CN101709300B - 水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法，尤其涉及水稻快速沉默载体改造用DNA序列和该DNA序列的合成方法以及采用该DNA序列用于建立高效的水稻人工miRNA基因干涉载体。本发明将沉默相关片段两端的不变区域事先放入转基因目标载体，再将核心沉默片段(wi-site)连入改造后的载体，直接完成载体构建。在首、尾片段选择时，分析了DNA序列，使得首尾片段相连后可获得一个AfeI酶切位点，转化大肠杆菌后，可大量制备该载体并用AfeI内切酶对其进行线性化，直接连接采用本专利方法合成的核心沉默片段，完成水稻沉默载体的构建。本发明扩展了目标载体上不变的DNA区间，从而简化了单个沉默载体构建的方法，加速了构建过程，提高了载体构建的效率。

Description

水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法

技术领域

本发明涉及水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法，尤其涉及水稻快速沉默载体改造用DNA序列和该DNA序列的合成方法以及采用该DNA序列用于建立高效的水稻人工miRNA基因干涉载体。

技术背景

现有的方法构建水稻基因沉默载体以Overlapping PCR为核心，通过PCR替换水稻Os-amiR528的方法构建水稻基因沉默载体(Warthmann et al.，2008)。现有方法针对单个沉默载体构建需采用四条带有沉默相关序列的PCR引物，和两条公共引物配合，对pNW55载体进行扩增，对扩增获得的3段DNA片段进行回收，再进行融合PCR，连入T载体，酶切后再连入转化载体，最终获得转基因用的沉默载体。方法具体分为四个步骤：

第一步，通过针对每个不同的基因干涉设计合成4条长度为40bp的引物，合成两条公共的引物组合，用于和基因特异引物组合扩增沉默相关的DNA片段。

第二步，通过4条基因特异的沉默引物和两条公共引物祝贺，分别扩增获得三段长度为256bp，259bp，87bp的DNA片段，通过电泳分离DNA片段，切割含目标大小DNA的凝胶，进行DNA片段回收。

第三步，将回收得到的三段PCR产物混合，再用两条公共进行融合PCR，获得长度为554bp的DNA片段，通过电泳分离DNA片段，切割含目标大小DNA的凝胶，进行DNA片段回收。

第四步，将回收后的554bp片段连接到T载体或其他中间载体，通过连接、转化获得携带有相应载体的大肠杆菌菌落，扩增菌体后，抽取带有沉默片段的中间载体，再采用限制性内切酶进行酶切，获得有粘性末端的DNA片段，再和目标载体进行连接，通过连接、转化获得携带有转化载体的大肠杆菌菌落，测序检测正确后，用于农杆菌转化。

现有方法构建载体需要四个大的步骤，且每个步骤操作的内容又相当繁琐，需要实验人员具有一定的分子生物学操作基础。本专利涉及的方法只需要两个步骤，并且每个步骤操作也非常简单，具有简单分子生物学基础的实验人员也能快速，准确的完成载体构建任务。

专利内容

为了解决上述的存在的技术缺陷，本发明的第一个目的是提供水稻快速沉默载体改造用DNA序列及其合成方法，本发明的第二个目的是提供用于高效构建水稻基因沉默载体的载体及其制备方法，本发明的第三个目的是提供水稻基因沉默载体及其制备方法。本发明简化了单个沉默载体构建的方法，加速了构建过程，提高了载体构建的效率。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

水稻快速沉默载体改造用DNA序列，该DNA序列包括如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，SEQ ID NO：1所述如下：

cagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcagcgctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagc；其中，agcgct部分为AfeI酶切位点。

作为优选，所述的水稻快速沉默载体改造用DNA序列，该DNA序列如SEQ IDNO：2所示，SEQ ID NO：2所述如下：

tcGAGCTCcagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcagcgctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagcGGTACCga；其中，tcGAGCTC和GGTACCga部分为克隆位点和保护碱基，agcgct部分为AfeI酶切位点。

上述的水稻快速沉默载体改造用DNA拼接方法合成，该方法采用水稻Os-amiR528DNA基因沉默序列作为基础，序列如SEQ ID NO：3所示，将水稻此序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段(如图2所示)，通过PCR扩增并融合首片段和尾片段，然后用于快速基因沉默载体改造。

SEQ ID NO：3所述如下：

cagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcagcagtggaaggggcatgcagaggagcaggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctctctcctgtgcttgcctcttccattcctgctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagc

首片段如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：5所述如下：

cagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcagc；

尾片段，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6所述如下：

gctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagc；

通过序列分析和设计，使得其中首片段由AGC位点结尾，而干涉尾片段由GCT位起始。这样首片段、尾片段拼接获正好获得得一个包含AfeI酶切位点的沉默载体改造用DNA序列，同时首片段的前端和尾片段的尾端包含了酶切位点及相应的保护碱基，用以酶切并连接改造的目标载体(如图3a所示)。

作为优选，上述的水稻快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法，包括以下的步骤：

①引物合成：合成7条引物，序列如下：

②采用分步分段合成改造片段

采用分步合成的方法合成此片段，amiR-F1、amiR-AfeI、amiR-R1和amiR-R2合成前片段，amiR-F4、amiR-AfeI、amiR-R2和amiR-R4-G-R-KpnI合成尾片段；

作为再优选，合成前段和后段PCR体系浓度和反应条件为：

③改造片段的拼接

分别稀释100倍，再采用G-F-SacI和amiR-R4-G-R-KpnI引物用融合两段PCR产物，合成带有完整改造片段的DNA链；

作为再优选，相应PCR体系浓度和反应条件为：

完成后，用于改造水稻快速基因沉默片段序列如SEQ ID NO：1所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

用于高效构建水稻基因沉默载体的载体，该载体含有如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：2所示DNA序列的基因片段。

上述的用于高效构建水稻基因沉默载体的载体的制备方法，该方法包括以下的步骤：

①载体改造片段与目标载体的连接

采用SEQ ID NO：1或SEQ ID N0：2所示DNA序列的基因片段，再采用SacI和KpnI内切酶酶切，如果目标载体的采用其他的多克隆位点，则应在引物设计时，修改酶切位点，并在此处用相应的内切酶进行酶切，然后连入未修改的目标载体；

优选的连接体系如下：

混合好后的连接体系在16℃水浴过夜；

②改造完成的目标载体转化大肠杆菌

取连接产物5ul，加入100ul的CaCl₂处理的DH5α热击感受态，42℃热击处理90秒，加入800ul的LB无抗培养基，在37℃用250rpm复苏1小时；在无菌条件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37℃培养培养16小时，挑选转化子，接入LB重新培养后送测序确认；测序正确的菌采用25％甘油冻存，以备长期使用。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

水稻沉默载体，该载体含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示DNA序列的基因片段。

上述的水稻沉默载体的快速构建方法，该方法包括以下的步骤：

①质粒准备及线性化

将上述获得的用于高效构建水稻基因沉默载体的载体摇菌扩增，采用质粒抽提试剂盒进行质粒DNA抽提，然后用AfeI酶切质粒；

酶切体系如下：

在37℃下酶切过夜，酶切后的DNA采用1％琼脂糖凝胶电泳，用溴乙锭染色后在紫外灯下切胶，采用凝胶回收试剂盒回收酶切产物；线性化后的载体为通用载体片段，可用于所有快速沉默载体的构建，可在-20℃下长时间保存备用。

②桥接片段的合成

合成桥接片段的引物两条，序列如下：

将引物稀释到100uM，分别取5ul，95℃处理5分钟，自然冷却退火到室温状态；稀释100倍备用；本桥接片段为通用片段，可用于所有快速沉默载体的构建，可在-20℃下长时间保存备用。

③核心沉默片段的扩增

为每个基因分别合成基因沉默相关片段引物两条：

首先，在http://wmd2.weigelworld.org/设计人工miRNA序列(Warthmann etal.，2008)。将设计获得的人工miRNA片段，在两头增加AG和CAGGAGATTCAGTTTG形成基因wi-Primerl；人工miRNA片段将12位和16位进行G-C，A-T颠换，再在两头增加AGGAA和AGAGAGGCAAAAGTG，形成wi-Primer2。如下表，黑色表示人工miRNA片段，灰色部分表示添加的序列，下划线表示需进行颠换的位点。

取1ul桥接片段，采用基因特异引物进行PCR扩增，优选的扩增条件如下：

④核心沉默片段与载体的连接

无需进行回收，直接将扩增获得的片段PCR产物直接和已经线性化的载体相连接，优选的连接体系如下：

混合好后的连接体系在16℃水浴过夜。

⑤转化大肠杆菌菌株

本专利推荐使用常规的DH5α菌株进行连接片段的转化工作。取连接产物5ul，加入100ul的CaCl₂处理的DH5α热击感受态菌，42℃热击处理90秒，加入800ul的LB无抗培养基，在37℃用250rpm复苏1小时；在无菌条件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37℃培养培养16小时，挑选转化子，接入LB重新培养。

⑥基因沉默载体的检测

由于采用了平末端连接，必须挑选方向正确的连接转化子，为提高测序命中效率，同时排除载体自连的情况。转化子进行测序前，首先需进行菌液PCR。为此，需合成两条检测用引物：

将连接后的平板，挑选克隆摇菌，过夜培养后，取1ul进行菌液PCR检测。液PCR检测体系如下：

PCR确认的阳性克隆即可初步判断为转化克隆，为确认这一结果，送2个阳性克隆进行测序。按本专利方法操作，阳性克隆测序后正确率在85％以上。

本专利对水稻转基因的目标载体进行了改造，极大的简化了实验流程，只需进行一次常规PCR反应，一个连接就能完成基因沉默载体的构建，将载体构建的时间从9天缩短到了4天，且由于实验操作非常简单，可以同时开展多个基因的干涉载体构建工作。本专利方法针对单个特定基因的沉默载体构建，仅需要设计合成两条沉默相关引物；并且只采用常规的PCR方法，极大的减小了因Overlapping PCR导致DNA扩增出错的概率；在PCR完成后，由于没有质粒背景的干扰，无需进行电泳回收DNA片段，减少了电泳及回收操作过程中试剂的消耗，进一步节省了实验成本和实验时间。另外本专利方法的重要特点是，采用本方法构建的沉默载体和采用现有方法构建的沉默载体完全一致，下游转基因研究完全不受此方法改进的影响。

下面通过与现有方法比较，说明本发明的有益效果：

现有方法和本专利方法流程比较表

从上述的表格可以看出，本专利所述方法，不仅能够有效的缩短水稻基因沉默载体构建的时间，还能大量的节省相关试剂耗材。和现有方法相比，本专利构建单个沉默载体的方法，不但需要的试剂耗材种类少，所消耗的试剂量也大为减少。

除表1所列外，现有方法中针对每个沉默载体构建需要合成4条引物，采用本专利方法，每个沉默载体构建仅需要两条引物，从而也减少了因引物合成的错误导致载体构建失败的概率。

从表1中我们还能看出，使用本专利能大大缩短载体构建时间，现有方法约需要9天才能完成载体构建，本专利方法只需要4天就能完成。而且在操作过程中，现有方法需要消耗实验人员大量的精力，整体过程中，大约需要占用20多个小时实验时间，而本方法仅占用9小时实验时间，且其中主要为PCR和连接时间，实验员完全可以同时开展其他工作。

综上所述，本专利方法具效益高，能够极大缩短实验时间，降低单个沉默载体的改造成本。同时，由于本方法简便易行，操作方便，使得单个实验员能同时开展多个沉默载体改造。

附图说明

图1为目标载体改造及核心沉默载体片段示意图。

图2为载体改造片段的合成模式图。

图3为水稻基因沉默载体快速构建方法示意图。

具体实施方式

实施例1改造pCAMBIA1300载体用于快速沉默载体构建

1、代改造转化载体的准备

为提高本专利适用性，特别强调一起说明目标载体改造的方法，以提供给本发明的使用者参考，在需要时可用于改造其它目标载体。

为了将首尾批段放入载体中，且能够进行酶切线性化，我们首先采用改造过的pCAMBIA1300载体为初始载体，该中连有Ubiqitin启动子和rbcs终止子，可作为启动和终止水稻沉默片段的元件，该载体简称为1300UR载体。

首先，采用SacI和KpnI内切酶对其进行酶切，在37℃下酶切过夜，酶切后的DNA采用1％琼脂糖凝胶电泳，用溴乙锭染色后在紫外灯下切胶，采用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。产物储存在-20℃备用。

2、改造片段相关引物的合成

按本专利方法改造转化载体，我们合成7条引物，用于改造1300UR载体，引物序列如下：

3、采用分步分段法合成含有AfeI酶切位点的改造片段

按专利的说明，分步合成的方法合成此片段，amiR-F1、amiR-AfeI、amiR-R1和amiR-R2合成首片段，amiR-F4、amiR-AfeI、amiR-R2和amiR-R4-G-R-KpnI合为尾片段，如图2所示。

合成前段和后段PCR体系浓度和反应条件为：

4、融合两段PCR产物获得完整改造片段

将获得的两段PCR产物分别稀释100倍，再采用G-F-SacI和amiR-R4-G-R-KpnI引物用融合两段产物，合成带有酶切位点的完整改造片段。PCR体系浓度和反应条件为：

5、造片段与1300UR载体的连接

采用凝胶回收试剂盒回收DNA片段，在采用SacI和KpnI内切酶酶切，连入未修改的目标载体。

连接体系如下：

混合好后的连接体系在16℃水浴过夜。

6、转化大肠杆菌

取连接产物5ul，加入100ul的CaCl₂处理的DH5α热击感受态，42℃热击处理90秒，加入800ul的LB无抗培养基，在37℃用250rpm复苏1小时。在无菌条件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37℃培养16小时，挑选转化子，接入LB重新培养后送测序确认。测序正确的菌采用25％甘油冻存，以备长期使用。改造后载体序列见SEQ ID NO：4。

实施例2用本专利方法快速构建5个水稻基因沉默载体

1、沉默载体的快速构建的准备工作

(1)质粒准备及线性化

将按照实施例1得到的载体摇菌扩增，采用质粒抽提试剂盒进行1300URA质粒DNA抽提，用AfeI酶切，酶切体系如下：

在37℃下酶切过夜，酶切后的DNA采用1％琼脂糖凝胶电泳，用溴乙锭染色后在紫外灯下切胶，采用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。线性化后的载体为通用载体片段，可用于所有快速沉默载体的构建，可在-20℃下长时间保存备用。

(2)桥接片段的合成

按本专利方法合成桥接片段的引物两条，序列如下：

将引物稀释到100uM，分别取5ul，95℃处理5分钟，自然冷却退火到室温状态。稀释100倍备用。本桥接片段为通用片段，可用于所有快速沉默载体的构建，可在-20℃下长时间保存备用。

2、核心沉默片段的扩增

(1)核心沉默片段的扩增

针对每个基因合成基因沉默相关片段引物两条，

5个基因的扩增片段分别为：

针对每个基因，分别取1ul桥接片段，采用基因特异引物进行PCR扩增，扩增条件如下：

(2)核心沉默片段与载体的连接

无需进行回收，直接将扩增获得的片段PCR产物直接和已经线性化的载体相连接，连接体系如下：

混合好后的连接体系在16℃水浴过夜。

(3)转化大肠杆菌菌株

本专利推荐使用常规的DH5α菌株进行连接片段的转化工作。取连接产物5ul，加入100ul的CaCl₂处理的DH5α热击感受态菌，42℃热击处理90秒，加入800ul的LB无抗培养基，在37℃用250rpm复苏1小时。在无菌条件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养平板上，37℃培养培养16小时，挑选转化子，接入LB重新培养。

3、基因沉默载体的检测

(1)检测引物的合成

由于采用了平末端连接，必须挑选方向正确的连接转化子，为提高测序命中效率，排除载体自连的情况。转化子进行测序前，首先需进行菌液PCR。为此，需合成两条检测用引物：

(2)菌液PCR检测

将连接后的平板，挑选克隆摇菌，过夜培养后，取1ul进行菌液PCR检测。菌液PCR检测体系如下：

PCR确认的阳性克隆即可初步判断为转化克隆，为确认这一结果，送2个阳性克隆测序。

(3)测序检测

五个含有LRR结构域的基因，菌液PCR检测完成后，每个基因的沉默载体，分别送两个PCR阳性克隆进行测序，经测序结果检测显示，5个载体均得到正确的克隆，其中4个载体送测的两个克隆正确，另外一个载体送测的载体有一个克隆存在点突变。故构建此5个基因沉默载体最终测序阳性率为90％。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法

<160>20

<210>1

<211>154

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(154)

<400>1

1   cagcagcagc cacagcaaaa tttggtttgg gataggtagg tgttatgtta ggtctggttt

61  tttggctgta gcagcagcgc tgctaggctg ttctgtggaa gtttgcagag tttatattat

121 gggtttaatc gtccatggca tcagcatcag cagc

<210>2

<211>170

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(170)

<400>2

1   tcGAGCTCca gcagcagcca cagcaaaatt tggtttggga taggtaggtg ttatgttagg

61  tctggttttt tggctgtagc agcagcgctg ctaggctgtt ctgtggaagt ttgcagagtt

121 tatattatgg gtttaatcgt ccatggcatc agcatcagca gcGGTACCga

<210>3

<211>245

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(245)

<400>3

1   cagcagcagc cacagcaaaa tttggtttgg gataggtagg tgttatgtta ggtctggttt

61  tttggctgta gcagcagcag tggaaggggc atgcagagga gcaggagatt cagtttgaag

121 ctggacttca cttttgcctc tctctcctgt gcttgcctct tccattcctg ctgctaggct

181 gttctgtgga agtttgcaga gtttatatta tgggtttaat cgtccatggc atcagcatca

241 gcagc

<210>4

<211>11761

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(11761)

<400>4

1    aattgggctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc

61   atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt

121  ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact

181  acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga

241  caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct

301  cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc

361  atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt

421  ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat

481  ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa

541  ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg

601  ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg

661  aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca

721  ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag

781  ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcacgg cagctacggg ggattccttt

841  cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca

901  ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca

961  aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc

1021 tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt

1081 tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga

1141 tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa

1201 tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg

1261 ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt

1321 cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg

1381 tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga

1441 tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat

1501 cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt

1561 tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc

1621 ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg

1681 tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt

1741 atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc

1801 atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt

1861 tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc

1921 tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg

1981 tttggtgtta cttctgcagg aattcgatat caagctattc gagctccagc agcagccaca

2041 gcaaaatttg gtttgggata ggtaggtgtt atgttaggtc tggttttttg gctgtagcag

2101 cagcgctgct aggctgttct gtggaagttt gcagagttta tattatgggt ttaatcgtcc

2161 atggcatcag catcagcagc ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg cagagctttc

2221 gttcgtatca tcggtttcga caacgttcgt caagttcaat gcatcagttt cattgcgcac

2281 acaccagaat cctactgagt ttgagtatta tggcattggg aaaactgttt ttcttgtacc

2341 atttgttgtg cttgtaattt actgtgtttt ttattcggtt ttcgctatcg aactgtgaaa

2401 tggaaatgga tggagaagag ttaatgaatg atatggtcct tttgttcatt ctcaaattaa

2461 tattatttgt tttttctctt atttgttgtg tgttgaattt gaaattataa gagatatgca

2521 aacattttgt tttgagtaaa aatgtgtcaa atcgtggcct ctaatgaccg aagttaatat

2581 gaggagtaaa acacttgtag ttgtaccatt atgcttattc actaggcaac aaatatattt

2641 tcagacctag aaaagctgca aatgttactg aatacaagta tgtcctcttg tgttttagac

2701 atttatgaac tttcctttat gtaattttcc agaatccttg tcagattcta atcattgctt

2761 tataattata gttatactca tggatttgta gttgagtatg aaaatatttt ttaatgcatt

2821 ttatgacttg ccaattgatt gacaacatgc atcaagcttg gcactggccg tcgttttaca

2881 acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc

2941 tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg

3001 cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct

3061 tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag

3121 cgtttattag aataatcgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt

3181 tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct

3241 ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat

3301 gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct

3361 tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc

3421 catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca

3481 ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga

3541 gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg

3601 ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct

3661 actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc

3721 gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc

3781 cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc

3841 ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg

3901 cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca

3961 tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag

4021 gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga

4081 gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt

4141 ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc

4201 gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg

4261 gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga

4321 tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta

4381 aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg

4441 ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg

4501 atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg

4561 aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg

4621 ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg

4681 tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca

4741 tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa

4801 ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg

4861 ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg

4921 tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg

4981 acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta

5041 atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc

5101 acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt

5161 caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg

5221 caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa

5281 atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac

5341 aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg

5401 taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat

5461 cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac

5521 ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca

5581 cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg

5641 ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt

5701 ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc

5761 gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca

5821 gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac

5881 ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag

5941 ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg

6001 cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc

6061 acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc

6121 gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag

6181 tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg

6241 gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc

6301 taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc

6361 tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg

6421 atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg

6481 atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt

6541 acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt

6601 cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac

6661 attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa

6721 gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc

6781 cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct

6841 acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct

6901 ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg

6961 ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga

7021 tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc

7081 ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg

7141 cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca

7201 tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta

7261 aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg

7321 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca

7381 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac

7441 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac

7501 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg

7561 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac

7621 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat

7681 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag

7741 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac

7801 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt

7861 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt

7921 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc

7981 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga

8041 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac

8101 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt

8161 aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc

8221 tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca

8281  taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct

8341  ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc

8401  ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc

8461  cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag

8521  cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg

8581  atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc

8641  gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca

8701  aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc

8761  cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt

8821  tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg

8881  cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat

8941  tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga

9001  cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt

9061  caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc

9121  ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga

9181  tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat

9241  gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct

9301  gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg

9361  tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg

9421  gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact

9481  ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac

9541  atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc

9601  cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat

9661  cccggtcggc atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca

9721  ctatcggcga gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt

9781  tgtgtacgcc cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc

9841  caagctgcat catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg

9901  cggagcatat acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag

9961  tagcgcgtct gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc

10021 tcgtattggg aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca

10081 ttgtccgtca ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg

10141 cagtcctcgg cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg

10201 tcgtccatca cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca

10261 cgccatgtag tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg

10321 ctaagatcgg ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc

10381 agttcggttt caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg aacggcggga gatgcaatag

10441 gtcaggctct cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat

10501 gcaaagtgcc gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc

10561 aggacatatc cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag

10621 agctgcatca ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc

10681 gcggtgagtt caggcttttt catatctcat tgcccccccg gatctgcgaa agctcgagag

10741 agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact

10801 tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc

10861 agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc

10921 cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg

10981 aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac

11041 tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat

11101 taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt

11161 cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttcaca tcaatccact tgctttgaag

11221 acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg

11281 gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt

11341 tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat

11401 ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt

11461 cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt

11521 tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta

11581 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa

11641 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat

11701 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acatgattac

11761 g

<210>5

<211>78

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(78)

<400>5

1  cagcagcagc cacagcaaaa tttggtttgg gataggtagg tgttatgtta ggtctggttt

61 tttggctgta gcagcagc

<210>6

<211>76

<212>DNA

<213>人工合成

<222>(1)…(76)

<400>6

1  gctgctaggc tgttctgtgg aagtttgcag agtttatatt atgggtttaa tcgtccatgg

61 catcagcatc agcagc

<210>7

<211>58

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(58)

<400>7

CCAGCAGCAG CCACAGCAAA ATTTGGTTTG GGATAGGTAG GTGTTATGTT AGGTCTGG  58

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(38)

<400>8

CTGCTGCTGC TACAGCCAAA AAACCAGACC TAACATAA  38

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(42)

<400>9

AGAGAGGCAA AAGTGAAGTC CAGCTTCAAA CTGAATCTCC TG 42

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(39)

<400>10

AACTCTGCAA ACTTCCACAG AACAGCCTAG CAGCAGGAA  39

<210>11

<211>58

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(58)

<400>11

GAAGTTTGCA GAGTTTATAT TATGGGTTTA ATCGTCCATG GCATCAGCAT CAGCAGCG  58

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(28)

<400>12

TCGGATCCGC TGCTGATGCT  GATGCCAT  28

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(27)

<400>13

TCGAGCTCCA GCAGCAGCCA CAGCAAA  27

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(28)

<400>14

TCGGTACCGC TGCTGATGCT GATGCCAT  28

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(20)

<400>15

ATTTTTTTAG CCCTGCCTTC  20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(21)

<400>16

AGAGAGGCAA AAGTGAAGTC C  21

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(39)

<400>17

AGTCTAATAA TACCTGTCAC GATCAGGAGA TTCAGTTTG  39

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(41)

<400>18

AGGAATCTAA TAATACGTGT GACGATAGAG AGGCAAAAGT G 41

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(20)

<400>19

ATTTTTTTAG CCCTGCCTTC  20

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<222>(1)…(21)

<400>20

AGAGAGGCAA AAGTGAAGTC C  21

Claims (2)

1.水稻快速沉默载体改造用DNA序列的合成方法，其特征在于，该方法采用水稻Os-amiR528DNA基因干涉序列，所述的水稻Os-amiR528DNA基因干涉序列如SEQ ID NO：3所示，将水稻Os-amiR528DNA基因干涉序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段，首片段的序列如SEQ ID NO：5所示，尾片段的序列如SEQ ID NO：6所示；在首片段的前端和尾片段的尾端设计了酶切位点及相应的保护碱基；将首片段、尾片段拼接获得一个包含AfeI酶切位点的如SEQ ID NO：2所示的沉默载体改造用DNA序列，其中首片段由AGC位点结尾，而尾片段由GCT位起始，其中SEQ ID NO：2所述如下：

tcGAGCTCcagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcAGCGCTg

ctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagcGGTACCga；

其中，tcGAGCTC和GGTACCga部分为克隆位点和保护碱基，AGCGCT部分为AfeI酶切位点。

2.用于高效构建水稻基因沉默载体的载体，其特征在于：该载体含有如SEQ ID NO：2所述的DNA序列的基因片段，其中SEQ ID NO：2所述如下：

tcGAGCTCcagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttttttggctgtagcagcAGCGCTg

ctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcatcagcatcagcagcGGTACCga。

Images