CN109777827A - 一种激活Notch1信号通路的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种扩增Notch1基因部分片段的引物对，它包括具有如SEQ ID NO.5所示序列的引物；它还包括具有如SEQ ID NO.6或7所示序列的引物。本发明还提供了一种激活Notch1信号通路的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)使用前述引物PCR扩增模板DNA，得到PCR产物；2)将前述PCR产物连接到载体中；3)将载体转入动物或人类细胞；所述模板DNA是包含Notch1胞内结构域序列的DNA。本发明的引物可以扩增得到Notch1基因的部分片段，该片段能在细胞内大量表达，且能对下游的Hes1基因起到很好的激活作用。本发明的方法能有效激活Notch1信号通路。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种激活Notch1信号通路的方法。
背景技术
Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，它们调节从海胆到人等多种生物细胞的发育。Notch信号影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。
Notch1是Notch基因家族的成员，它由EGF-like重复区和一个包含多种结构域的胞内段(NICD)组成(图1)。Notch1蛋白经过三次剪切，可释放胞内段进入细胞质，再进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，活化Hes1等分化拮抗基因的转录。活化Notch1以激活下游Hes1等因子成为了相关研究包括抗癌药物研究中的一种手段。
直接将Notch1基因的胞内段转入细胞表达，是激活Notch1信号通路最直接的方法之一。但对具体区域的选取，对外源片段的转录、翻译以及蛋白产物的活性影响很大。目前尚未见相关的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种扩增Notch1基因部分片段的引物对，其中一条引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；其中另一条引物的序列包括如SEQ ID NO.2或4所示序列的反向互补序列。
进一步地，两条引物的序列分别还包括DNA内切酶位点序列。
进一步地，所述酶切位点为：EcoR1和HindIII的酶切位点。
前述的引物对中，其中至少1条引物的序列含有HA-tag序列。
更进一步地，其中一条引物的序列如SEQ ID NO.5所示；另一条引物的序列如SEQID NO.6或7所示。
本发明还提供了前述引物在激活Notch1信号通路中的用途。
本发明还提供了一种激活Notch1信号通路的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)使用权利要求1所述引物PCR扩增模板DNA，得到PCR产物；
2)将前述PCR产物连接到载体中；
3)将载体转入动物或人类细胞；
所述模板DNA是包含Notch1胞内段序列的DNA。
进一步地，步骤2)所述载体是pCMV-XL4载体。
进一步地，步骤3)所述细胞是人乙肝病毒感染的肝癌细胞。
本发明的引物可以扩增得到Notch1基因的部分片段，该片段能在细胞内大量表达，且能对下游的Hes1基因起到很好的激活作用。
本发明的方法能有效激活Notch1信号通路，可以广泛应用于抗癌药物的研究中，比如：激活Notch1信号通路构建恶性肿瘤模型。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是Notch1基因的结构图。
图2是Western blot检测图。
图3是Notch1 mRNA荧光定量统计图。
图4是Hes1 mRNA荧光定量统计图。
具体实施方式
实施例NICD及NICD-ΔPEST质粒转乙肝细胞
1.引物设计
1.1扩增区域选取
通过实验，选择了Notch1基因的第5543-7930号碱基(NICD区)以及第5543-6961号(NICD-ΔPEST区)碱基作为扩增区域。
1.2引物序列
NICD区和NICD-ΔPEST区的正向引物相同，反向引物不同。
为了方便载体构建，在正向引物(Forward)中加入EcoR1酶切位点，在反向引物(Reverse)中加入HindIII位点；为了方便后期检测是否成功***，还在Reverse中加入了HA-tag序列；另外，为了实现目的片段的高效、正确转录，还在Forward中加入了转录起始序列Kozac，在Reverse中加入了ATT序列(在反向互补后为终止密码子TAA)。引物的设计结构如下：
Forward：TAA(随机序列)GAATTC(EcoRl site)GCCGCC(Kozac sequence：转录起始序列)ATG(起始密码子)cggcggcagcatggccagctctggttc(靶序列，SEQ ID NO.1)；
NICD-Reverse的互补序列：atcgcccgcattccggaggccttcaag(靶序列，SEQ IDNO.2)TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT(HA-tag序列，SEQ ID NO.3)TAA(终止密码子)AAGCTT(HindIII site)ATT(随机序列)；
NICD-ΔPEST-Reverse的互补序列：agtctccgtccgtgcccctcaaccac(靶序列，SEQID NO.4)TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT(HA-tag序列，SEQ ID NO.3)TAA(终止密码子)AAGCTT(HindIII site)ATT(随机序列)。
具体引物序列如表1所示。
表1引物信息
2.质粒构建
1)扩增
使用Notch 1intracellular domain(NICD 1)-pcw107-V5质粒(addgene，美国)作为模板，分别使用表1所述引物扩增第一节所述NICD区和NICD-ΔPEST区序列。
2)连接载体
使用EcoR1/HindIII双酶切的pCMV-XL4载体与前述扩增序列连接，获得pCMV-XL4-NICD-HA和pCMV-XL4-NICDΔPEST-HA质粒，分别简称NICD质粒和NICD-ΔPEST质粒。
3.细胞实验
转染NICD及NICD-ΔPEST质粒进入人乙肝病毒感染的肝癌细胞(HepG2.2.15.7和HepAD38)后，提取细胞总蛋白和总RNA，实施western blot检测HA标记蛋白，实施qPCR实验检测Notch1以及Notch1靶基因Hes1的mRNA相对水平。
其中，对照组(control)为转入pCMV-XL4空载体的细胞。
4.结果
western blot结果如图2所示，使用HA抗体的印迹实验得到了具有HA-tag的NICD以及NICD-ΔPEST条带。
qPCR结果如图3和图4所示，转染NICD及NICD-ΔPEST质粒进入乙肝细胞后后都成功升高Notch1以及Notch1靶基因Hes1的mRNA的表达，其中Hes1的表达提高了约60％，表明Notch1信号通路得到有效激活。
综上，本发明的引物可以扩增得到Notch1基因的部分片段，该片段能在细胞内大量表达，且能对下游的Hes1基因起到很好的激活作用。本发明的方法能有效激活Notch1信号通路，在抗癌药物研究等Notch1通路相关研究中具有良好的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种激活Notch1信号通路的方法
<130> GY026-2018P013241CC
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggcggcagc atggccagct ctggttc 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcgcccgca ttccggaggc cttcaag 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacccatacg atgttccaga ttacgct 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtctccgtc cgtgcccctc aaccac 26
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
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taagaattcg ccgccatgcg gcggcagcat ggccagctct ggttc 45
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aataagcttt taagcgtaat ctggaacatc gtatgggtac ttgaaggcct ccggaatgcg 60
ggcgat 66
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aataagcttt taagcgtaat ctggaacatc gtatgggtag tggttgaggg gcacggacgg 60
agact 65
Claims (9)
1.一种扩增Notch1基因部分片段的引物对，其特征在于：其中一条引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；其中另一条引物的序列包括如SEQ ID NO.2或4所示序列的反向互补序列。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，两条引物的序列分别还包括DNA内切酶位点序列。
3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述酶切位点为：EcoR1和HindIII的酶切位点。
4.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，其中至少1条引物的序列含有HA-tag序列。
5.如权利要求1所述的引物对，其特征在于：其中一条引物的序列如SEQ ID NO.5所示；另一条引物的序列如SEQ ID NO.6或7所示。
6.权利要求1-5任一所述引物在激活Notch1信号通路中的用途。
7.一种激活Notch1信号通路的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)使用权利要求1-5任一所述引物PCR扩增模板DNA，得到PCR产物；
2)将前述PCR产物连接到载体中；
3)将载体转入动物或人类细胞；
所述模板DNA是包含Notch1胞内结构域序列的DNA。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)所述载体是pCMV-XL4载体。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)所述细胞是人乙肝病毒感染的肝癌细胞。
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2018
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