CN108559759A - 三元穿梭载体及利用其构建clbv侵染性克隆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三元穿梭载体pCY，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。还公开了一种构建CLBV侵染性克隆的方法：(1)提取感染CLBV植株总RNA，反转录后采用pCY‑CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY‑CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的特异片段CLBV1、CLBV2；(2)用Stu I、Sma I酶切pCY；(3)TAR克隆：采用醋酸锂法将CLBV1、CLBV2和线性化pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV全长cDNA克隆pCY‑CLBV；(4)pCY‑CLBV质粒转化农杆菌，接种柑桔或本生烟，鉴定获得CLBV侵染性克隆。

Description

三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法。

背景技术

柑桔叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)属乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)柑桔病毒属(Citrivirus)的代表成员，可以通过嫁接侵染大多数的柑桔品种，还可以通过种子传播，具有一定的传播流行风险。构建CLBV侵染性克隆将有助于了解其分子特性及致病机理，对于CLBV的流行防控也具有重要作用。另外，CLBV在多数柑桔品种上不会引起明显的病毒感染症状，有望开发成为具有广泛应用前景的病毒载体。CLBV基因组大小约为8.7kb，包含三个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，分别编码复制相关蛋白、运动蛋白及外壳蛋白，其中运动蛋白为沉默抑制子，5’-端有甲基化帽子结构，3’-端有poly A尾巴。

侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cDNA侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大。有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组RNA病毒全长cDNA克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在E.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用***内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。

酵母转化伴随的同源重组(TAR)是一种利用酵母高效同源重组***来实现多个相互存在同源序列的DNA片段组装方法。Youssef等(Youssef F,Marais A,Faure C,GentitP,Candresse T.Strategies to facilitate the development of uncloned or clonedinfectious full-length viral cDNAs:Apple chlorotic leaf spot virus as a casestudy.Virology Journal,2011,8(1):1-12)在构建苹果褪绿叶斑病毒(Apple chloroticleaf spot virus,ACLSV)时，从36个经限制性内切酶酶切正确的E.coli克隆中仅鉴定出1个有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E.coli细胞存在着不稳定性，但经酵母TAR技术获重组克隆后，直接通过农杆菌介导接种获得了稳定的ACLSV的侵染性克隆。庹德财等(庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏.一种E.coli-Free的酵母同源重组***稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法.热带作物学报,2017,38(8):1492-1500)在构建番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)时，发现PLDMV在大肠杆菌中也存在不稳定现象，而当在PLDMV的P3基因中***内含子时，经酵母重组后转化E.coli能获得测序正确的稳定的侵染性克隆。由于CLBV基因组较大，采用传统的酶切连接法构建其侵染性克隆，费时费力且成功率低。在前期的尝试中，利用大肠杆菌作宿主很难获得CLBV的侵染性克隆，猜测可能与前述不稳定性有关。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法。

本发明实现其目的的技术方案为：

一种三元穿梭载体pCY，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

一种构建CLBV侵染性克隆的方法，包括如下步骤：

(1)提取感染CLBV植株的总RNA，反转录后以cDNA作为模板，采用两对特异引物pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2；所述引物pCY-CLBV1F、CLBV1R、CLBV2F、pCY-CLBV2R的序列分别如SEQ ID NO:3～6所示；

(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；

(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CLBV1、CLBV2和线性化三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV基因组全长cDNA克隆pCY-CLBV；

(4)侵染性克隆鉴定：将pCY-CLBV质粒通过电击转化农杆菌C58C1，接种柑桔或本生烟，筛选获得CLBV侵染性克隆。

在上述技术方案中，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pCY的构建方法为：

A、采用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体质粒DK1317-2，得到线性化的载体；

B、以pYES1L Vector为模板，以SEQ ID NO:1～2所示PYES2117F、PYES2117R为引物进行PCR扩增，然后回收目的片段；

C、将线性化DK1317-2载体和步骤B得到的回收片段进行重组融合，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，即得。

本发明的有益效果是：

本发明构建的三元穿梭载体pCY，不仅可以在酵母细胞中通过同源重组快速克隆病毒全长cDNA，而且可以经农杆菌介导直接接种寄主植物，还可以在大肠杆菌中复制扩增；本发明利用基于pCY的酵母高效同源重组***来构建CLBV基因组全长cDNA克隆，有效克服了传统酶切链接法中酶切位点的限制，整个重组过程仅需一次酵母转化即可，2周内即可获得病毒全长cDNA克隆，速度快、效率高；该发明通过TAR技术将覆盖病毒基因组全长cDNA的片段与三元穿梭表达载体pCY同源重组后，不转化大肠杆菌，而是直接转化农杆菌，从而获得病毒侵染性克隆，有效克服了病毒基因组全长cDNA在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象，侵染性克隆获得率显著提高，可达70％左右。

附图说明

图1是穿梭载体pCY的质粒图谱。

图2是CLBV全基因组核苷酸的***进化树。

图3是CLBV侵染本生烟的RT-PCR检测结果，其中，M：DNA分子标准，1：水，2：阴性对照，3-18：pCY-CLBV 1～16接种本生烟，19：阳性对照。

图4是Northern blot分析CLBV基因组RNA，其中，1：健康对照，2-6：农杆菌介导的pCY-CLBV 1、2、3、14、15侵染本生烟样品。

图5是农杆菌介导PCY-PVX接种本生烟后的症状图。

图6为PVX的RT-PCR检测结果，其中，M：DL2000 DNA Marker；1～2：样品；3：阳性对照；4：阴性对照。

具体实施方式

本发明所用材料和试剂来源如下：

酵母菌株YPH501、农杆菌菌株C58C1由法国Thierry Candresse教授惠赠。

限制性内切酶Sac II、Stu I、Sma I购自北京NEB公司；LA Taqase、PrimerSTARMax Premix、In-Fusion HD Cloning Kit、PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA SynthesisKit、JM109购自大连TaKaRa公司；Trizol试剂、pYES1LVector购自美国Invitrogen公司。

根据NCBI中已报道CLBV全基因组序列(GenBank登录号为AJ318061)，利用PrimerPriemer 5.0软件设计扩增CLBV基因序列的特异引物。pCY-CLBV1F与CLBV1R、CLBV2F与pCY-CLBV2R两对特异引物分别用于扩增覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2；PYES2117F和PYES2117R用于扩增包含酵母复制起始位点的片段；pCY-PVX-F和pCY-PVX-R用于扩增PVX全长以验证穿梭载体的有效性。在引物设计时，CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV1F与酶切后的pCY载体、pCY-CLBV2R与酶切后的pCY载体、pCY-PVX-R与酶切后的pCY载体、pCY-PVX-F与酶切后的pCY载体之间都分别有25～30bp的重叠序列，以便于在酵母中完成同源重组。引物均由英骏(上海)生物技术有限公司合成(表1)。

表1引物设计及其序列

注：方框内为SacII限制性内切酶识别序列，下划线部分是与pCY载体同源的30bp。

实施例1构建三元穿梭载体pCY

首先构建双元载体质粒DK1317-2：用质粒PCMBIA1301及pXT1改造得到，PCMBIA1301从市场上购买得到，pXT1载体由南京农业大学陶小荣教授惠赠。以pXT1载体为模板，用引物TL1310F/TL1310R扩增包含pXT1基因表达组件(LB-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS-RB)的片段。pCAMBIA1301质粒用PvuI消化。然后用凝胶提取试剂盒对包含预期片段的扩增和酶切产物进行提纯和融合重组。所获融合质粒用VspI酶切，大的片段重新连接起来以构建pCAMBI-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS，即DK1317-2。

采用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体质粒DK1317-2，得到线性化的载体。酶切反应体系：质粒DK1317-2 12μL，限制性内切酶Sac II 2.5μL，10×NEB Buffer 5μL，双蒸水23μL。酶切反应条件：37℃反应0.5h。

以pYES1L Vector为模板，PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117：反应体积为25μL，包括双蒸水8.5μL，PrimerSTARMax Premix(2×)12.5μL，特异性上下游引物各1μL，模板pYES1L Vector 1μL。反应条件：98℃1min，98℃10s，58℃15s，72℃2min，30个循环；72℃5min，4℃保存。然后利用DNA凝胶纯化试剂盒回收目的片段，命名为pYES1L-2117。

采用In-Fusion HD Cloning Kit进行重组，其体系包括：线性化DK1317-2载体加2μL，***片段pYES1L-2117加4μL，In-Fusion Enzyme加2μL，dd H₂O补齐至10μL。50℃，水浴30min，4℃保存。转化大肠杆菌JM109，37℃过夜培养，挑选阳性克隆，获得可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中生长的三元穿梭载体pCY(其质粒图谱见图1)。pCY含有酵母(ARS4/CEN5)，根癌土壤杆菌(pVS1或IV)和大肠杆菌(pBR322ori)的复制元件，基因表达盒2x35S-MCS-HDVRZ-NOS位于T-DNA***元件左臂和右臂之间。因此，载体pCY可以用于酵母细胞中DNA片段的同源组装以及随后将重组DNA分子转化到农杆菌或大肠杆菌中。此外，当病毒全长cDNA克隆到pCY的StuI和SmaI限制性酶切位点之间时，基因表达盒2x35S-MCS-HDVRZ-NOS将确保病毒基因组的精确起始和终止。三元穿梭载体pCY的核苷酸序列见SEQ ID NO:17。

实施例2构建CLBV的侵染性克隆

一、感病叶片总RNA的提取与CLBV的分段扩增

按照Trizol试剂说明书提取感病叶片的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。以所提取的总RNA为模版，使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，合成cDNA的第一链。以该cDNA为模板，用两对特异引物pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R对分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2，大小分别为4500bp和4247bp。PCR反应体系为25μL包括：双蒸水8.5μL，PrimerSTAR Max Premix(2×)12.5μL，特异性上下游引物各1μL，模板1μL。反应条件：98℃1min，98℃10s，55℃15s，72℃2min，35个循环；72℃5min，4℃保存。然后利用DNA凝胶纯化试剂盒回收目的片段CLBV1和CLBV2。

二、酵母同源重组构建CLBV基因组全长cDNA克隆

1)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY，得到pCY线性化的载体。反应体系：质粒pCY 13μL，限制性内切酶Sma I 1.0μL，10×NEB Buffer 5μL，双蒸水31μL。酶切反应条件：25℃反应0.5h，然后再加入Stu I 1.0μL，37℃孵育0.5h。

2)利用醋酸锂转化法转化酵母及菌落PCR

参照赵光远(Tuo D,ShenW,Yan P,Li X,Zhou P.Rapid Construction of StableInfectious Full-Length cDNA Clone of Papaya Leaf Distortion Mosaic VirusUsing In-Fusion Cloning.Viruses,2015,7(12):6241-6250)和Thierry Candresse(Youssef F,Marais A,Faure C,Gentit P,Candresse T.Strategies to facilitate thedevelopment of uncloned or cloned infectious full-length viral cDNAs:Applechlorotic leaf spot virus as a case study.Virology Journal,2011,8(1):1-12)采用的醋酸锂转化法，取制备好的酵母感受态细胞YPH501 100μL至2mL的离心管中，按顺序加入以下试剂：PEG4000(50％w/v)240μL，1mol/L的LiAc 36μL、10mg/mL的鲑鱼精DNA 25μL和pCY线性化的载体200ng、CLBV1、CLBV2各100ng，震荡使转化体系中的组分充分混匀，在30℃摇床中250r/min摇菌30min，42℃水浴热激15min；6000r/min离心3min，弃去上清液，使用300μL ddH₂O重悬细胞，均匀涂布在Trp缺陷型筛选平板上，于30℃培养2～4d。挑取单克隆菌落，利用特异引物CLBV1F、CLBV5R进行菌落PCR鉴定。结果表明，挑取的24个菌落中22个为PCR阳性。

3)CLBV基因组全长cDNA克隆鉴定

提取前述PCR阳性菌落的酵母质粒，利用pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR检测以鉴定CLBV全长cDNA克隆，结果从22个中鉴定出16个全长质粒，CLBV全长cDNA克隆阳性率71.4％。随机选1个全长cDNA克隆测序，结果表明：CLBV全长大小8747bp，包含3个开放阅读框，ORF1为5889nt、ORF2为1089nt、ORF3为1092nt，5'末端有甲基化帽子结构，3'末端具有poly(A)。序列比对结果显示，该序列与GenBank已登录的其它CLBV全长序列的核苷酸一致性为79％～98％，其中与柑桔来源的EU857540一致性最高，为98％，与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79％。在利用MEGA6软件构建的***发育树上，该序列与柑桔来源的CLBV分离株聚为一簇(图2)。

三、CLBV基因组全长cDNA克隆的侵染性鉴定

1)转化农杆菌及接种

提取CLBV基因组全长cDNA克隆质粒，通过电击转化农杆菌C58C1。挑取CLBV阳性单克隆接种含20mg·L^-1Rif，50mg·L^-1Kan的LB液体培养基，200r·min^-1，28℃振荡培养12～16h。同时，接种Hc-Pro或P19表达质粒的农杆菌单克隆。离心收集菌体，用含有10mmol·L^{- 1}MgCl₂，10mmol·L^-1MES，200μmol·L^-1AS的接种缓冲液悬浮，使其OD₆₀₀分别为0.8～1.2和0.2～0.5。静置2h后通过注射接种4～6叶期的本生烟叶片，并通过真空浸润接种5～7天大的锦橙幼苗。同时，以pCY空载质粒的农杆菌作为阴性对照。

2)RT-PCR法检测CLBV

接种20d后，提取接种烟草上位叶片或新生锦橙叶片的总RNA，用特异引物CLBV1F、CLBV5R进行RT-PCR扩增检测。PCR反应体系如下：先后在PCR管中加入模板1μL和ddH₂O 1μL，94℃解链3min后置于冰上，加入ddH₂O 2.3μL，2×1step buffer 5μL，CLBV1F 0.2μL，CLBV5R 0.2μL，PrimeScript 1step Enzyme Mix 0.3μL。反应程序：50℃30min，94℃2min，94℃30s，50℃30s，72℃45s，35个循环，72℃5min，4℃停止。结果表明，pCY-CLBV1、2、3、5、8、9、12、13、14、15、16接种植株检测出CLBV特异性条带(如图3所示)。初步说明，CLBV侵染性克隆构建成功。

3)Northern blot法检测CLBV

有报道表明，本生烟接种CLBV并不表现明显症状。为进一步确定所构建克隆的侵染性，将RT-PCR检测阳性的本生烟样本随机选取5个进行Northernblot杂交验证。

探针的制备与标记：采用PCR制备探针，体系如下：PCR buffer with MgCl₂ 5μL，PCR DIG Probe Synthesis Mix 5μL，01018-F 0.5μL，01018-R 0.5μL，Enzyme mix 0.75μL，模板为样品CLBV反转录cDNA 1μL，H₂O to 50μL。反应程序：预变性94℃5min，变性94℃30s，，退火53℃30s，延伸72℃30s，35个循环；再延伸72℃5min，琼脂糖凝胶电泳检测结果，胶回收之后保存备用。

膜制备、杂交及信号检测：制备1％甲醛变性凝胶电泳，25v恒压、4℃、电泳过夜。再将凝胶中的DNA转至尼龙膜。预杂交：取10.0mL DIG Easy Hyb，加入杂交管中，50℃杂交炉中预杂交2h；排尽预杂交液，在10.0mL DIG Easy Hyb加入新变性好的探针，混匀，50℃杂交仪中杂交过夜。然后洗膜，最后用凝胶成像***扫描尼龙膜检测Northern blot杂交信号。

结果显示：pCY-CLBV 1、2、3、14、15接本生烟可以检测到CLBV特异性条带，而对照样本未检测到任何条带(见图4)，表明pCY-CLBV 1、2、3、14、15为侵染性克隆。

此外，随机选取5个侵染本生烟呈阳性的单克隆采用真空浸润法接种锦橙(C.sinensis)幼苗。接种40天后，利用RT-PCR均可以在新发叶片中检测到CLBV特异性条带，这进一步确认CLBV侵染性克隆构建成功。

实施例3穿梭载体pCY用于PVX侵染性克隆构建

参照实施例2的方法将本发明的穿梭载体pCY用于PVX(Potato Virus X)侵染性克隆构建，PVX全长cDNA的扩增采用引物pCY-PVXF、pCY-PVXR，酵母菌落PCR检测采用引物PVX-F、PVX-R。将验证为阳性的pCY-PVX质粒转化农杆菌C58C1并通过农杆菌注射浸润本生烟，接种10天后的观察结果显示：注射pCY-PVX的烟草症状和阳性对照的完全一样，与阴性对照形成明显的对比(如图5所示)。这说明PVX得到了高效表达，基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系构建成功，可用于其他病毒的侵染性克隆构建。采集接种10天后的本生烟嫩叶，利用Plus法抽提叶片总核酸进行普通RT-PCR检测。结果显示，pCY-PVX接种的上位叶片扩增出与预期大小相符的目的条带(如图6所示)，这说明基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系构建成功。

实施例4穿梭载体pCY用于CYVCV侵染性克隆构建

参照实施例2的方法将本发明的穿梭载体pCY用于CYVCV(柑桔黄化脉明病毒，Citrus yellow clearing vein virus)侵染性克隆构建。通过TAR技术将其全长cDNA克隆至三元载体pCY，成功获得柑桔黄化脉明病毒四川安岳分离物基因组全长cDNA克隆，测序结果表明CYVCV-AY基因组为7529bp，包含6个开放阅读框，与目前已报道的CYVCV分离株一致。序列比对结果显示，随机选取的4个CYVCV-AY基因组全长cDNA克隆的核苷酸序列相似性均在99％以上；在***进化树上，CYVCV-AY的4个克隆均与柑桔来源的CYVCV分离株聚为一簇。通过TAR克隆在国内外首次获得了CYVCV的侵染性cDNA克隆，症状观察及RT-PCR检测结果表明，所获得的pCY-CYVCV具有侵染性。

序列表

<110> 西南大学

<120> 三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法

<160> 17

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PYES2117F

<400> 1

gccgattttg aaaccgcgga gtcagtgagc gaggaagcg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PYES2117R

<400> 2

ctgcctgtga tcaccgcggc atcttttact ttcaccagc 39

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pCY-CLBV1F

<400> 3

atataaggaa gttcatttca tttggagagg agaaaagcaa cgaaagcaac ctacacaac 59

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CLBV1R

<400> 4

aaagggtcac cctccaacct ttcctcccta 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CLBV2F

<400> 5

tagggaggaa aggttggagg gtgacccttt 30

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pCY-CLBV2R

<400> 6

cgcgaggagg tggagatgcc atgccgaccc tttttttttt tttttttttt gtctaaa 57

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pCY-PVX-F

<400> 7

atataaggaa gttcatttca tttggagagg agaaaactaa accatacacc accaac 56

<210> 8

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pCY-PVX-R

<400> 8

cgcgaggagg tggagatgcc atgccgaccc gggttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttatttat 99

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CLBV1F

<400> 9

agccatagtt gaaccattcc tc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CLBV5R

<400> 10

gcagatcatt caccacatgc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PVX-F

<400> 11

atgtcagcac cagctagcac 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PVX-R

<400> 12

ggatccttat ggtggtggta gag 23

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 01018-F

<400> 13

aggtcttctt cgccattt 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 01018-R

<400> 14

cccttcttcc tccagttt 18

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> TL1310F

<400> 15

aactcgagct tgtcgattaa tgcatgcctg cagtcaacat g 41

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> TL1310R

<400> 16

aaatgtttga acgatcgggg aaattcgagc tct 33

<210> 17

<211> 10347

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 三元穿梭载体pCY

<400> 17

attaatgcat gcctgcagtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg 420

ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg 600

gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 660

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggcct atgagtaaag 780

gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt gatgttaatg 840

ggtacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga aaacttaccc 900

ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt gtcactactt 960

tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg cacgacttct 1020

tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catcttcttc aaggacgacg 1080

ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc aacaggatcg 1140

agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag ttggaataca 1200

actacaactt ccacaacgta tacatcatgg ccgacaagca aaagaacggc atcaaagcca 1260

acttcaagac ccgccacaac atcgaagacg gcggcgtgca actcgctgat cattatcaac 1320

aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac ctgtccacac 1380

aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt cttgagtttg 1440

taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataaccc gggtcggcat 1500

ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgtc gtccactcgg 1560

atggctaagg gagagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt 1620

aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt 1680

taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat 1740

tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta 1800

ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattaa actatcagtg 1860

tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga 1920

tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac 1980

agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg 2040

gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta 2100

cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca 2160

taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg 2220

ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg 2280

ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc 2340

gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag 2400

tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca 2460

tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc 2520

cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa 2580

tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc 2640

cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag 2700

gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg 2760

cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg 2820

aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac 2880

aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga 2940

ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg 3000

gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt 3060

ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag 3120

cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg 3180

gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc 3240

gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc 3300

gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt 3360

gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc 3420

gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc 3480

gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg 3540

gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc 3600

gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg 3660

tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc 3720

gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag 3780

gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga 3840

gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa 3900

cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg 3960

aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc 4020

tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga 4080

attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg 4140

gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc 4200

cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc 4260

atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc 4320

cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca 4380

agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc 4440

gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga 4500

cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg 4560

tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc 4620

cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc 4680

ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt 4740

gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca 4800

gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg 4860

tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag 4920

ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc 4980

tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc 5040

cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc 5100

cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc 5160

cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc 5220

ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg 5280

caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca 5340

aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat 5400

tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta 5460

cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc 5520

cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact 5580

gtctggccag cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc 5640

cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg 5700

cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg 5760

gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 5820

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 5880

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac 5940

gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 6000

agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 6060

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 6120

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 6180

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 6240

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 6300

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 6360

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 6420

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 6480

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 6540

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 6600

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 6660

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 6720

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 6780

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6840

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6900

tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat attttatttt 6960

ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc 7020

gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc 7080

gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc 7140

tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc 7200

atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc 7260

ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt 7320

atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg catacagctc 7380

gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc 7440

ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga cctttggaac 7500

aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat cataggtggt 7560

ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc ccaccagctt 7620

atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag 7680

ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttc ctcttttcta 7740

cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc 7800

cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg 7860

gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc ggagtcagtg agcgaggaag 7920

cgcgtaacta taacggtcct aaggtagcga atcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 7980

ctgtgcggta tttcacaccg catagatcgg caagtgcaca aacaatactt aaataaatac 8040

tactcagtaa taacctattt cttagcattt ttgacgaaat ttgctatttt gttagagtct 8100

tttacaccat ttgtctccac acctccgctt acatcaacac caataacgcc atttaatcta 8160

agcgcatcac caacattttc tggcgtcagt ccaccagcta acataaaatg taagctttcg 8220

gggctctctt gccttccaac ccagtcagaa atcgagttcc aatccaaaag ttcacctgtc 8280

ccacctgctt ctgaatcaaa caagggaata aacgaatgag gtttctgtga agctgcactg 8340

agtagtatgt tgcagtcttt tggaaatacg agtcttttaa taactggcaa accgaggaac 8400

tcttggtatt cttgccacga ctcatctcca tgcagttgga cgatatcaat gccgtaatca 8460

ttgaccagag ccaaaacatc ctccttaagt tgattacgaa acacgccaac caagtatttc 8520

ggagtgcctg aactattttt atatgctttt acaagacttg aaattttcct tgcaataacc 8580

gggtcaattg ttctctttct attgggcaca catataatac ccagcaagtc agcatcggaa 8640

tctagagcac attctgcggc ctctgtgctc tgcaagccgc aaactttcac caatggacca 8700

gaactacctg tgaaattaat aacagacata ctccaagctg cctttgtgtg cttaatcacg 8760

tatactcacg tgctcaatag tcaccaatgc cctccctctt ggccctctcc ttttcttttt 8820

tcgaccgaat taattcttaa tcggcaaaaa aagaaaagct ccggatcaag attgtacgta 8880

aggtgacaag ctatttttca ataaagaata tcttccacta ctgccatctg gcgtcataac 8940

tgcaaagtac acatatatta cgatgctgtt ctattaaatg cttcctatat tatatatata 9000

gtaatgtcgt gatctatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 9060

ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 9120

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 9180

gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa 9240

tgtcatgata ataatggttt cttagacgga tcgcttgcct gtaacttaca cgcgcctcgt 9300

atcttttaat gatggaataa tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt ttatgttttg 9360

tatttggatt ttagaaagta aataaagaag gtagaagagt tacggaatga agaaaaaaaa 9420

ataaacaaag gtttaaaaaa tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata tttattagac 9480

aagaaaagca gattaaatag atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca 9540

ggattttcgt gtgtggtctt ctacacagac aaggtgaaac aattcggcat taatacctga 9600

gagcaggaag agcaagataa aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca 9660

tcttcggaaa acaaaaacta ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt 9720

tatatattta tattaaaaaa tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga 9780

cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 9840

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 9900

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 9960

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgccgcggt 10020

gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca 10080

tccgtgtttc aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag 10140

caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc 10200

tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg 10260

caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac 10320

gtttttaatg tactgaatta acgccga 10347

Claims (3)

1.一种三元穿梭载体pCY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

2.一种构建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取感染CLBV植株的总RNA，反转录后以cDNA作为模板，采用两对特异引物pCY-CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY-CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的两个特异片段CLBV1、CLBV2；所述引物pCY-CLBV1F、CLBV1R、CLBV2F、pCY-CLBV2R的序列分别如SEQ ID NO:3～6所示；

(2)采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭载体pCY，得到pCY线性化的载体；

(3)TAR克隆：采用醋酸锂转化法将CLBV1、CLBV2和线性化三元穿梭载体pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV基因组全长cDNA克隆pCY-CLBV；

(4)侵染性克隆鉴定：将pCY-CLBV质粒通过电击转化农杆菌C58C1，接种柑桔或本生烟，鉴定获得CLBV侵染性克隆。

3.如权利要求2所述的构建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的三元穿梭载体pCY的构建方法为：

A、采用限制性内切酶SacII单酶切双元载体质粒DK1317-2，得到线性化的载体；

B、以GenepYES1LVector为模板，以SEQ ID NO:1～2所示PYES2117F、PYES2117R为引物进行PCR扩增，然后回收目的片段；

C、将线性化DK1317-2载体和步骤B得到的回收片段进行重组融合，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，即得。