CN113227115A - 肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过连续延伸肽链的第二末端来合成肽或蛋白质的方法，肽链的羧酸官能团(C端)或胺官能团Nα与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、并且优选为15个至50个单元的聚烯烃链。

Description

肽的合成方法
技术领域
本发明涉及有机化学领域，并且更具体而言涉及由氨基酸合成肽或蛋白质。本发明涉及用于在液相中体外合成肽的方法，该方法不使用固体基底或不溶性树脂。该方法基于使用新的锚定分子家族，即聚烯烃的衍生物或者聚烯烃或聚烯烃类(polyalcènes)的低聚物，新的锚定分子家族与氨基酸或氨基酸衍生物结合，在非极性溶剂中表现出良好的溶解性，但在水中表现出较差的溶解性。该方法使得能够获得比使用固体基底或液体基底的已知方法更纯并且/或者更容易纯化的肽。这易于自动化。
背景技术
肽的药理学具有巨大的医学和经济利益，但是从科学观点出发，它仍然在蛋白质和遗传生物化学的范畴内。尽管胰岛素(由51个氨基酸组成的天然蛋白质)取得了巨大的成功，但在20世纪末，作为活性药物成分所开发的肽的数量仍然很少。然而，大约三十种由肽组成的新的活性成分在2000年至2016年之间取得了销售授权，并且相当数量的肽正在进行临床和临床前试验(参见A.Henninot等人的出版物，“The Current State of PeptideDrug Discovery:Back to the Future？”，发表于J.Med.Chem.,2018,61,4,1382-1414)。这些候选药品中的大多数是因其特定功能而为人所知的天然肽，其他一些衍生自天然序列，并且还有一些完全是合成的。
至于施用于数百万患者的胰岛素，通过基因修饰的生物体合成胰岛素是获得足够纯的工业量的优选途径。对于许多其他治疗性肽，从头合成(即，从单个氨基酸合成)是用于获得必要量的主要方法。在这种情况下，肽纯度是所选择的合成方法的主要技术和经济挑战。同时，环境因素成为日益重要的社会焦点。为此，化学家正在寻找符合这一标准的方法(参见A.Isidro-Llobet等人的出版物，“Sustainability Challenges in Peptidesynthesis and Purification:From R&D to Production,”，发表于J.Org.CHEM.,2019,84,4615-4628)。肽的纯化(通常通过高效液相色谱HPLC进行)可能占成品***格的大部分，但也可能产生废物。
有两种主要的肽合成方法，其特征在于发生化学反应的相的物理状态不同：液相(该合成也称为“溶液合成”)和固相(该合成也称为“固相合成”)。
所有氨基酸都具有至少两个反应性化学官能团：胺官能团(Nα中心)和羧酸官能团(C端)。某些氨基酸还具有能够与Nα中心或C端反应的侧链。肽合成策略的关键在于保护基的选择，通过保护基在方法的某些步骤中保护反应中心。因此，每加入一个氨基酸都需要如下的循环步骤：保护-活化/偶联-去保护。在合成结束时，切除保护基以产生靶标肽。因此，根据发生肽合成的相的物理状态，常见的基本循环：保护-活化/偶联-去保护是不变的，只是使用的保护基不同。更具体而言，这种循环包括几个步骤：
-用在氨基酸缩合反应后可切除的保护基来保护氨基酸的胺官能团(Nα)；
-如果需要，用在肽合成结束时可切除的保护基来保护侧链；
-活化受保护的氨基酸Nα的羧酸官能团，然后其与胺官能团Nα游离且羧酸官能团受保护的氨基酸衍生物或肽缩合；
-在序列中所有氨基酸的迭代(活化/偶联-去保护)结束时，通过保护基的完全去保护获得靶标肽。
这里以三肽的合成为例来解释保护-活化/偶联-去保护循环。
根据反应式1所示的称为“Boc”的解决策略，提供第一、第二和第三氨基酸(这里称为AA1、AA2和AA3)。由叔丁氧羰基(通常称为“Boc”)暂时保护氨基酸AA2的胺官能团(Nα)。然后我们活化所述受保护的氨基酸的羧酸官能团(C端)，其与氨基酸AA1的甲酯的游离(即，未保护的)胺官能团(Nα)缩合，从而产生二肽。接下来，将所得二肽的氨基酸AA2的胺官能团(Nα)去保护(即，用诸如三氟乙酸之类的酸切除保护基Boc)。氨基酸AA3的胺官能团(Nα)受保护。然后，我们使氨基酸AA3的羧酸官能团(C端)活化，其结合(去保护的二肽的)氨基酸AA2的胺官能团(Nα)，以产生受保护的三肽。在将AA3携带的Boc基团去保护后，获得三肽。该方法包括最少五个反应步骤，对于添加到肽中的每个额外氨基酸包括两个步骤(活化/偶联-去保护)。
[化学1]
反应式1：
Figure BDA0003128801640000031
可以将氨基酸AA1锚定于固体基底或锚定于液相中的有机增溶分子从而进行该方法。
根据反应式2所示的称为“Fmoc”的策略，可将芴基甲氧羰基用作胺官能团的保护基。该策略特别适合于在固体基底上的合成。提供了第一、第二和第三氨基酸(AA1、AA2和AA3)。这全部始于用芴基甲氧羰基(通常称为“Fmoc”)保护氨基酸AA1的胺官能团(Nα)，然后通过其羧酸官能团(C端)将其锚定到固体树脂(在反应式2中用黑色圆圈表示)，从而与官能化树脂的化学官能团(醇或胺)形成酯或酰胺类型的共价键连接的共价键。将锚定到树脂上的氨基酸的胺官能团(Nα)去保护。然后用Fmoc保护基保护氨基酸AA2的胺官能团(Nα)。将所得衍生物的羧酸(C端)活化从而使其与锚定到树脂上的氨基酸AA1的胺官能团(Nα)结合，从而产生锚定到树脂上的N-保护二肽。切除二肽的Fmoc基团(在AA2上)。由Fmoc基团保护氨基酸AA3的胺官能团(Nα)，然后活化其羧酸(C端)，然后使所得物偶联到具有游离胺官能团的锚定二肽上，从而产生N-保护三肽，N-保护三肽通过其氨基酸AA1的酸官能团(C端)保持与固体基底连接。该方法包括最少七个反应步骤，对于添加到肽中的每个额外氨基酸包括两个步骤(活化/偶联-去保护)。
[化学2]
反应式2：
Figure BDA0003128801640000041
这两种合成途径是本领域技术人员公知的(参见D.Voet和J.G.Voet的标题为“Biochimie”[Biochemistry]的手册(第2版，Brussels2005)的第7-5节)。可以在液相中或在固体基底上(在这种情况下，氨基酸与固体基底连接，即Merrifield合成)实施该合成途径。实际上，所提供的氨基酸处于Fmoc-或Boc-保护状态，并将处于这种保护状态的氨基酸直接用于活化/偶联反应。
在液相肽合成(LPPS)过程中，全部反应都在均相溶液中进行。Bodansky和duVigneaud(J.Am.Chem.Soc.,1959,51,5688-5691)已经描述了这种方法。起始氨基酸的羧酸官能团(C端)以甲酯的形式受到保护，并且随后的氨基酸在其胺官能团(Nα)受苄氧羰基保护并且其羧酸官能团(C端)被硝基苯基酯活化之后进行连续缩合。通过沉淀或用水洗涤(萃取)来纯化全部合成中间体。这种肽合成方法冗长且繁琐，并且生成肽的收率低。例如，如Schwyzer和Sieber(Helv.Chim.Acta 1966,49,134-158)所述，ACTH合成的总收率为约7％。
Beyermann等人(Ree.Trav.Chim.Holland 1973,92,481-492)报道了对该方法的改进。其包括以苄基酯的形式保护氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)，并在过量的N-保护氨基酸(Nα)酐的存在下进行偶联(或缩合)反应，以提高收率。最终，尽管偶联反应的收率得到提高，但当所得肽达到约五个氨基酸时，有机相溶解度降低。
为了提高溶解度，氨基酸或蛋白质可以与所谓的增溶保护基结合，该增溶保护基例如为EP 0 017 536(CM Industries)中描述的(苯磺酰基)乙酯(OPSE)。实际上，该保护基使得氨基酸或合成肽溶解在N,N-二甲基甲酰胺中。在每次迭代(活化/偶联-去保护)后，通过固体的沉淀和过滤进行纯化，这涉及一些操作困难。
Mutter和Bayer(Nature 1972,237,512-513)描述了通过利用诸如聚乙二醇(PEG)之类的线性非交联聚合物，以将氨基酸或肽保持在溶液中的方法。在这种情况下，也是通过沉淀或超速离心以除去副产物。
最近，EP 2 612 845A1和US 2014/0296483(Ajinmoto Co.,Inc.)描述了用于使氨基酸和肽增溶的新的保护基(或锚定分子)。这样，根据使用的锚定分子，通过简单水洗或者通过沉淀和过滤进行纯化。归功于羧酸官能团的这些高亲脂性保护基，制备了由20个氨基酸残基组成的抗凝血剂比伐卢定，总收率为73％，并且纯度为84％(参见D.Takahashi等人，Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,7803-7807)。尽管该技术具有优势，但其极限(即，可能锚定的氨基酸残基的数量)仍然未知。此外，缺点是这些锚定分子的经济和环境成本。
已知其他氨基酸偶联策略。作为实例，可以使用双官能团，该双官能团通过形成高反应性中间体环状结构而活化氨基酸的羧酸官能团(C端)并保护胺官能团(Nα)这两者。通常，它们容易与第二氨基酸衍生物的胺官能团(Nα)反应从而形成二肽。遗憾的是，所得物质反应性很高，并且通常随后发生不期望的聚合反应。在已描述的双官能团中，我们列举了光气(参见R.B.Woodward和C.H.Schramm,J.Am.Chem.Soc.,1947,69,1551-1552)、二氯二甲基硅烷(参见S.H.Van Leeuwen等人，Tetrahedron Letters 2002,43,9203-9207)、六氟丙酮(参见J.Spengler等人，Chem.Rev.,2006,106,4728-4746)和甲醛(参见J.M.Scholtz,P.A.Bartlett,Synthesis 1989,542-544)。
Merrifield(J.Am.Chem.Soc.,1963,85,2149-2154)描述了固相肽合成。这包括将第一氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)连接到不溶性树脂(基底)上。因此，过量使用试剂以确保活化/偶联步骤的完全转化。通过简单过滤和洗涤树脂进行纯化。尽管该技术更简单并且可以自动化，但是存在许多缺点，例如过量使用的试剂的成本和损失，以及合成肽缺乏均一性，因为实际上不可能获得均一性的肽：认为该体系是退化的(dégénéré)。此外，通过高效液相色谱纯化从而制备这些异质性肽是繁冗的，这是因为其溶剂消耗大且生态成本不可接受。
已知每个反应步骤很少是定量的，因此在整个合成过程中会产生累积的损失，并且已知每个步骤涉及溶液中的试剂(偶联剂和副产物)，消除这些试剂存在问题，因此以更少的且更生态相容的制造成本制造高纯度肽的更简单的方法受到关注。该方法应当适用于所有类型的天然氨基酸和广谱的非天然氨基酸。这是本发明的目的。
应当强调的是，在治疗性肽的情况下，收率小于100％不仅意味着试剂的损失，而且意味着形成可能难以与靶标肽分离的副产物；如果人们希望获得可能最纯的肽以清楚地表征其生物学效应，那么人们要接受纯化所致的额外成本，或者要接受杂质的存在可能在评估所观察到的生物学效应中引起错误的风险。
本发明所要解决的问题是提供一种以更高的收率和更低的成本合成更纯的肽或蛋白质的更有益生态的方法，该方法可以自动化。该方法必须至少适用于所有天然氨基酸，并且优选适用于广谱非天然氨基酸。该方法不应当涉及昂贵或难以合成的锚定分子或基底。
发明内容
本发明提出通过在液相中使用聚烯烃或者聚烯烃或聚烯烃类的低聚物来制造高纯度肽或蛋白质，以解决现有技术中存在的困难。实际上，本发明人发现，通过使用聚烯烃、特别是聚异丁烯(PIB)衍生物作为锚定分子或液体基底，使得氨基酸在有机溶液(卤化溶剂和非卤化溶剂)中溶解并合成肽，同时通过简单的萃取或洗涤(在本发明的情况下为用水或水/乙醇或水/乙腈混合物)或通过简单过滤从而有助于其纯化。此外，这些锚定分子中的一些(特别是某些聚异丁烯(PIB)衍生物)是市售产品，或者它们易于以低成本直接合成。
因此，本发明的主题是通过连续延伸肽链的第二末端(Nα)来合成肽或蛋白质的方法，其中肽链的第一末端通过其羧酸官能团(C端)与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包含具有至少10个单体单元、并且优选为15个至50个单元的聚烯烃链。有利地，将锚定分子的一个末端官能化，从而锚定第一氨基酸。
所述锚定分子有利地为聚烯烃。
所述锚定分子有利地仅包含一个聚烯烃链；因此，可以通过(异丁烯的)简单聚合反应获得聚烯烃链。
所述锚定分子在其每个单元中可以包含相同或不同的烷基，所述烷基优选选自由甲基和乙基组成的组。所述聚烯烃链的平均分子量有利地为600至20,000，并且优选为700至15,000。所述聚烯烃链可包含不超过5％、优选不超过3％的多个不饱和碳-碳键。聚烯烃链优选为聚异丁烯链。
在根据本发明的方法的有利实施方案中，所述锚定分子包含由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链(或所述锚定分子为由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链)：
o-X官能团，其中X选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-SH；
o-Z-C6H4X1官能团，其中
■Z为O或不存在，
■X1选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-SH、-NH-NH2、-CXRR1、-C6H3R'(CRX)
其中X选自由-OH、-NH2、-SH组成的组，并且R选自由-H、芳基、杂芳基组成的组，并且R'选自由-H、-烷基、-O-烷基、-芳基、-O-芳基、杂芳基、-O-杂芳基组成的组，
o-CR"＝CH-CHX官能团或-CR"H-CH＝CH-CHX官能团，其中X选自由-OH、-NH2、-SH组成的组，并且R"为甲基或乙基。
该基团代表聚烯烃链的官能化。
所述肽链的所述第一末端为第一氨基酸AA1单元；锚定分子与该第一氨基酸AA1结合，其或者与第一氨基酸AA1的羧酸官能团(C端)结合、或者与第一氨基酸AA1的胺官能团(Nα)结合。所述肽链由n个氨基酸单元形成；其第二末端为另一氨基酸单元AAn。随着方法的进行，肽链通过连续延伸而延长，并且在各延伸步骤的过程中，将另一氨基酸单元AA(n+1)添加至所述第二末端。
可以由Boc或Fmoc基团或由任何其他合适的保护基来保护在根据本发明的方法中涉及的氨基酸的胺官能团(Nα)。
天然氨基酸和/或非天然氨基酸和/或合成氨基酸可用于所述肽链中。
根据本发明的方法包括至少一个这样的步骤，其中所述肽链与所述锚定分子连接，并通过在非极性溶剂中进行萃取而将肽链与反应介质分离。
根据本发明的方法使得能够获得高纯度的肽或蛋白质，在最后的肽链延伸步骤之后将高纯度的肽或蛋白质从其锚定分子上切割下来，以按预期使用，例如用作用于临床前试验或临床试验的活性成分。
具体实施方式
定义
在本发明中，将“氨基酸”理解为包括：天然氨基酸和非天然氨基酸。“天然”氨基酸包括可以在天然来源的蛋白质中发现的L型氨基酸，即：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gin)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(ILe)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
“非天然”氨基酸包括以上定义的D型天然氨基酸、某些天然氨基酸(例如：精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸)的同型以及正亮氨酸和正缬氨酸。它们还包括非天然氨基酸，例如：
Abu＝2-氨基丁酸CH3-CH2-CH(COOH)(NH2)
iPr＝异丙基-赖氨酸(CH3)2C-NH-(CH2)4-CH(COOH)(NH2)
Aib＝2-氨基异丁酸
F-trp＝N-甲酰基-色氨酸
Orn＝鸟氨酸
Nal2＝2-萘基丙氨酸
“非天然”氨基酸还包括所有的合成氨基酸。
本文中还使用了术语“受保护的氨基酸”来指代暂时受保护的氨基酸，特别是如上所述；例如，可以由Fmoc、Boc或苄基或任何其他合适的保护基来保护胺官能团(Nα)。
本发明的肽制备方法在液相中使用聚烯烃、或更具体而言为聚烯烃的低聚物(其中聚烯烃也称为聚烯烃类)以及它们的衍生物，以作为用于氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)、或用于氨基酸或肽的胺官能团(Nα)、或用于所述氨基酸或肽的侧链(为酯、酰胺、醚或硫醚键的形式，或任何其他官能团)的锚定分子或保护基。聚烯烃分子包含通过单键连接的碳原子链。它们可以包含由相同或不同烷基组成的支链，但优选包含由相同烷基组成的支链。优选地，使用具有至少10个、并且优选为15个至50个单体单元的聚合物。优选为均聚物，但也可以使用共聚物，在这种情况下，碳原子链中的不饱和键的数量有利地不超过5％，并且优选不超过3％。
聚烯烃分子优选为聚异丁烯(PIB)，这是一类自上世纪三十年代以来已知的聚合物，但也可以使用聚丙烯衍生物。
这些锚定分子优选以官能化衍生物的形式用于根据本发明的方法中，这将在下面更详细地解释。
根据本发明，这些锚定分子通过酰胺、酯、苄基或烯丙基型的共价键或任何其他官能团与氨基酸的羧酸官能团(C端)或与胺官能团(Nα)连接。这假定了锚定分子以适当的官能化形式存在，在本说明书中，将锚定分子称为“PIB衍生物”，应当记住，在本文中该术语还包括锚定分子的衍生物，其并非聚异丁烯的衍生物，而是根据上述定义的其他聚烯烃的衍生物。通常，锚定分子的这种官能化为末端官能化，优选在碳原子链的一个末端处的末端官能化；下面将对其进行描述。
用作锚定分子的聚烯烃低聚物的典型特征为平均分子质量，但也可以使用包含具有给定链长的相同分子的“纯”低聚物。
PIB衍生物和氨基酸之间的该反应使得产生以下产物，该产物的特征在于，当PIB衍生物与可能具有受保护的侧链的氨基酸或氨基酸衍生物连接时，会获得在水中具有低溶解度(<30mg/ml)的分子。
更具体而言，根据本发明的在液相(溶液)中合成肽(可能是受保护的肽)的方法的特征在于，通过与氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)或胺官能团(Nα)连接的PIB衍生物，使得氨基酸或肽溶解在有机介质中。PIB衍生物起到了氨基酸或肽的锚定分子或液体基底的作用，其中该氨基酸或肽是通过将氨基酸连续连接到与该锚定分子连接的所述氨基酸上而合成的。因此，锚定分子在连续重复的肽合成过程中也起到了保护基的作用。
锚定在PIB分子上的潜在地受保护的氨基酸或肽的特征在于，所述氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)或胺官能团(Nα)通过酯、酰胺、苄基或烯丙基型的共价键或任何其他化学官能团与亲脂性PIB衍生物连接，从而产生了非常低的水溶解度(<30mg/ml)。在本发明的方法中，优选为PIB衍生物的所述锚定分子以这种方式起到用于肽或蛋白质合成的液体基底的作用。
通过用PIB衍生物将氨基酸(Nα，受保护或未保护)或肽(Nα，受保护或未保护)衍生，显著增加了所述氨基酸或所述肽在非极性有机液相中的溶解度。更具体而言，这些氨基酸和这些肽可溶于有机溶剂，例如卤化溶剂(二氯甲烷、氯仿)、乙酸乙酯、四氢呋喃、环己烷、己烷、或者诸如苯或甲苯之类的芳香族溶剂。因此，在水或水/乙醇或水/乙腈混合物的存在下，在萃取/倾析的过程中，与PIB衍生物连接的氨基酸和肽对有机相具有高分配比，从而能够简单而快速的进行纯化。
本发明还提出了一种在液相中合成(受保护或未保护的)肽的方法，其特征在于，我们从溶液中的氨基酸或肽(或溶液中的氨基酸或肽衍生物)开始，其将借助于起始氨基酸或肽衍生物的羧酸官能团(C端)或胺官能团(Nα)与前文中所限定的其中一种锚定分子连接，并且在将接下来的氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)活化后，我们增加或缩合接下来的氨基酸或肽，所述接下来的氨基酸或肽在其胺官能团(Nα)上并且可能在其侧链上受保护。
可以通过经由酸酐形成的任何已知的合成技术、或通过诸如碳化二亚胺、酰基氯、氯甲酸烷基酯之类的各种试剂、或任何其他用于活化Nα-保护的氨基酸的技术，从而进行Nα-保护的氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)的活化。
根据本发明的合成肽的方法的特征还在于，随后增加将要缩合的氨基酸或肽。将这些氨基酸或肽的酸官能团活化，并且保护其胺官能团(Nα)，并且如果需要，也保护其侧链。
在本文中，我们用靶标为H-Tyr-Gly-Phe-OH三肽的实例逐步呈现本发明的方法，其中该实例中使用了Boc或Fmoc保护基。
反应式3示出了将第一氨基酸(AA1)(在本反应中为苯丙氨酸(Phe))的酸官能团偶联到被酚官能化的PIB衍生物上的第一步骤。以由Fmoc基团保护的状态使用氨基酸AA1。
[化学3]
反应式3：
Figure BDA0003128801640000111
在该反应式中，DCM为二氯甲烷，EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，HOBt为羟基苯并***，并且DMAP为4-二甲氨基吡啶。
反应式4示出了一种变体，其中以由Boc基团保护的状态使用AA1。
[化学4]
反应式4：
Figure BDA0003128801640000121
在第二步骤中，切除保护基(Fmoc或Boc)以释放AA1的胺官能团(Nα)。反应式5示出了在Fmoc的情况中的这种所谓的去保护步骤，并且反应式6示出了在Boc的情况中的这种所谓的去保护步骤。这产生了我们在此称为PIB-AA1的分子。
[化学5]
反应式5：
Figure BDA0003128801640000122
[化学6]
反应式6：
Figure BDA0003128801640000123
CAN为乙腈，HNEt2为二乙胺，并且TFA为三氟乙酸。
在第三步骤中，通过将处于受保护状态(Boc或Fmoc)的第二氨基酸(在本文中称为AA2)添加到分子PIB-AA1中来重复第一步骤，其中在该情况中，第二氨基酸为甘氨酸(Gly)；AA2(其Nα官能团受保护)的酸官能团(C端)与PIB-AA1的N端官能团结合。在第四步骤中，将PIB-AA1-AA2的Nα官能团去保护，从而产生了锚定于其基底的二肽PIB-AA1-AA2。
在第五步骤中，通过将处于受保护状态(Boc或Fmoc)的第三氨基酸(在本文中称为AA3)添加到分子PIB-AA1-AA2中来重复第一步骤，其中在该情况中，第三氨基酸为侧链被叔丁基保护的酪氨酸；AA3(其Nα官能团受保护)的酸官能团(C端)与PIB-AA1-AA2的Nα官能团结合。在第六步骤中，将PIB-AA1-AA2-AA3的Nα官能团去保护，并且获得了反应式7所示的锚定的三肽。
[化学7]
反应式7：
Figure BDA0003128801640000131
可以容易地看出，通过连续的迭代，该方法可以向氨基酸中、并随后向与PIB衍生物连接的肽中连续添加氨基酸，以由此获得具有所需序列的肽。在肽与液体基底连接的情况下，可以在任何时间、特别是在最后一次迭代后，通过在非极性溶剂中萃取而将肽与任何极性产物分离。在该延伸序列的末端，肽可以与聚合物基底分离；如此，肽失去了在非极性相中的溶解性，并且可以将肽与聚合物基底分离以按预期使用。
反应式8示出了在反应式7中的三肽的情况下，将肽从其液体基底分离的反应。可以使用三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIPS)和水的混合物。
[化学8]
反应式8：
Figure BDA0003128801640000132
反应式9示出了一定数量的经过官能化的PIB衍生物，这些PIB衍生物适合作为实施本发明的液体基底。
[化学9]
Figure BDA0003128801640000141
在这些式中：
·X为选自由以下组成的组中的基团：OH、NH2、NH-NH2、SH；
·R为选自由以下组成的组中的基团：H、芳基、杂芳基；
·R'为选自由以下组成的组中的基团：H、烷基、O-烷基、杂芳基、O-(杂芳基)；
·R”为选自由以下组成的组中的基团：H、烷基、O-烷基、杂芳基、O-(杂芳基)，
·Y为选自由以下组成的组中的基团：O、CH2CH2。
·数字n为整数，通常大于10，并且有利地在15至50之间。
特别地，X可为游离胺、肼、醇、硫醇或酚。
在一个有利的实施方案中，不包括末端官能化(例如，如上限定的-X、-Z-C6H4X1或CR”＝CH-CHX)的锚定分子的质量平均分子量在600至20,000之间，并且优选在700至15,000之间。当分子量超过约20,000时，这些分子的粘度过大，这可能限制它们在用于活化/偶联步骤的溶剂(卤化溶剂或非卤化溶剂)中的溶解度。
可用作本发明一部分的某些PIB衍生物可作为均相催化的配体而市售获得。作为实例，可使用Strem Chemicals分别以商品编号06-1037和06-1048销售的2-甲基-3-[聚异丁基(12)]丙醇(质量平均分子量为757，包括末端官能化)或4-[聚异丁基(18)]苯酚(质量平均分子量为1104，包括末端官能化)。这两种分子为聚异丁烯衍生物，其中链分别由-CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH基团(即异丙醇)和-CH2-C(CH3)2-C6H5-OH(即苯酚)基团封端。
可以由生物基异丁烯制备优选的锚定分子(即聚异丁烯衍生物)。在ISO标准16620-1:2015“Plastics-Biobased content-part 1:General principles”中、特别是通过术语“生物基合成聚合物”、“生物基合成聚合物含量”、“生物基碳含量”和“生物基质量含量”的定义，以及在ISO标准16620-2:2015“Plastics-Biobased content-part 2:Determination of the biobased carbon content”和16620-3:2015“Plastics-Biobasedcontent-part 3:Determination of biobased synthetic polymer content”(关于确定和定量生物基特征的方法)中定义了生物基含量的概念。
有利地，锚定分子的生物基碳含量大于90％，优选大于93％，并且甚至更优选大于95％。
本发明的方法具有许多优点。
第一个优点在于本发明的方法能够在液相中制造肽，其中如前文所限定，与锚定分子连接的肽(受Nα-保护或未保护)保留在有机溶液中。
第二个优点在于通过用水或水/乙醇或水/乙腈混合物简单洗涤，或通过过滤，从而除去未与聚烯烃的衍生物或者聚烯烃或聚烯烃类的低聚物连接的副产物(盐、酸或例如在胺官能团去保护过程中出现的任何其他分子种类)和有机相中过量的试剂，由此可以获得高纯度肽。诸如环己烷、庚烷和己烷之类的闪点低于15℃的有机溶剂适于在萃取或洗涤过程中溶解聚烯烃的衍生物或者聚烯烃或聚烯烃类的低聚物。因此，根据本发明的方法避免了现有技术方法中所需的全部纯化步骤。
第三个特别重要的优点在于，本发明的方法能够通过调节聚烯烃的衍生物或者聚烯烃或聚烯烃类的低聚物的长度使其更具亲脂性，从而合成肽甚至蛋白质。
另一个优点是通过取等分试样，然后使用本领域技术人员已知的各种技术(例如质谱、高效液相色谱法、质子核磁共振或碳-13)进行分析，可以在合成过程中的任何时间控制肽的纯度。
另一个优点在于，可以如上文已经阐述的那样，由生物基异丁烯制备优选的锚定分子，即聚异丁烯衍生物。
其他优点是本发明的方法的自动化的可能性和锚定分子(聚烯烃、或者聚烯烃或聚烯烃类的低聚物)的循环使用的可能性。实际上，一旦完成了获得靶标肽的序列的一系列重复，肽就脱去保护基的保护，并且最终通过肽合成中常用的反应(例如水解、皂化和氢解)中的一种反应而脱去锚定分子，这释放出了锚定分子。因此可以使锚定分子循环使用。由于通过该方法制造的肽或蛋白质的纯度高，因此其可以用作药物制品(药品和疫苗)、化妆品、植物检疫制品或农业食品制品，或用于获得这些制品中的任何一种。
实施例
这些实施例说明了本发明的实施方案，但不限制其范围。实施例1和2说明了靶标肽的第一氨基酸(AA1)(以由Fmoc或Boc保护的Nα-保护形式用于该反应)与液体基底(在该情况中为PIB衍生物)的偶联反应的两种变体。实施例3和4说明了对下一个氨基酸(AA2)进行去保护的两种变体，其中下一个氨基酸(AA2)以由Fmoc或Boc保护的Nα-保护形式(在本文称为“Fmoc衍生物”或“Boc衍生物”)用于该反应中。实施例5说明了根据上述反应式8，肽与锚定分子的分离。
这些实施例使用氯化溶剂，即DCM。使用危害较小的溶剂获得了类似的结果，例如：四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃和碳酸亚乙酯，纯的或混合的。
实施例1：使用EDC/HOBt的偶联反应
在磁力搅拌下和氮气氛中，将Nα-保护的氨基酸(Fmoc-AA-OH或Boc-AA-OH)(1.3mmol)溶解在DCM(5mL)中，然后在冰浴中冷却至0℃。依次添加溶解在DCM(5mL)中的作为PIB衍生物的4-[聚异丁基(18)]苯酚(1mmol)，以及羟基苯并***(1.4mmol)。在10分钟之后，添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(1.5mmol)，并使反应介质的温度缓慢升高至环境温度(3h或16h)。将反应介质减压浓缩。将环己烷添加到残留物中，然后用水或用水/乙醇或水/乙腈混合物洗涤三次，然后用氯化钠饱和水溶液洗涤。用Na2SO4干燥有机相并进行过滤，然后减压蒸发溶剂。
实施例2：使用EDC/DMAP的偶联反应
在磁力搅拌下和氮气氛中，将N-保护的氨基酸(Fmoc-AA-OH或Boc-AA-OH)(1.3mmol)溶解在DCM(5mL)中，然后在冰浴中冷却至0℃。依次添加溶解在DCM(5mL)中的PIB衍生物(游离胺、醇、硫醇或苯酚)(1mmol)，以及4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.3mmol)。在10分钟之后，添加EDC(2mmol)，并使反应介质的温度缓慢升高至环境温度(3h或16h)。将反应介质减压浓缩。将环己烷添加到残留物中，然后用水或用水/乙醇或水/乙腈混合物洗涤三次，然后用氯化钠饱和水溶液洗涤。用Na2SO4干燥有机相并进行过滤，然后减压蒸发溶剂。
实施例3：芴甲基氨基甲酸酯(Fmoc)的去保护
在磁力搅拌下将芴甲基氨基甲酸酯衍生物(1mmol)溶解在DCM(5mL)中，并在冰浴中冷却至0℃。添加ACN/HNEt2溶液(2:1)(5mL)，然后将反应介质在环境温度搅拌4h。减压蒸发溶剂。将环己烷添加到残留物中，然后用水或用水/乙醇或水/乙腈混合物洗涤三次，然后用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤并用氯化钠饱和水溶液洗涤。用Na2SO4干燥有机相并进行过滤，然后减压蒸发溶剂。
实施例4：叔丁氧羰基(Boc)的去保护
在磁力搅拌下，将叔丁基氨基甲酸酯衍生物(1mmol)溶解于DCM(5mL)中，并在冰浴中冷却至0℃。添加DCM/TFA混合物(1:1)(35mL)，然后将反应介质在环境温度搅拌1h。减压蒸发溶剂。将环己烷添加到残留物中，然后用水或用水/乙醇或水/乙腈混合物洗涤三次，然后用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤并用氯化钠饱和水溶液洗涤。用Na2SO4干燥有机相并进行过滤，然后减压蒸发溶剂。
实施例5：肽与锚定分子分离
将溶解在DCM(5mL)中并锚定于其固体基底(1mmol)上的三肽添加到预先在冰浴中冷却至0℃的三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(v/v/v,95:2.5:2.5)(5mL)的混合物中。将反应介质在环境温度搅拌3h。向反应介质中添加***，并且通过过滤收集沉淀物并真空干燥。

Claims (13)

1.一种通过连续延伸肽链的第二末端(Nα)来合成肽或蛋白质的方法，所述肽链的第一末端通过所述肽链的羧酸官能团(C端)或所述肽链的胺官能团(Nα)与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、并且优选15个至50个单元的聚烯烃链。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锚定分子仅包括一个聚烯烃链。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链为聚异丁烯链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子为聚烯烃。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链的末端中的一个被官能化。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链包括不超过5％、并且优选为不超过3％的多个不饱和碳-碳键。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链的质量平均分子量在600至20,000之间、并且优选在700至15,000之间。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子包括由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链(或为由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链)：
○-X官能团，其中X选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-SH；
○-Z-C6H4X1官能团，其中
■Z为O或不存在，
■X1选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-SH、-NH-NH2、-CXRR1、-C6H3R'(CRX)
(其中X选自由-OH、-NH2、-SH组成的组，并且R选自由-H、芳基、杂芳基组成的组，并且R'选自由-H、-烷基、-O-烷基、-芳基、-O-芳基、杂芳基、-O-杂芳基组成的组)，
○-CR"＝CH-CHX官能团或-CR"H-CH＝CH-CHX官能团，其中X选自由-OH、-NH2、-SH组成的组，并且R"为甲基或乙基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于：
-所述肽链的所述第一末端为第一氨基酸单元AA1，并且
-所述肽链由n个氨基酸单元形成，并且
-所述肽链的所述第二末端为另一氨基酸单元AAn。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在所述延伸过程中将另一氨基酸单元AA(n+1)添加到所述第二末端。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其包括至少一个这样的步骤，其中，通过在非极性液体中进行萃取，使与所述锚定分子连接的所述肽链与所述反应介质分离。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，与所述锚定分子连接的所述肽链在水中的溶解度小于30mg/mL。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子的生物基碳含量大于90％、优选大于93％、并且甚至更优选大于95％。
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