. Construcción de ADN según la reivindicación
19, caracterizada porque dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está situada entre dichas tercera y quinta secuencias de
ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha quinta secuencia
de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de
ácido nucleico.
21. Construcción de ADN según la reivindicación
19, caracterizada porque dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está situada entre dichas segunda y quinta secuencias de
ácido nucleico, en donde el extremo 3' de dicha sexta secuencia de
ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha quinta secuencia
de ácido nucleico y el extremo 5' de dicha sexta secuencia de ácido
nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de
ácido nucleico.
22. Construcción de ADN según la reivindicación
1, caracterizada porque comprende, además, una séptima
secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos
susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos
o químicos.
23. Construcción de ADN según la reivindicación
22, caracterizada porque dicha séptima secuencia de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para
un sitio de reconocimiento de una proteasa.
24. Construcción de ADN según la reivindicación
23, caracterizada porque dicha proteasa se selecciona entre
una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa,
Glu-C endoproteasa, Lys-C
endoproteasa y Factor de coagulación Xa.
25. Construcción de ADN según la reivindicación
22, caracterizada porque dicha séptima secuencia de ácido
nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para
un sitio susceptible de ser específicamente escindido por un
reactivo químico.
26. Construcción de ADN según la reivindicación
25, caracterizada porque dicho reactivo químico es bromuro
de cianógeno.
27. Construcción de ADN según la reivindicación
22, caracterizada porque dicha séptima secuencia de ácido
nucleico se encuentra a continuación del extremo 3' de dicha
segunda secuencia de ácido nucleico.
\newpage
28. Un cassette de expresión
caracterizado porque comprende una construcción de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 operativamente unida a una
secuencia de control de expresión.
29. Cassette de expresión según la
reivindicación 28, caracterizado porque dicha secuencia de
control de expresión comprende una secuencia promotora, una
secuencia codificante para reguladores transcripcionales, una
secuencia de unión a ribosomas (RBS) y/o una secuencia terminadora
de transcripción.
30. Cassette de expresión según la
reivindicación 28, caracterizado porque comprende, además,
un marcador.
31. Cassette de expresión según la
reivindicación 30, caracterizado porque dicho marcador
comprende un gen de resistencia a antibióticos o un gen de
resistencia a compuestos tóxicos.
32. Cassette de expresión según la
reivindicación 28, caracterizado porque dicha secuencia de
control de expresión es funcional en bacterias.
33. Una bacteria Gram negativa
caracterizada porque comprende una construcción de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o un cassette de expresión
según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32.
34. Bacteria según la reivindicación 33,
caracterizada porque se selecciona entre Escherichia
coli, Salmonella tiphymurium, Pseudomonas aeruginosa y
Pseudomonas putida.
35. Un método para producir un péptido o
proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante en
forma de una proteína de fusión dimérica, caracterizado
porque comprende crecer una bacteria según la reivindicación 33 ó
34 bajo condiciones que permiten la producción y excreción al medio
de cultivo de dicha proteína de fusión dimérica.
36. Método según la reivindicación 35,
caracterizado porque comprende, además, el aislamiento y
purificación de dicha proteína de fusión dimérica.
37. Método según la reivindicación 35 ó 36,
caracterizado porque el péptido o proteína susceptible de
ser expresado de forma recombinante de dicha proteína de fusión
dimérica se selecciona entre enzimas, inhibidores enzimáticos,
hormonas, moléculas implicadas en la adhesión y/o señalización
celular y compuesta por dominios, antígenos inmunogénicos, agentes
terapéuticos, y moléculas inmunoreguladoras.
38. Método según la reivindicación 37,
caracterizada porque el antígeno inmunogénico o molécula
inmunoreguladora del péptido o proteína susceptible de ser expresado
de forma recombinante de dicha proteína de fusión dimérica se
selecciona entre antígenos específicos de tumor, antígenos de
enfermedades auto-inmune, factores de crecimiento,
citoquinas, interleuquinas, interferones y minianticuerpos.
39. Una proteína de fusión dimérica
caracterizada porque se obtiene por expresión de la
secuencia de ácido nucleico contenida en una construcción de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
40. Proteína de fusión dimérica según la
reivindicación 39, caracterizada porque cada monómero
comprende:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de la \alpha-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli o de un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli;
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de dimerización; y
- (iii)
- la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante.
41. Proteína de fusión según la reivindicación
40, caracterizada porque cada monómero comprende:
- (i)
- la secuencia completa de aminoácidos de HlyA de E. coli, o un fragmento de HlyA de E. coli que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli;
- (ii)
- un dominio de dimerización, seleccionado entre una hélice peptídico y una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil); y
- (iii)
- un péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante seleccionado entre una enzima, un inhibidor enzimático, una hormona, una molécula implicada en la adhesión y/o señalización celular y compuesta por dominios, un antígeno inmunogénico, un agente terapéutico, una molécula inmunoreguladora, y un minianticuerpo.
42. Proteína de fusión según la reivindicación
40 ó 41, caracterizada porque cada monómero comprende,
además (a) un péptido espaciador entre el péptido o proteína
susceptible de ser expresado de forma recombinante y el dominio de
dimerización; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o
purificación del péptido o proteína de fusión; y/o (c) un péptido
que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión; y/o
(d) una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida
específicamente por medios enzimáticos o químicos.
43. Proteína de fusión según la reivindicación
42, caracterizada porque cada monómero comprende, (a) un
péptido que contiene repeticiones de
Gly-Gly-Gly-Ser o la
región bisagra de un anticuerpo; y/o (b) una secuencia de
polihistidina o una secuencia peptídica reconocida por un
anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína
de fusión resultante por cromatografia de inmunoafinidad; y/o (c)
una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y
que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante
por cromatografia de inmunoafinidad; y/o (d) una de aminoácidos que
constituye un sitio de reconocimiento d una enteroquinasa,
Arg-C endoproteasa, Glu-C
endoproteasa, Lys-C endoproteasa o Factor de
coagulación Xa o una secuencia de aminoácidos susceptible de ser
específicamente escindida por un reactivo químico.
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