CN113234738A - 鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体及其构建方法和应用，该过表达载体为将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302‑ABA8ox3过表达载体，该过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建得到的pCAMBIA1302‑ABA8ox3拥有过表达ABA8ox3基因的能力，通过过表达ABA8ox3基因，直接调控鄞红葡萄果实中的内源ABA含量，使鄞红葡萄成熟期提前，从而其采摘期可绕开台风季，减少果农损失，在与其他水果或葡萄的同期竞争中赢得胜利，获得更高的商品价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
葡萄(学名：Vitis vinifera)是我国五大经济型果树之一，其果实具有丰富的营养价值、鲜甜独特的口感、多种食用方法，广受中国人民的喜爱。然而，在中国南方地区，由于受7-8月份季风性气候影响，导致葡萄果实的产量及品质受到损害，商品性降低。浙江省宁波市的主栽品种“鄞红”葡萄就受此影响。
ABA8’-羟化酶催化的羟基化作用可以分解代谢ABA(abscisic acid，脱落酸)，此反应是CYP707A基因家族编码。ABA在果实成熟过程中起主要调控作用，因此内源ABA含量的变化在一定程度上可实现葡萄果实的成熟期调控，即通过调控ABA8’-羟化酶的变化可以改变内源ABA的变化。近期已有研究表明，ABA8’-羟化酶基因在ABA大量合成时启动，在ABA合成降低时被抑制，证实了其在植物中对ABA的含量具有调控作用。
过表达是一项分子技术，其可以提升目的基因在规定的细胞组织中的表达水平，以实现调控细胞内源变化的可能。ABA8’-羟化酶已被证实与ABA含量有关，过表达鄞红葡萄ABA8ox3基因将会很大程度上实现鄞红葡萄的早熟调控。因此，为了加大市场竞争力，实现鄞红葡萄成熟期调控是提高产量的一项重要手段。鉴于此，本发明提出一种鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体的构建方法及应用，为今后的分子实验和鄞红葡萄产量提高打下基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体及其构建方法和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体，该过表达载体为将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***pCAMBIA1302原始载体的CaMV35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体，该过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建方法，通过克隆技术获得鄞红葡萄ABA8ox3基因，将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***设计好的pCAMBIA1302原始载体的可实现过表达的位点，实现pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建，具体包括以下步骤：
S1、鄞红葡萄ABA8ox3基因的编码区的克隆：
S1.1、提取鄞红葡萄果肉的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S1.2、从NCBI中搜索得到葡萄的ABA8ox3基因全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物ABA8ox3-F和ABA8ox3-R用于PCR扩增，其序列分别为：
ABA8ox3-F：ATGATTAATCTACCTAGG；
ABA8ox3-R：TTAAGGGGCACTCTTCTTGCTTT；
S1.3、以cDNA为模板，利用ABA8ox3-F和ABA8ox3-R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌T1感受态细胞；将转化后的大肠杆菌在37℃恒温箱培养12h；挑取单菌落，利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确后即获得鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段；
S2、pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计：
选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间的位置作为鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的引物***位点，在***位点的前后保持3倍数碱基对，先于pCAMBIA1302原始载体序列删除“catg”4个碱基，并在删除位置***鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段，替换pCAMBIA1302原始载体的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子，完成pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计；
S3、获得pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒：
S3.1、根据设计好的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，第一步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的起始密码子前选择10-15个碱基序列，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段删除的终止密码子后选择10-15个碱基序列；第二步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的头尾各选择15-20个碱基序列，与第一步中选择的碱基序列各自拼接后得到引物YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R，其序列分别为：
YB-ABA8ox3-F：GAACACGGGGGACTCTTGACATGATTAATCTACCTAGG；
YB-ABA8ox3-R：CCTTTACTAGTCAGATCTACTATGATATCCCTCTTCTTT；
S3.2、利用YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R对ABA8ox3基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为产物1，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.3、用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到产物2，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.4、将产物1与产物2遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒，其测序结果如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，步骤S3.4中，测序所用引物为p-F和p-R，其序列分别为：
p-F：TTACGACTCAATGACAAGAAGAAAA；
p-R：GTTTTCCGTATGTTGCATCACCTTC。
引物p-F和p-R可以验证目的片段是否已经与质粒进行连接，也可以进行测序看到完整结果。
鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体在调控鄞红葡萄成熟期中的应用，具体地，将pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体通过农杆菌介导转入鄞红葡萄果肉细胞后，实现鄞红葡萄ABA8ox3基因的过表达，以此调控鄞红葡萄果实中的内源ABA含量，获得成熟期提前的鄞红葡萄新品种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明构建得到鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体，该载体拥有过表达ABA8ox3基因的能力，通过过表达ABA8ox3基因，直接调控鄞红葡萄果实中的内源ABA含量，使鄞红葡萄果实不同发育时期的ABA含量发生变化，在ABA含量增加时，鄞红葡萄成熟期提前。成熟期的提前可以使鄞红葡萄的采摘期绕开台风季，减少果农损失，在与其他水果或葡萄的同期竞争中赢得胜利，获得更高的商品价值。本发明为过表达ABA8ox3、实现鄞红葡萄果实成熟期调控获得成熟期提前的鄞红葡萄新品种奠定基础。
(2)本发明在构建鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体过程中没有采用传统的***多克隆位点(MCS)，这是因为多克隆位点不一定会被表达，也不会具有荧光属性，具有不确定与不实用性。本发明根据pCAMBIA1302质粒本身的属性设计过表达位点，将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***点设计在pCAMBIA1302质粒的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间，该设计方案不同于传统的载体设计，可更直接地得到希望的过表达结果，且本发明设计的***方案不针对单条基因，只要是拥有目的片段基因，都可以使用。
附图说明
图1为鄞红葡萄ABA8ox3基因编码区的琼脂糖电泳图；
图2为pCAMBIA1302质粒单酶切的琼脂糖电泳图；
图3为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒验证琼脂糖电泳图；
图4为鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的引物***位点示意图；
图5为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒验证电泳图；
图6为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体，其特征在于，该过表达载体为将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体，该过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建方法，通过克隆技术获得鄞红葡萄ABA8ox3基因，将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***设计好的pCAMBIA1302原始载体的可实现过表达的位点，实现pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建，具体包括以下步骤：
S1、鄞红葡萄ABA8ox3基因的编码区的克隆：
S1.1、利用RNA提取试剂盒(天根，中国)提取鄞红葡萄果肉的RNA，获得RNA后采用NanoDrop2000微量核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher，USA)测定RNA浓度，采用DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪分析RNA完整性，鄞红葡萄ABA8ox3基因编码区的琼脂糖电泳图见图1；使用cDNA合成试剂盒(近岸，中国)将提取的RNA逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S1.2、从NCBI中搜索得到葡萄的ABA8ox3基因全长序列，选择其中的CDS编码区，利用Primer 5.0设计引物ABA8ox3-F和ABA8ox3-R并合成，用于PCR扩增，其序列分别为：
ABA8ox3-F：ATGATTAATCTACCTAGG；
ABA8ox3-R：TTAAGGGGCACTCTTCTTGCTTT；
S1.3、以cDNA为模板，采用PCR技术，利用ABA8ox3-F和ABA8ox3-R进行PCR扩增反应：使用2×Fast Pfu Master Mix(近岸，中国)对ABA8ox3进行扩增，PCR反应体系(50μL)为：cDNA 2μL、引物F/R(10μmol/L)各1μL、2×Fast Pfu Master 25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒(全是金，中国)对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌T1感受态细胞；将转化后的大肠杆菌在37℃恒温箱培养12h；挑取单菌落，利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确后即获得鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段；
S2、pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计：
使用Snapgene软件进行设计，根据pCAMBIA1302原始载体序列设计目的片段引物***位点，***位点后需同时满足两个条件：目的片段***后可以达到过表达的目的；在该载体通过农杆菌介导模式植物验证后，可通过亚细胞定位直接看到绿色荧光以此证明该目的片段通过该载体已被表达；选定市售pCAMBIA1302原始载体的可同时满足上述两个条件的CaMV35启动子和mgfp5荧光序列之间的位置作为鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的引物***位点，***位点示意图见图4；为了防止密码子错位突变，在***位点的前后保持3倍数碱基对，先于pCAMBIA1302原始载体序列删除“catg”4个碱基，并在删除位置***鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段，替换pCAMBIA1302原始载体的“catg”4个碱基，而后为保证目的片段后面的荧光序列发挥作用，删除目的片段的终止密码子，完成pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计；
S3、获得pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒：
S3.1、使用
PCR一步定向克隆试剂盒(近岸，中国)完成实验：根据设计好的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，第一步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的起始密码子前选择10-15个碱基序列，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段删除的终止密码子后选择10-15个碱基序列；第二步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的头尾各选择15-20个碱基序列，与第一步中选择的碱基序列各自拼接后得到引物YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R，其序列分别为：
YB-ABA8ox3-F：GAACACGGGGGACTCTTGACATGATTAATCTACCTAGG；
YB-ABA8ox3-R：CCTTTACTAGTCAGATCTACTATGATATCCCTCTTCTTT；
S3.2、利用YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R对ABA8ox3基因的目的片段进行巢式PCR反应：PCR反应体系(50μL)：ABA8ox3 2μL、引物F/R(10μmol/L)各1μL、2×Fast Pfu Master25μL、ddH2O 21μL，PCR反应程序为：94℃1min30s；94℃20s，60℃20s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保温，得到PCR产物；将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为产物1，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.3、用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切(Biolabs，美国，具体操作详见说明书)，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳(pCAMBIA1302质粒单酶切的琼脂糖电泳图见图2)，对目标条带进行回收，得到产物2，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.4、通过一步克隆说明书将产物1与产物2遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒，其测序结果如SEQID NO.1所示，其中，测序所用引物为p-F和p-R，其序列分别为：
p-F：TTACGACTCAATGACAAGAAGAAAA；
p-R：GTTTTCCGTATGTTGCATCACCTTC。
引物p-F和p-R可以验证目的片段是否已经与质粒进行连接，也可以进行测序看到完整结果。得到的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒验证琼脂糖电泳图见图3，质粒验证电泳图见图5，质粒图见图6。
图5中A为目的片段ABA8ox3与pCABIA1302连接的头的碱基序列，B为目的片段ABA8ox3与pCABIA1302连接的尾的碱基序列。
上述鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体可应用于调控鄞红葡萄成熟期。具体地，将pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体通过农杆菌介导转入鄞红葡萄果肉细胞后，实现鄞红葡萄ABA8ox3基因的过表达，以此调控鄞红葡萄果实中的内源ABA含量，获得成熟期提前的鄞红葡萄新品种。成熟期的提前可以使鄞红葡萄的采摘期绕开台风季，减少果农损失，在与其他水果或葡萄的同期竞争中赢得胜利，获得更高的商品价值。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体及其构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12021
<212> DNA
<213> 鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体pCAMBIA1302-ABA8ox3的核苷酸序列(SEQ IDNO.1)
<400> 1
gtagatctga ctagtaaagg agaagaactt ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa 60
ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca 120
acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc tgttccgtgg 180
ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct tttcaagata cccagatcat 240
atgaagcggc acgacttctt caagagcgcc atgcctgagg gatacgtgca ggagaggacc 300
atcttcttca aggacgacgg gaactacaag acacgtgctg aagtcaagtt tgagggagac 360
accctcgtca acaggatcga gcttaaggga atcgatttca aggaggacgg aaacatcctc 420
ggccacaagt tggaatacaa ctacaactcc cacaacgtat acatcatggc cgacaagcaa 480
aagaacggca tcaaagccaa cttcaagacc cgccacaaca tcgaagacgg cggcgtgcaa 540
ctcgctgatc attatcaaca aaatactcca attggcgatg gccctgtcct tttaccagac 600
aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac 660
atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac atggcatgga tgaactatac 720
aaagctagcc accaccacca ccaccacgtg tgaattggtg accagctcga atttccccga 780
tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 840
gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 900
gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 960
gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 1020
gttactagat cgggaattaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta 1080
agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg 1140
ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga 1200
tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg 1260
aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct 1320
ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga 1380
gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca 1440
ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc 1500
tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg 1560
accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca 1620
cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc 1680
tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg 1740
ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg 1800
ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg 1860
cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc 1920
ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca 1980
ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg 2040
cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga 2100
cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt 2160
cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga 2220
tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct 2280
aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat 2340
gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac 2400
cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc 2460
gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg 2520
gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc 2580
gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg 2640
gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc 2700
ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc 2760
acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc 2820
ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc 2880
acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa 2940
cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc 3000
atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc 3060
gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca 3120
tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg 3180
tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt 3240
aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa 3300
aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt 3360
tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag 3420
cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct 3480
gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 3540
ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 3600
ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 3660
accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 3720
ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 3780
cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg 3840
ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg 3900
ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 3960
gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 4020
gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 4080
gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 4140
gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 4200
caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 4260
ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 4320
caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 4380
gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 4440
ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 4500
ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 4560
aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 4620
gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 4680
tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 4740
tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 4800
aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 4860
cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 4920
acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 4980
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 5040
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 5100
ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 5160
ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 5220
cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 5280
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 5340
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 5400
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 5460
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 5520
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 5580
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 5640
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 5700
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 5760
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 5820
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 5880
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 5940
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 6000
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 6060
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa 6120
ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc 6180
aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa 6240
ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac 6300
tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc 6360
ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt 6420
gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa 6480
ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg 6540
aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc 6600
atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc 6660
atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat 6720
gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa 6780
atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt 6840
atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt 6900
agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat 6960
tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa 7020
acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt 7080
ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc 7140
ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca 7200
tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga 7260
ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 7320
ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 7380
acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga 7440
ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa 7500
atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa 7560
ccctaattcc cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg 7620
atcgacagat ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 7680
cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 7740
cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 7800
ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 7860
agaccaatgc ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 7920
cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 7980
ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 8040
atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 8100
acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 8160
ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 8220
atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 8280
ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga 8340
acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 8400
atgcaatagg tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 8460
gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 8520
tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 8580
ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 8640
acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa 8700
gctcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg 8760
aaatgaactt ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc 8820
cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct 8880
tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag 8940
gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc 9000
ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt 9060
cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct 9120
ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttatcaca tcaatccact 9180
tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt 9240
ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa 9300
tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata 9360
gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata 9420
gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc 9480
tccaccatgt tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 9540
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 9600
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 9660
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 9720
accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat 9780
gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 9840
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 9900
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg 9960
agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttagct tcatggagtc aaagattcaa 10020
atagaggacc taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta 10080
cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 10140
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 10200
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 10260
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 10320
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 10380
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 10440
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 10500
taaggaagtt catttcattt ggagagaaca cgggggactc ttgacatgat taatctacct 10560
aggaacaagc ttgtcttcct tgtacagaac catatcgaaa ttatgatggt tgcagtgttc 10620
tccttaggag taatgcttat tgtccaaaaa gcattgagaa gattaacaag tgagaaaagt 10680
gttattcctg gtcgtctggg gttgccgctt ctgggtgaaa ccttctcttt tctatcagcc 10740
actggtagta caaaaggatg ctatgatttt gtgaggctaa gacgactgtg gcatgggaaa 10800
tggttcaaga caaggatatt tggcaaggtc catgtgtttg tcccaactac tgatggagca 10860
aaaacgattt tcgctaatga tttggtgctt ttcaataagg gttatgtgaa atcaatggca 10920
gatgttgtag gcaagaagag cttgctatgt gttcctcaag agagtcacaa aaggattagg 10980
cgtcttctat cagatccttt ctccatgaat tctttgtcca agtttgtcat ggaattcgac 11040
aacatgctgt accaaagact caacaaatta gaagaagggg ggaaaagctt tgtagtgttc 11100
gacttctgta tgaagatagc atttgatgca atatgcaaca ggctaataag tgtcaccgag 11160
gctcccttgc tacaagagat tgagagagac tgtacgtatg tttccaatgc tatgttgtca 11220
tttcctctca tgatccctgg caccagatac tacaaaggta tcaaggcaag aaaacgtcta 11280
atggaaacct ttggagagat gattagcagc aggcgaagtg gaaaggagta ctctgatgac 11340
ttcttgcagt ccatgttaca acgggattca tacccgccca gtgaaaagct tgaagactca 11400
gagattatgg ataacctatt aacactgata attgcaggac aaaccaccac tgcggctgca 11460
atgatgtgga gtgtcaagtt cttggatgaa aacgaagaag tccaggatag gctaagggaa 11520
gagcaactgt caataatcag aaacaaagca gaaggagcct tacttaccct tgaagatcta 11580
aacagcatgt gctatggctt acaggttgtg aaggaaacat tgagaatgtc aaatgtttta 11640
ttgtggtttc ctcgtgttgc acttaatgac tgcagaattg aaggttttga aataaagaaa 11700
ggatggcacc tcaacattga tgcgacttac atacacttcg accatagtct gtacaaggac 11760
cctatacaat tcaatccttc gagatttgat gtagaagtgc caaagccata cagcttcatg 11820
ccttttggat caggaccaag aacctgccta ggaattaata tggccaaaat gacaatgttg 11880
gtgttcttaa gccggctgac cagtggattc aagtggagag tcgatgatcg agatccttgc 11940
ctagaaaaga aggcacacat tcctagactg agaagtggct gccccataac cttaaggacc 12000
ctaaagaaga gggatatcat a 12021
Claims (5)
1.鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体，其特征在于，该过表达载体为将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体，该过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建方法，其特征在于，通过克隆技术获得鄞红葡萄ABA8ox3基因，将鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段***设计好的pCAMBIA1302原始载体的可实现过表达的位点，实现pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建，具体包括以下步骤：
S1、鄞红葡萄ABA8ox3基因的编码区的克隆：
S1.1、提取鄞红葡萄果肉的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于-20℃冰箱中备用；
S1.2、从NCBI中搜索得到葡萄的ABA8ox3基因全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物ABA8ox3-F和ABA8ox3-R用于PCR扩增，其序列分别为：
ABA8ox3-F：ATGATTAATCTACCTAGG；
ABA8ox3-R：TTAAGGGGCACTCTTCTTGCTTT；
S1.3、以cDNA为模板，利用ABA8ox3-F和ABA8ox3-R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌T1感受态细胞；将转化后的大肠杆菌在37℃恒温箱培养12h；挑取单菌落，利用菌液PCR检测是否阳性克隆，若是，则对菌液进行序列测定，测序结果正确后即获得鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段；
S2、pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计：
选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV 35启动子和mgfp5荧光序列之间的位置作为鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的引物***位点，在***位点的前后保持3倍数碱基对，先于pCAMBIA1302原始载体序列删除“catg”4个碱基，并在删除位置***鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段，替换pCAMBIA1302原始载体的“catg”4个碱基，且删除目的片段的终止密码子，完成pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒设计；
S3、获得pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒：
S3.1、根据设计好的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，第一步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的起始密码子前选择10-15个碱基序列，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段删除的终止密码子后选择10-15个碱基序列；第二步，在鄞红葡萄ABA8ox3基因的目的片段的头尾各选择15-20个碱基序列，与第一步中选择的碱基序列各自拼接后得到引物YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R，其序列分别为：
YB-ABA8ox3-F：GAACACGGGGGACTCTTGACATGATTAATCTACCTAGG；
YB-ABA8ox3-R：CCTTTACTAGTCAGATCTACTATGATATCCCTCTTCTTT；
S3.2、利用YB-ABA8ox3-F和YB-ABA8ox3-R对ABA8ox3基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为产物1，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.3、用NcoI-HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到产物2，放入-20℃冰箱内等待备用；
S3.4、将产物1与产物2遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即为pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的质粒，其测序结果如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的鄞红葡萄ABA8ox3基因的pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体的构建方法，其特征在于，步骤S3.4中，测序所用引物为p-F和p-R，其序列分别为：
p-F：TTACGACTCAATGACAAGAAGAAAA；
p-R：GTTTTCCGTATGTTGCATCACCTTC。
4.权利要求1所述的鄞红葡萄ABA8ox3基因过表达载体在调控鄞红葡萄成熟期中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将pCAMBIA1302-ABA8ox3过表达载体通过农杆菌介导转入鄞红葡萄果肉细胞后，实现鄞红葡萄ABA8ox3基因的过表达，以此调控鄞红葡萄果实中的内源ABA含量，获得成熟期提前的鄞红葡萄新品种。
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| CN114196698A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-03-18 | 浙江万里学院 | 鄞红葡萄pepck基因敲除载体的构建方法 |
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- 2021-03-30 CN CN202110339563.3A patent/CN113234738A/zh active Pending
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