CN109456990B - 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法,该方法利用基因组编辑技术,对叶绿体基因组进行定点剪切,提高外源基因在叶绿体基因组中的重组效率和整合效率,从而提高叶绿体遗传转化效率。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,公开了一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法。
背景技术
植物转基因技术多为将外源基因导入至细胞核的基因组中进行表达。但随着研究的深入,这种常规方法的一系列弊端也相继出现。例如,外源基因表达效率低,容易出现基因沉默、失活和位置效应,难以同时操作多个基因的转化,并且外源基因在后代中表达不稳定。更为重要的是,外源基因可随花粉遗传,花粉扩散所带来的转基因环境安全问题引发了人们的担忧。在植物细胞内,DNA遗传物质不仅仅存在于细胞核内,也存在于细胞器中。叶绿体是高等植物或藻类进行光合作用的场所,其基因组具有半自主的自我复制能力。叶绿体遗传转化技术是继常规核转化之后出现的一种新型的转基因途径。与核转化相比,由于叶绿体基因组较小,遗传操作更为简便。该技术的原理是通过同源重组机制将外源基因定点整合到叶绿体基因组中,可有效地避免失活和位置效应等基因沉默难题。叶绿体基因组的原核特性使其可同时表达多个外源基因,高拷贝数为外源基因获得多拷贝提供了平台,母系遗传的特征极大地保障了转基因的坏境安全性,这些都是核转化不具备的优势。目前,双子叶植物的叶绿体转化技术已经非常成熟,成功进行叶绿体转化的高等植物有烟草、马铃薯、番茄、油菜、胡萝卜、棉花、大豆、西兰花、矮牵牛、甘蓝等十几种。而在主要的单子叶植物水稻、小麦中虽有关于叶绿体转化的报道,但都未获得能稳定遗传的同质化植株,其主要原因是外源基因的同源重组率低,因此,提高外源基因的同源重组率是提高叶绿体转化效率的重要途径。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足,提供一种提高叶绿体遗传转化效率的方法。
为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:
所述利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法是利用基因组编辑技术,对叶绿体基因组进行定点剪切,通过提高外源基因在植物叶绿体基因组中的重组效率和整合效率,从而提高叶绿体遗传转化效率。
优选地,所述基因组编辑技术包括但不限于为CRISPR/Cas9技术、TALEN技术。
优选地,所述方法具体包括如下步骤:
(1)构建叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体;所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中包含以下六段核苷酸序列:
第一核苷酸序列,其表达的蛋白质可以在第四核苷酸序列表达的单链RNA引导下对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切;
第二核苷酸序列,其为hpt潮霉素抗性基因,用于转化成功的转化子的筛选;
第三核苷酸序列,其表达的蛋白为绿色荧光蛋白,作为标记基因;
第四核苷酸序列,其转录表达产生的单链RNA可以引导第一核苷酸序列表达的蛋白质对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切;
第五核苷酸序列,其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段;
第六核苷酸序列,其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段。
(2)将步骤1所制备的构建体通过共转化转入水稻愈伤组织中,产生水稻叶绿体基因组转基因植株。
更优选地,所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二核苷酸序列如SEQID NO.2所示;所述第三核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述第四核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示;所述第五核苷酸序列如SEQ ID NO.5所述;所述第六核苷酸序列SEQ ID NO.6所示。
其中,所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。
所述植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、高粱、油菜、藻类。
下面对本发明作进一步说明:
在本发明中,上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第一核苷酸序列为CRISPR/Cas9基因编辑***中Cas9基因,序列如SEQ ID NO.1所示,实验所使用的基因编辑***包括但不限于CRISPR/Cas9基因编辑***。
在本发明中,上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第二核苷酸序列为hpt潮霉素抗性基因,序列如SEQ ID NO.2所示,实验所使用的抗性基因包括但不限于hpt潮霉素抗性基因。
在本发明中,上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第三核苷酸序列为eGFP绿色荧光基因,序列如SEQ ID NO.3所示,实验所使用的标记基因包括但不限于eGFP绿色荧光基因。
在本发明中,上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第四核苷酸序列为CRISPR/Cas9***中sgRNA片段,序列如SEQ ID NO.4所示,该sgRNA片段所对应的水稻叶绿体基因组敲除位点包括但不限于方法中sgRNA所对应的位点。
在本发明中,上述提高叶绿体遗传转化效率的方法中所提到的第五核苷酸序列和第六核苷酸序列为水稻叶绿体基因组定点敲入位点两端相应的同源重组片段,序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示,实验所使用的这两个同源重组序列包括但不限于trnA和trnI。
附图说明
图1外源构建体叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体图;
图2叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体酶切验证图;M: 15 kb DNA ladder;1: 质粒pC1304-Cas9; 2:质粒pC1304-Cas9-sgRNA; 3:pC1304-Cas9载体经HindIII和AscI酶切; 4: pC1304-Cas9-sgRNA载体经HindIII和AscI酶切; 5:pC1304-Cas9载体经AflII和NheI酶切; 6:pC1304-Cas9-sgRNA载体经AflII和NheI酶切;
图3叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中荧光蛋白在大肠杆菌中的表达;(A)自然光视野,(B) 蓝光视野;
图4叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9基因在大肠杆菌中的表达;1:感受态细胞TOP10; 2-3:携带有质粒pC1304-Cas9-sgRNA的TOP10细胞;
图5叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体转化植株的分子鉴定;M: 1kbplusDNA ladder; 1-9: 抗性苗1-9号单株;10:pC1304-Cas9-sgRNA质粒; 11:野生型对照。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步描述,但不因此限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
连接构建含有prrn启动子,T7Leader,Cas9基因,hpt基因,eGFP基因和TpsbA终止子的表达盒并在表达盒两端加入trnI和trnA水稻叶绿体同源重组序列,同时在trnA下游加入含有prrn启动子,sgRNA和TpsbA终止子的表达盒(附图1)。具体步骤如下:
1.1 中间双元载体pC1304的构建
用限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ双酶切pCTE04载体(含有叶绿体同源片段trnA 、trnI,hpt基因,eGFP基因),回收约 1580bp 的目的片段;用XbaⅠ和HindⅢ双酶切pCE4载体,回收约3160bp的目的片段;用HindⅢ和XbaⅠ双酶切pCAMBIA1300载体,胶回收大片段;将接头引物PCJ1-F和PCJ1-R退火成接头;将上述得到的四个片段连接,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,将验证正确的重组子命名为pC1304。
(1)酶切连接:酶切反应底物1μl,酶11μl,酶21μl,buffer1μl,加ddH2O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱30min。
(2)退火体系:将接头引物F和接头引物R分别稀释到100μM的母液浓度保存,各取1μL加入98μLddH2O稀释到1μM,90℃的金属浴中放置30s,移至室温冷却完成退火。
(3)连接体系:10×T4 Buffer 1μL,DNA 片段(3 个)各 1μL,PCJ1接头1μL,T4 DNALigase 1μL,4℃过夜连接。
(4)使用引物:
PCJ1:TCGAGTGTTGA(SEQ ID NO.7)
PCJ2:TATCAACAC(SEQ ID NO.8)
1.2 Cas9连到载体pC1304得到pC1304-Cas9载体
用限制性内切酶XbaⅠ和AscI 双酶切pC1304,回收载体片段;用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切载体psg-Cas9-Os载体(含有Cas9基因,sgRNA 等),回收Cas9目的片段;T7leader两条引物退火成T7接头引物,PCJ2-F和PCJ2-R两条引物退火成接头引物;将上述四个片段用T4连接酶链接,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,将验证正确的重组子命名为pC1304-Cas9。
(1)酶切连接:酶切反应底物1μl,酶11μl,酶21μl,buffer1μl,加ddH2O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱30min。
(2)退火体系:将接头引物F和接头引物R分别稀释到100μM的母液浓度保存,各取1μL加入98μLddH2O稀释到1μM,90℃的金属浴中放置30s,移至室温冷却完成退火。
(3)连接体系:10×T4 Buffer 1μL,载体 2μL,T7接头1μL,PCJ2接头1μL,***片段4μL,T4 DNA Ligase 1μL,4℃过夜连接。
(4)使用引物:
T7-F:CTACCTAGAGGGAGACCACAACGGTTTCCCACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC(SEQ ID NO.9)
T7-R:CATCCATGGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGTGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCT(SEQ ID NO.10)
PCJ2-F:GATCGTGTTGG(SEQ ID NO.11)
PCJ2-R:CGCGCCAACA(SEQ ID NO.12)
1.3含有sgRNA表达盒的载体构建
以psgR-Cas9-Os为模板,PCJ3-F和PCJ3-R为引物,用PrimeSTAR GXLDNAPolymerase扩增 sgRNA 片段,电泳检测回收目的片段,然后利用北京全式金生物技术有限公司的克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Zero Cloning Kit进行 TA 克隆,将目的片段与pEASY TM -T5载体连接,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,将验证正确的重组子命名为T-sgRNA。
用限制性内切酶MreⅠ和MluⅠ双酶切pCTE04,去除hpt和eGFP基因,电泳回收载体片段;用限制性内切酶MreⅠ和MluⅠ双酶切T-sgRNA载体,电泳回收目的片段;将回收的两个片段连接,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,将验证正确的重组子命名为p4-sgRNA。
以p4-sgRNA为模板,以PCJ4-F和PCJ4-R为,用高保真酶 GXL 扩增 prrn+靶位点+sgRNA+TpsbA 表达盒序列,进行TA克隆,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,将验证正确的重组子命名为pCTE04-sgRNA。
(1)PCR扩增体系:2×buffer 10μl,dNTP(2mM)4μl,上游引物0.5μl,下游引物 0.5μl,模板DNA0.1μl,KOD0.5μl,ddH2O 4.4μl,PCR程序:95℃ 变性30s,72℃(62℃)复性45s,72℃ 延伸1min。
(2)TA克隆链接体系:目的片段 9μL,pEASY TM-T5载体 1μL,30℃反应30min。
(3)酶切连接:酶切反应底物1μl,酶11μl,酶21μl,buffer1μl,加ddH2O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱30min。
(4)连接体系:10×T4 Buffer 1μL,载体 2μL,***片段 4μL,H2O 2μL,T4 DNALigase 1μL,4℃过夜连接。
(5)使用引物:
PCJ3-F:CGCCGGCGGGGGCGATGATTTACTTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQ IDNO.13)
PCJ3-R:ACGCGTAATTGGCGCACGCGCTACGGACTAG(SEQ ID NO.14)
PCJ4-F:CCCAAGCTTCTAAGCCCAATGTGTTTTTTTCTAG(SEQ ID NO.15)
PCJ4-R:CCCAAGCTTTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCC(SEQ ID NO.16)
1.4将sgRNA表达盒连接到pC1304-Cas9载体上
用限制性内切酶HimdIII单酶切pC1304-Cas9,回收载体片段;用限制性内切酶HimdIII单酶切酶切载体pCTE04-sgRNA回收sgRNA表达盒目的片段将上述两个片段用T4连接酶链接,连接产物热激转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序(附图2),将验证正确的重组子命名为pC1304-Cas9-sgRNA。
(1)酶切连接:酶切反应底物1μl,酶11μl,酶21μl,buffer1μl,加ddH2O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱30min。
(2)连接体系:10×T4 Buffer 1μL,载体 2μL,***片段 4μL,H2O 2μL,T4 DNALigase 1μL,4℃过夜连接。
1.5pC1304-Cas9-sgRNA中eGFP和Cas9基因的表达情况的验证
将含有pC1304-Cas9-sgRNA的大肠杆菌接种于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃ 200rpm培养14小时。取2 mL菌液12000rpm离心1min,使用双荧光蛋白手电筒观察菌体是否有荧光(附图3)。
使用天根生化科技(北京)有限公司DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒提取蛋白质。提取的蛋白质用BCA蛋白质定量试剂盒(天根)定量后,通过westernblot实验检测Cas9基因蛋白质表达量 (附图4)。
实施例2:水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻叶绿体转化中的应用
2.1基因枪转化
用基因枪的方法将pC1304-Cas9-sgRNA载体转化水稻TP309幼胚诱导的愈伤组织(2000颗),转化后的愈伤在潮霉素浓度为50mg/L的筛选培养基上、潮霉素浓度为20mg/L的分化培养基上,多次继代筛选、分化,将长出的幼芽转接到含潮霉素浓度为20mg/L的生根培养基上进行生根,待长到合适的高度后,移置炼苗室炼苗,3~5d后转到温室进行培养。
2.2 转基因植株的分子检测
经过多次筛选、分化后,共得到9株T 0代待检测的转化植株。使用Genmed公司的植物叶绿体DNA提取试剂盒,以叶绿体DNA为模板对T 0代的转基因植株进行 PCR 扩增检测(附图5)。
(1)PCR扩增体系:2×buffer 10μl,dNTP(2mM)4μl,上游引物0.5μl,下游引物 0.5μl,模板DNA 1μl,KOD 0.5μl,ddH2O 3.5μl,PCR程序:95℃ 变性30s,58℃复性45s,72℃ 延伸3min。
(2)使用引物:
PC9S-F:CGCTAATCTGGACAAAGTGC(SEQ ID NO.17)
PC9S-R:TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT(SEQ ID NO.18)。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4272
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200
ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260
aagaaaaagt aa 4272
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<212> DNA
<213> 人工合成
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atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 360
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ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
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aaataga 1027
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<212> DNA
<213> 人工合成
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atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
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ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
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ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggggcgatga tttacttcac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata 120
gcaagttaaa ataaggctag tccgtagcgc gtgcgccaat t 161
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gctgcgccag ggaaaagaat agaagaagca tctgactctt tcatgcatac tccacttggc 60
tcggggggat atagctcagt tggtagagct ccgctcttgc aattgggtcg ttgcgattac 120
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cactttttct aagtaatggg gaagaggact gaaacatgcc actgaaagac tctactgaga 240
caaaaagatg ggctgtcaaa aaggtagagg aggtaggatg ggcagttggt cagatctagt 300
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<212> DNA
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ctggagtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ctggaaggtg cggctggatc acctcctttt 60
cagggagagc taatgcttat gcttattggg tattttggtt tgacactgct tcacgcccaa 120
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ctgggctgtg agggctctca gccacatgga tagttcaatg tgctcatcag cgcctgaccc 480
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cctctcttct cgagaatcca tacatccctt atcagtgtat ggagagctat ctctcgagca 720
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ctcccttcct gaaaggaaga acgtgaaatt ctttttcctt tccgcaggga ccaggaggtt 960
ggatctagcc ataagaggaa tgcttggtat aaataagcca cttcttggtc ttcgactccc 1020
taagtcacta cgagcgccct cgatcagtgc aatgggatgt ggctatttat ctatctcttg 1080
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ggagggtctc ttaacgcctt cctttttctg cccatcggag ttatttccca aggacttgcc 1200
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tggttggatc gtaggggcga tgatttactt cacgggcgag gtctctggtt caagtccagg 1380
atggcccaga a 1391
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<212> DNA
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<400> 9
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catccatggg tatatctcct tcttaaagtt aaacaaaatt atttctagtg ggaaaccgtt 60
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cccaagcttc taagcccaat gtgttttttt ctag 34
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<212> DNA
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ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 60
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ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa 360
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ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg 900
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gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 4080
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ggtgagatcc catgtagatc taactttcta ttcactcgtg ggatccgggc ggtccggggg 7440
gggcactacg gctcctctct tctcgagaat ccatacatcc cttatcagtg tatggagagc 7500
tatctctcga gcacaggttg aggttcgtcc tcaatgggaa aatggagcac ctaacaacgc 7560
atcttcacag accaagaact acgagatcac cctttcattc tggggtgacg gagggatcgt 7620
accattcgag cctttttttc atgcttttcc cggcggtctg gagaaagcag caatcaatag 7680
gacttcccta atcctccctt cctgaaagga agaacgtgaa attctttttc ctttccgcag 7740
ggaccaggag gttggatcta gccataagag gaatgcttgg tataaataag ccacttcttg 7800
gtcttcgact ccctaagtca ctacgagcgc cctcgatcag tgcaatggga tgtggctatt 7860
tatctatctc ttgactcgaa atgggagcag agcaggtttg aaaaaggatc ttagagtgtc 7920
tagggttggg ccaggagggt ctcttaacgc cttccttttt ctgcccatcg gagttatttc 7980
ccaaggactt gccatggtaa gggggagaag gggaagaagc acacttgaag agcgcagtac 8040
aacggagagt tgtatgctgc gttcgggaag gatgaatcgc tcccgaaaag gagtctattg 8100
attctctccc aattggttgg atcgtagggg cgatgattta cttcacgggc gaggtctctg 8160
gttcaagtcc aggatggccc agaattccta agcccaatgt gtttttttct agttggattt 8220
gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 8280
cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatacacg 8340
ccggcgggta cctcgcgaat gcatctagag ggagaccaca acggtttccc actagaaata 8400
attttgttta actttaagaa ggagatatac ccatggacta taaggaccac gacggagact 8460
acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa gatggcccca aagaagaagc 8520
ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa gtacagcatc ggcctggaca 8580
tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga 8640
aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc 8700
tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa 8760
gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg 8820
ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata 8880
agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga 8940
agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc 9000
tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg 9060
agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga 9120
cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca 9180
tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg 9240
gcgagaagaa gaatggcctg ttcggcaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca 9300
acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct 9360
acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc 9420
tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg 9480
agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg 9540
acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt 9600
tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag 9660
agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg 9720
tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc 9780
cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc 9840
cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact 9900
acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg 9960
aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct 10020
tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc 10080
acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga 10140
ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc 10200
tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga 10260
aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc 10320
tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg 10380
aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga 10440
tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc 10500
tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc 10560
gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca 10620
gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag 10680
cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc 10740
ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga 10800
tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc 10860
agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc 10920
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tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca 11040
accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact 11100
ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc 11160
cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcagctgctg aacgccaagc 11220
tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac 11280
tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg 11340
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gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc 11460
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ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg 11580
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aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta 11700
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agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc 11820
aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc 11880
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acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa 12000
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gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga 12120
aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga 12180
agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca 12240
aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg 12300
ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca ctacctggac gagatcatcg 12360
agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc 12420
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acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca 12540
tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga 12600
gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca gctgggaggc gacaaaaggc 12660
cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gtaaggatcg tgttggcgcg 12720
cccaaggagg aaatcatcat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt 12780
ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct 12840
cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc 12900
gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt 12960
ccggaagtgc ttgacattgg ggagtttagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt 13020
gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctacaaccg 13080
gtcgcggagg ctatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc 13140
ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt 13200
gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc 13260
gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc 13320
gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc 13380
attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc 13440
tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg 13500
gagcttgcag gatcgccacg actccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc 13560
tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac 13620
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actcgtccga gggcaaagaa atagaggtac caataatttt gtttaacttt aagaaggaga 13800
tatacccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 13860
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gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 14040
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 14100
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 14160
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 14220
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gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 14340
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 14400
caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 14460
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 14520
caagtaaacg cgtatcgaag ctccatctac aaatggataa gatcctggcc tagtctatag 14580
gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt ctatcaagag ggtgctattg 14640
ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt acttacatag acttttttgt 14700
ttacattata gaaaaagaag gagaggttat tttcttgcat ttattcatga ttgagtattc 14760
tattttgatt ttgtatttgt ttaaaattgt agaaatagaa cttgtttctc ttcttgctaa 14820
tgttactata tctttttgat tttttttttc caaaaaaaaa atcaaatttt gacttcttct 14880
tatctcttat ctttgaatat ctcttatctt tgaaataata atatcattga aataagaaag 14940
aagagctata ttcgaacttg aatcttttgt tttctaattt aaataatgta aaaacggaat 15000
gtaagtaggc gagggggcgg atgtagccaa gtggatcaac tgcaggctgc gccagggaaa 15060
agaatagaag aagcatctga ctctttcatg catactccac ttggctcggg gggatatagc 15120
tcagttggta gagctccgct cttgcaattg ggtcgttgcg attacgggtt ggctgtctaa 15180
ttgtccaggc ggtaatggta gtatcttgta cctgaaccgg tggctcactt tttctaagta 15240
atggggaaga ggactgaaac atgccactga aagactctac tgagacaaaa agatgggctg 15300
tcaaaaaggt agaggaggta ggatgggcag ttggtcagat ctagtatgga tcgtacatgg 15360
acgatagttg gagtcggcgg ctctcctagg cttccctcat ctgggatccc tggggaagag 15420
gatcaagttg gcccttgcga atagcttgat gcactatctc ccttcaaccc tttgagcgaa 15480
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tctcttatct ttgaaataat aatatcattg aaataagaaa gaagagctat attcgaactt 16620
gaatcttttg ttttctaatt taaataatgt aaaaacggaa tgtaagtagg cgagggggcg 16680
gatgtagcca agtggatcaa aagctt 16706
Claims (5)
1.一种利用基因组编辑技术提高水稻叶绿体遗传转化效率的方法,其特征在于,所述方法是利用基因组编辑技术,对叶绿体基因组进行定点剪切,通过提高外源基因在水稻叶绿体基因组中的重组效率和整合效率,从而提高叶绿体遗传转化效率;
所述方法具体包括如下步骤:
(1)构建叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体;所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体中包含以下六段核苷酸序列:
第一核苷酸序列,其表达的蛋白质可以在第四核苷酸序列表达的单链RNA引导下对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切;
第二核苷酸序列,其为 hpt 潮霉素抗性基因,用于转化成功的转化子的筛选;
第三核苷酸序列,其表达的蛋白为绿色荧光蛋白,作为标记基因;
第四核苷酸序列,其转录表达产生的单链RNA可以引导第一核苷酸序列表达的蛋白质对同源重组位点中间特定的核苷酸序列进行定点剪切;
第五核苷酸序列,其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段;
第六核苷酸序列,其为水稻叶绿体基因组上相对应的同源重组片段;
(2)将步骤1所制备的构建体通过共转化转入水稻愈伤组织中,产生水稻叶绿体基因组转基因植株;
所述第一核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述第三核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述第四核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述第五核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述第六核苷酸序列SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基因组编辑技术为CRISPR/Cas9技术或TALEN技术。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。
4.一种叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体,其特征在于,所述叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体全序列如SEQ ID NO.19 所示。
5.如权利要求4所述的水稻叶绿体基因组CRISPR/Cas9基因编辑载体在水稻叶绿体转化中的应用。
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