EP3902819A1 - Procédé de synthèse de peptides - Google Patents

Procédé de synthèse de peptides

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Publication number
EP3902819A1
EP3902819A1 EP19845760.8A EP19845760A EP3902819A1 EP 3902819 A1 EP3902819 A1 EP 3902819A1 EP 19845760 A EP19845760 A EP 19845760A EP 3902819 A1 EP3902819 A1 EP 3902819A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
function
chain
peptide
polyolefin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19845760.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Jacques YOUTE TENDOUNG
Audrey SERRE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Strainchem
Original Assignee
Strainchem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Strainchem filed Critical Strainchem
Publication of EP3902819A1 publication Critical patent/EP3902819A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic

Definitions

  • the invention relates to the field of organic chemistry, and more particularly to the synthesis of peptides or proteins from amino acids.
  • the invention relates to a process for the synthesis of peptides in vitro, in the liquid phase, which does not use a solid support or insoluble resin.
  • This process is based on the use of a new family of anchoring molecules, namely derivatives of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes, which, linked to an amino acid or an amino acid derivative, exhibit good solubility in nonpolar solvents, but have low solubility in water.
  • This process makes it possible to obtain peptides which are purer and / or easier to purify than the known processes on solid support or on liquid support. It is easy to automate.
  • All amino acids have at least two reactive chemical functions: the amine function (Na center) and the carboxylic acid function (C-terminal). Certain amino acids also have side chains capable of reacting with the Na or C-terminal centers.
  • the key to a peptide synthesis strategy lies in the choice of protective groups (also called protection groups) by which the reactive centers are protected during certain stages of the process.
  • protection groups also called protection groups
  • each addition of an amino acid requires a cycle of steps: protection - activation / coupling - deprotection.
  • the protective groups are cleaved to generate the target peptide.
  • the common basic cycle protection - activation / coupling - deprotection is invariable but only the protective group used. More precisely, such a cycle comprises several stages:
  • the target peptide is obtained by total deprotection of the protective groups.
  • a first, a second and a third amino acid (here called AA1, AA2 and AA3) are supplied.
  • the amine function (Na) of the amino acid AA2 is temporarily protected by a tert-butoxycarbonyl group (commonly called “Boc”).
  • Boc tert-butoxycarbonyl group
  • Then activates the carboxylic acid function (C-terminal) of said protected amino acid which is condensed with the free amine function (Na) (ie unprotected) of a methyl ester of amino acid AA1, which generates a dipeptide.
  • the amino function (Na) of the amino acid AA2 is deprotected (ie the protective group Boc is cleaved with an acid, such as trifluoroacetic acid) from the dipeptide formed.
  • the amino function (Na) of the amino acid AA3 is protected.
  • the carboxylic acid function (C-terminal) of the amino acid AA3 which is coupled with the amine function (Na) of the amino acid AA2 (of the deprotected dipeptide) is activated to generate the protected tripeptide.
  • a tripeptide is obtained. This process includes a minimum of five reaction steps, two of which are (activation / coupling - deprotection) for each additional amino acid added to the peptide.
  • the derivative obtained is coupled via the activation of its carboxylic acid (C-terminal), to the amine function (Na) of the amino acid AA1 anchored on the resin, which generates an N-protected dipeptide and anchored on the resin. .
  • the Fmoc group of the dipeptide is cleaved (on AA2).
  • the protection of the amino function (Na) of the amino acid AA3 by an Fmoc group is followed by activation of its carboxylic acid (C-terminal) then, we proceed to the coupling of the species obtained with the anchored dipeptide and having the free amine function, thus generating an N-protected tripeptide, which remains fixed on the solid support by the acid function (C-terminal) of its amino acid AA1.
  • This process includes a minimum of seven reaction steps, two of which (activation / coupling - deprotection) for each additional amino acid added to the peptide.
  • the carboxylic acid (C-terminal) function of the starting amino acid is protected in the form of a methyl ester and the following amino acids are successively condensed after the protection of their amine function (Na) by a benzyloxycarbonyl group and the activation of their carboxylic acid function (C-terminal) by a nitrophenyl ester. All synthetic intermediates are purified by precipitation or washing with water (extraction). This peptide synthesis methodology is long, tedious and generates peptides with low yield. By way of example, there may be mentioned the synthesis of ACTH with an overall yield of approximately 7%, described by Schwyzer and Sieber (Helv. Chim. Acta 1966, 49, 134-158).
  • the amino acid or the protein can be linked to a protective group called a solubilizer, such as phenylazobenzyl sulfonylethyloxy (OPSE), described in EP 0 017 536 (CM Industries).
  • OPSE phenylazobenzyl sulfonylethyloxy
  • this protective group allows the solubilization of the amino acid or of the peptide synthesized in N, N-dimethylformamide.
  • the purification is done by precipitation and filtration of the solids, which gives rise to operational difficulties.
  • EP 2 612 845 A1 and US 2014/0296483 (Ajinmoto Co., Inc.) have described new protective groups (or anchoring molecules) allowing the solubilization of the amino acid and the peptide.
  • the purification is done either by simple washing with water, or by precipitation and filtration. Thanks to these protective groups very lipophilic of the carboxylic acid function, bivalirudin, an anticoagulant consisting of 20 amino acid residues was prepared with an overall yield of 73% and a purity of 84% (see D. Takahashi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 7803-7807).
  • its limit namely the number of amino acid residues capable of being anchored, remains unknown.
  • the financial cost and the environmental cost of these anchor molecules constitute a handicap.
  • Solid phase peptide synthesis has been described by Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154). It consists in fixing the carboxylic acid (C-terminal) function of the first amino acid or of the peptide on an insoluble resin (support). Consequently, the reagents are used in excess in order to ensure the total conversion of the activation / coupling steps. Purifications are done by simple filtration and washing of the resin. Although this technique is automated and simpler, many drawbacks exist such as the cost and loss of the reagents used in excess, and the lack of homogeneity of the peptides synthesized because it is almost impossible to obtain homogeneous peptides: it is said that the system is degenerate. In addition, the purification in Preparative high performance liquid chromatography of these heterogeneous peptides is expensive because it consumes a lot of solvents and is not environmentally acceptable.
  • a yield of less than 100% implies not only the loss of reagents, but also the formation of side products which may be difficult to separate from the target peptide; insofar as one wishes to have peptides as pure as possible to clearly characterize their biological effects, this means that either one accepts the additional cost that the purification presents, or one accepts the presence of impurities likely to generate a risk error in appreciation of the biological effects observed.
  • the problem which the present invention seeks to solve is to present a method of synthesis of purer peptides or proteins, with higher yield, more ecological, less expensive and which is automated.
  • This process should be suitable for at least all natural amino acids and preferably for a broad spectrum of non-natural amino acids.
  • This method should not involve expensive or difficult-to-synthesize anchor molecules or supports.
  • the present invention proposes to solve the difficulties left in the prior art by the use of polyolefins or polyolefin oligomers or polyalkenes for the production of high purity peptides or proteins in the liquid phase.
  • polyolefins and in particular of polyisobutenes (PIB) derivatives, as anchor molecules or liquid support, allows the solubilization of amino acids and the synthesis of peptides in organic solution (solvents halogenated and non-halogenated), while facilitating their purification by simple extraction or washing, in this case with water or a water / ethanol or water / acetonitrile mixture, or by simple filtration.
  • some of these anchoring molecules in particular certain polyisobutenes (PIB) derivatives
  • PIB polyisobutenes
  • the object of the invention is therefore a process for the synthesis of peptides or proteins by successively elongating the second end (Na) of a peptide chain whose first end is fixed, by means of its carboxylic acid function ( C-terminal) or of its amine function (Na), on an anchoring molecule soluble in an apolar solvent, characterized in that said anchoring molecule comprises a polyolefin chain with at least 10 units of monomers, and preferably between 15 and 50 units.
  • it is functionalized at one of its ends, to allow the anchoring of the first amino acid.
  • said anchoring molecule is a polyolefin.
  • said anchoring molecule comprises only a single polyolefin chain; this polyolefin chain can thus be obtained by a simple polymerization reaction (of isobutene).
  • Said anchoring molecule can comprise, in each of its units, alkyl groups which may or may not be identical, which are preferably selected from the group formed by methyl and ethyl.
  • Said polyolefin chain advantageously has a weight-average molecular mass of between 600 and 20,000, and preferably between 700 and 15,000.
  • Said polyolefin chain can comprise a number of carbon-carbon bonds unsaturated not exceeding 5%, and preferably not exceeding 3%.
  • it is a polyisobutene chain.
  • said anchoring molecule comprises a polyolefin chain (or is a polyolefin chain) which is terminated by a group selected from the group formed by:
  • X is selected from the group formed by: -OH, -NH2, -SH;
  • ⁇ Z is O or absent
  • ⁇ X 1 is selected from the group formed by: -OH, - NH2, -SH, -NH-NH2, -CXRR 1 , -C 6 H 3 R '(CRX)
  • X is selected from the group formed by -OH, - NH2, -SH, and R is selected from the group formed by -H, Aryl, Heteroaryl, and R 'is selected from the group formed by -H, -Alkyl, -O-Alkyl, -Aryl, - O-Aryl, Heteroaryl, -O-Heteroaryl,
  • This group then represents the functionalization of the polyolefin chain.
  • Said first end of said peptide chain is a first unit of amino acid AA1; it is on this first amino acid AA1 that the anchoring molecule is linked, either on its carboxylic acid function (C-terminal), or on its amine function (Na).
  • Said peptide chain is formed of n amino acid units; its second end is another amino acid unit AAn.
  • the peptide chain is lengthened by successive elongation, and during each of these elongation steps another unit of amino acid AA (n + 1) is added to said second end.
  • the amine function (Na) of the amino acids used in the process according to the invention can be protected by a Boc or Fmoc group, or by any other suitable protective groups.
  • Natural and / or non-natural and / or synthetic amino acids can be used in said peptide chain.
  • the method according to the invention comprises at least one step in which said peptide chain is attached to said anchor molecule and is separated from the reaction medium by extraction in an apolar solvent.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain very pure peptides or proteins, which are cleaved from their anchoring molecule after the last stage of elongation of the peptide chain, to be used according to their destination, for example as active ingredient for preclinical or clinical trials.
  • amino acid natural amino acids and non-natural amino acids.
  • Natural amino acids include the L-form of the amino acids that can be found in naturally occurring proteins, that is: alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (ILe), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) and valine (Val).
  • the “unnatural” amino acids include form D of the natural amino acids defined above, the homo forms of certain natural amino acids (such as: arginine, lysine, phenylalanine and serine), and the nor forms of leucine and valine. They also include unnatural amino acids, such as:
  • Aib 2-aminoisobutyric acid
  • Nal2 2-naphthylalanine
  • protected amino acid is used here also to designate temporarily protected amino acids, as described above, in particular; for example the amine function (Na) can be protected by an Fmoc, Boc, benzyl group or any other suitable protective group.
  • polyolefins or more precisely polyolefin oligomers (polyolefins also being called polyalkenes), and their derivatives as anchoring molecules or protective group, whether of the carboxylic acid function ( C-terminal) of the amino acid or of the peptide, or of the amine function (Na) of the amino acid or of the peptide, or of the side chain of said amino acid or of peptide (in the form of ester, amide, ether bonds , thioether or any other function) in the liquid phase.
  • Polyolefin molecules include a chain of carbon atoms linked by single bonds.
  • polymers can comprise branches consisting of identical or different, but preferably identical, alkyl groups.
  • polymers are used with a number of monomer units of at least 10 and preferably between 15 and 50.
  • Homopolymers are preferred, but copolymers can also be used, and in the latter case the number of bonds unsaturated in the chain of carbon atoms advantageously does not exceed 5%, and preferably does not exceed 3%.
  • PIB polyisobutenes
  • anchoring molecules are preferably used in the process according to the invention in the form of functionalized derivatives, as will be explained in greater detail below.
  • these anchoring molecules are linked to the carboxylic acid function of an amino acid (C-terminal) or to the amine function (Na) by a covalent bond of amide, ester, benzyl, allyl type or all other functions.
  • This supposes that the anchor molecules are engaged in a suitably functionalized form, which is called in the present description "derivatives of PIB", knowing that this term also includes here the derivatives of anchor molecules which are not derivatives of polyisobutene, but which are derivatives of other polyolefins according to the definition given above.
  • This functionalization of the anchor molecule is generally a terminal functionalization, preferably at one of the ends of the chain of carbon atoms; it will be described below.
  • polyolefin oligomers used as anchor molecule are typically characterized by a mass average molecular weight, but it is also possible to use "pure" oligomers which contain identical molecules of a given chain length.
  • This reaction between the PIB derivative and the amino acid leads to a product characterized in that when the PIB derivative is linked to an amino acid or an amino acid derivative, possibly having a protected side chain, a molecule with low solubility in water ( ⁇ 30 mg / ml).
  • the process for the synthesis of peptides, possibly protected, in the liquid phase (solution) according to the invention is characterized in that an amino acid or a peptide is solubilized in an organic medium by a PIB derivative linked to the carboxylic acid function (C-terminal) or to the amine function (Na) of the amino acid or of the peptide.
  • the PIB derivative acts as an anchor molecule or liquid support for the amino acid or peptide which is synthesized by successive attachment of amino acids to the last amino acid attached to this anchored molecule.
  • the anchor molecule also serves as a protective group during the synthesis of the peptide during successive iterations.
  • the amino acid or optionally protected peptide anchored on a PIB molecule is characterized in that the carboxylic acid function (C-terminal) or the amine function (Na) of said amino acid or peptide is linked by a covalent bond of the type ester, amide, benzyl, allyl or any other chemical function to a lipophilic PIB derivative, giving a very low solubility in water ( ⁇ 30 mg / ml).
  • said anchor molecule which is preferably a derivative of PIB, acts as a liquid support for the synthesis of peptides or proteins.
  • This derivation of the amino acid (Na-protected or not) or the peptide (Na-protected or not) with the PIB derivative significantly increases the solubility of said amino acid or of said peptide in non-polar organic liquid phase. More specifically, these amino acids and these peptides become soluble in organic solvents, such as halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, cyclohexane, hexane (s) or aromatic solvents such as benzene or toluene.
  • organic solvents such as halogenated solvents (methylene chloride, chloroform), ethyl acetate, tetrahydrofuran, cyclohexane, hexane (s) or aromatic solvents such as benzene or toluene.
  • the amino acids and peptides attached to a PIB derivative have a high partition coefficient for the organic phase during an extraction / decantation in the presence of water or a water / ethanol or water / acetonitrile mixture. , thus allowing their simple and rapid purification.
  • the present invention also provides a process for the synthesis of peptides (protected or not), in the liquid phase, characterized in that one starts from a amino acid or peptide in solution (or an amino acid derivative or peptide in solution), which will be linked to one of the anchoring molecules as defined above, via the function carboxylic acid (C-terminal) or of the amino function (Na) of the amino acid derivative or of the starting peptide, and that the following amino acids or peptides are added or condensed, which are protected on their function amine (Na) and optionally on their side chain, after activation of their carboxylic acid function (C-terminal).
  • the activation of the carboxylic acid function (C-terminal) of the Na-protected amino acid or of the peptide can be carried out by all known techniques of synthesis via the formation of an anhydride by means of various reagents such as: carbodiimide , acid chloride, alkyl chloroformate, or any other technique for activating an Na-protected amino acid.
  • the process for the synthesis of peptides according to the invention is also characterized in that the amino acids or the peptides to be condensed are then added. These amino acids or peptides being activated on their acid function and protected on their amine (Na) function, and protected if necessary also on their side chain.
  • Reaction scheme 3 shows the first step in coupling the acid function of the first amino acid (AA1), in this case phenylalanine (Phe), to a PIB derivative functionalized with a phenol.
  • AA1 first amino acid
  • Phe phenylalanine
  • the amino acid AA1 is engaged in the protected state by an Fmoc group.
  • DCM dichloromethane
  • EDC 1- ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • HOBt hydroxy-benzotriazole
  • DMAP 4-dimethyl-aminopyridine.
  • Reaction diagram 4 shows the variant in which AA1 is engaged in the protected state by a Boc group.
  • the protection group (Fmoc or Boc) is cleaved to release the amine function (Na) from AA1.
  • This so-called deprotection step is illustrated in reaction diagrams 5 for the Fmoc case and 6 for the Boc case. It leads to a molecule which we call here PIB-AA1.
  • ACN means acetonitrile
  • HNEÎ2 means diethylamine
  • TFA means trifluoroacetic acid
  • the first step is repeated by adding to the PIB-AA1 molecule, the second amino acid (here called AA2), in this case glycine (Gly) in the protected state (Boc or Fmoc); the acid (C-terminal) function of AA2 (whose Na function is protected) binds to the N-terminal function of PIB-AA1.
  • the Na function of PIB-AA1 -AA2 is deprotected, generating the dipeptide PIB-AA1 -AA2 anchored on its support.
  • a fifth step the first step is repeated, adding to the molecule PIB-AA1 -AA2, the third amino acid (here called AA3), in this case tyrosine protected on its side chain by a tert-butyl group, to the 'protected state (Boc or Fmoc); the acid function (C-terminal) of AA3 (whose Na function is protected) binds to the Na function of PIB-AA1 - AA2.
  • the Na function of PIB-AA1 -AA2-AA3 is deprotected, and the anchored tripeptide shown in reaction scheme 7 is obtained.
  • this process makes it possible, by successive iterations, to add successive amino acids to the amino acid and then to the peptide attached to the PIB derivative, thereby obtaining a peptide having the desired sequence.
  • the peptide being attached to the liquid support, it can be separated at any time, and in particular after the last iteration, from all polar products by extraction in an apolar solvent. At the end of this elongation sequence, the peptide can be detached from the support polymer; thus the peptide loses its solubility in an apolar phase, and it can be separated from the support polymer, for use in accordance with its destination.
  • reaction scheme 8 For the tripeptide of reaction scheme 7.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TIPS triisopropylsilane
  • water can be used.
  • Figure 9 shows a number of PIB derivatives with their functionalization which are suitable as a liquid carrier for carrying out the present invention.
  • X is a group selected from the group formed by: OH, NH 2 , NH-NH2, SH;
  • ⁇ R is a group selected from the group formed by: H, aryl, hetero-aryl;
  • R ’ is a group selected from the group formed by: H, alkyl, O-alkyl, hetero-aryl, O- (hetero-aryl);
  • R is a group selected from the group formed by: H, alkyl, O-alkyl, hetero-aryl, O- (hetero-aryl),
  • Y is a group selected from the group formed by: O, CH2CH2.
  • n is an integer which is typically greater than 10, and advantageously between 15 and 50.
  • X can be a free amine, a hydrazine, an alcohol, a thiol or a phenol.
  • Certain PIB derivatives which can be used in the context of the present invention are commercially available as ligands for homogeneous catalysis.
  • the preferred anchor molecules namely polyisobutene derivatives, can be prepared from biobased isobutene.
  • the concept of biobased content is defined in ISO 16620-1: 2015 “Plastics - Biobased content - part 1: General principles”, in particular by a definition of the terms “biobased synthetic polymer”, “biobased synthetic polymer content”, “Bio-based carbon content” and “bio-based mass content”, as well as in ISO 16620-2: 2015 “Plastics - Bio-based content - part 2: Determination of bio-based carbon content” and ISO 16620-3: 2015 “ Plastics - Biobased content - part 3: Determination of the biobased synthetic polymer content ”, for the methods of determination and quantification of the biobased character.
  • the anchoring molecules have a content of biobased carbon greater than 90%, preferably greater than 93%, and even more preferably greater than 95%.
  • 20 example -X, -Z-CehhX 1 or -CR ” CH-CHX as defined above), is between 600 and 20,000, and preferably between 700 and 15,000. Beyond a molecular mass around 20,000 these molecules have too high a viscosity, which would risk limiting their solubility in the solvents (halogenated or not) used for the activation / coupling step.
  • Certain PIB derivatives which can be used in the context of the present invention are commercially available as ligands for homogeneous catalysis.
  • the preferred anchor molecules namely polyisobutene derivatives, can be prepared from biobased isobutene.
  • the concept of biobased content is defined in ISO 16620-1: 2015 “Plastics - Biobased content - part 1: General principles”, in particular by a definition of the terms “biobased synthetic polymer”, “biobased synthetic polymer content”, “Bio-based carbon content” and “bio-based mass content”, as well as in ISO 16620-2: 2015 “Plastics - Bio-based content - part 2: Determination of bio-based carbon content” and ISO 16620-3: 2015 “ Plastics - Biobased content - part 3: Determination of the biobased synthetic polymer content ”, for the methods of determination and quantification of the biobased character.
  • the anchoring molecules have a content of biobased carbon greater than 90%, preferably greater than 93%, and even more preferably greater than 95%.
  • the process according to the invention has many advantages.
  • a first advantage is that it allows peptide production in the liquid phase, where the peptide (Na-protected or not) linked to the anchoring molecule, defined above, remains in organic solution.
  • a second advantage is that it makes it possible to obtain peptides of high purity by a simple washing with water or a water / ethanol or water / acetonitrile mixture, or by filtration, thus generating the elimination of the sub- products (salts, acids or any other molecular species occurring for example during the deprotection of the amine function) which are not linked to the derivative of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes and of reagents in excess of the organic phase.
  • Organic solvents such as cyclohexane, heptane (s), hexane (s) which have flash points ⁇ 15 ° C, are suitable for solubilizing derivatives of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes during the extraction or washing.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to avoid all the purification steps necessary in the prior art methods.
  • a third advantage, which is particularly important, is that the process according to the invention makes it possible to synthesize peptides or even proteins, by adjusting the length of the derivative of polyolefins or oligomers of polyolefins or polyalkenes, by making them more lipophilic.
  • Another advantage is the possibility of checking the purity of the peptide being synthesized, at any time, by taking an aliquot followed by an analysis by the various techniques known to those skilled in the art (such as spectrometry of mass, high performance liquid chromatography, nuclear magnetic resonance of the proton or carbon-13).
  • the preferred anchor molecules namely polyisobutene derivatives, can be prepared from biobased isobutene, as explained above.
  • the possibility of automating the process according to the invention and the possibility of recycling the anchoring molecules (polyolefins 22 or oligomers of polyolefins or polyalkenes).
  • the peptide is deprotected from its protective groups and finally from the anchoring molecule by one of the reactions usually used in peptide synthesis (such as hydrolysis , saponification, hydrogenolysis), which releases the anchor molecule.
  • the anchor molecule can be recycled. Thanks to their high purity, the peptides or proteins produced by this process can be used as pharmaceutical products (drugs and vaccines), cosmetic products, phytosanitary products or food products, or to access any of these products.
  • Examples 1 and 2 illustrate two variants of the coupling reaction of the first amino acid (AA1) of the target peptide (engaged in the reaction in the Na-protected form by Fmoc or Boc) with a liquid support (in this case a derivative of GDP).
  • Examples 3 and 4 illustrate two variants of the deprotection of the following amino acid (AA2), engaged in the reaction in the Na-protected form by Fmoc or Boc (here called, respectively, "derivative of Fmoc” or " derived from Boc ”).
  • Example 5 illustrates the release of the peptide from the anchor molecule, in accordance with reaction scheme 8 above.
  • chlorinated solvents namely DCM.
  • solvents of lower harmfulness such as: tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, ethylene carbonate, pure or as a mixture.
  • the N-protected amino acid (Fmoc-AA-OH or Boc-AA-OH) (1, 3 mmol) was dissolved in DCM (5 mL) with magnetic stirring and under a nitrogen atmosphere, then cooled to 0 ° C in an ice bath.
  • the PIB derivative (free amine, alcohol, thiol or phenol) (1 mmol) dissolved in DCM (5 mL), 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (0.3 mmol).
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the tert-butylcarbamate derivative (1 mmol) was dissolved in the in DCM (5 mL) with magnetic stirring, and was cooled to 0 ° C in an ice bath.
  • a DCM / TFA mixture (1/1) 35 ml was added, then the reaction medium was stirred at room temperature for 1 h.
  • the solvents were evaporated under reduced pressure. Cyclohexane was added to the residue which was then washed three times with water or with a water / ethanol or water / acetonitrile mixture, then with a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and with a saturated aqueous solution of chloride. sodium.
  • the organic phase was dried over Na2SC> 4, filtered, and the solvent was evaporated under reduced pressure.

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Abstract

Procédé de synthèse de peptides ou protéines par élongation successive de la deuxième extrémité d'une chaîne peptidique dont la fonction acide carboxylique (C-terminal) ou la fonction amine Na est fixée sur une molécule d'ancrage soluble dans un solvant apolaire, caractérisé en ce que ladite molécule d'ancrage comporte une chaîne polyoléfine avec au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 50 unités.

Description

Procédé de synthèse de peptides Domaine technique de l’invention
L’invention concerne le domaine de la chimie organique, et plus particulièrement de la synthèse de peptides ou protéines à partir d’acides aminés. L’invention porte sur un procédé de synthèse de peptides in vitro, en phase liquide, qui n’utilise pas de support solide ou de résine insoluble. Ce procédé est basé sur l’utilisation d’une nouvelle famille de molécules d’ancrage, à savoir des dérivés de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes, qui, liée à un acide aminé ou un dérivé d’acide aminé, présentent une bonne solubilité dans des solvants apolaires, mais présentent une faible solubilité dans l’eau. Ce procédé permet d’obtenir des peptides plus purs et/ou plus faciles à purifier que les procédés connus sur support solide ou sur support liquide. Il est facile à automatiser.
Etat de la technique
La pharmacologie des peptides présente un énorme intérêt médical et économique, mais sur un plan scientifique elle reste à l’ombre de la biochimie des protéines et de la génétique. Malgré l’immense succès de l’insuline, une protéine naturelle formée de 51 acides aminés, le nombre de peptides qui ont été développés en tant que principes actifs pharmaceutiques est resté faible jusqu’à la fin du 20ème siècle. Cependant, une trentaine de nouveaux principes actifs constitués de peptides ont reçu une autorisation de mise sur le marché entre 2000 et 2016, et un nombre significatif de peptides fait l’objet d’essais cliniques et précliniques (voir la publication de A. Henninot et. al., « The Current State of Peptide Drug Discovery : Back to the Future ? » parue dans J. Med. Chem., 2018, 61 , 4, 1382-1414). La plupart de ces candidats médicaments sont des peptides naturels connus pour leur fonction spécifique, d’autres sont dérivés de séquences naturelles, en encore d’autres sont totalement synthétiques.
Pour l’insuline, administrée à des millions de patients, la synthèse par des organismes génétiquement modifiés représente la voie royale pour obtenir des quantités industrielles suffisamment pures. Pour beaucoup d’autres peptides thérapeutiques, la synthèse ab initio (c’est-à-dire à partir des acides aminés individuels) est la principale méthode utilisée pour obtenir des quantités nécessaires. Dans ce contexte la pureté du peptide représente un enjeu technique et économique majeur pour la méthode de synthèse choisie. Dans le même temps, le facteur environnemental devient un enjeu sociétal de plus en plus fort. C’est pourquoi, les chimistes sont à la recherche de procédé en phase avec ce critère (voir la publication de A. Isidro-Llobet et al., « Sustainability Challenges in Peptide Synthesis and Purification : From R&D to Production », parue dans J. Org. Chem., 2019, 84, 4615-4628). La purification d’un peptide (qui se fait en général par chromatographie en phase liquide à haute performance, CLHP) peut représenter une fraction importante du coût de revient du produit fini mais également générer des déchets.
Il existe deux grandes méthodologies de synthèse peptidique qui se distinguent par l’état physique de la phase où a lieu les réactions chimiques : la phase liquide (cette synthèse est aussi appelée « synthèse en solution ») et la phase solide (cette synthèse est aussi appelée « synthèse sur support solide »).
Tous les acides aminés ont au moins deux fonctions chimiques réactives : la fonction amine (centre Na) et la fonction acide carboxylique (C-terminal). Certains acides aminés ont en plus des chaînes latérales susceptibles de réagir avec les centres Na ou C-terminal. La clé d’une stratégie de synthèse de peptides réside dans le choix des groupements protecteurs (appelés aussi groupes de protection) par lesquels les centres réactifs sont protégés pendant certaines étapes du procédé. Ainsi, chaque addition d’un acide aminé nécessite un cycle d’étapes : protection - activation/couplage - déprotection. En fin de synthèse, les groupements protecteurs sont clivés pour générer le peptide cible. Ainsi, selon l’état physique de la phase où a lieu la synthèse peptidique, le cycle de base commun : protection - activation/couplage - déprotection est invariable mais seul diffère le groupement protecteur utilisé. Plus précisément, un tel cycle comprend plusieurs étapes :
- La protection de la fonction amine (Na) de l’acide aminé par un groupement protecteur clivable après la réaction de condensation de l’acide aminé ;
- Si nécessaire, la protection de la chaîne latérale par un groupement protecteur clivable en fin de synthèse du peptide ;
- L’activation de la fonction acide carboxylique de l’acide aminé protégé Na, puis sa condensation avec un dérivé d’acide aminé ou un peptide dont la fonction amine Na est libre et dont la fonction acide carboxylique est protégée ;
- A la fin de l’itération (activation/couplage - déprotection) de tous les acides aminés de la séquence, le peptide cible est obtenu par déprotection totale des groupements protecteurs.
Le cycle de protection - activation/couplage - déprotection est expliqué ici pour l’exemple de la synthèse d’un tripeptide.
Selon la stratégie en solution dite « Boc » montrée sur le schéma réactionnel 1 , on approvisionne un premier, un deuxième et un troisième acide aminé (appelés ici AA1 , AA2 et AA3). On protège la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA2 temporairement par un groupement tert- butoxycarbonyle (appelé couramment « Boc »). Puis on active la fonction acide carboxylique (C-terminal) dudit acide aminé protégé que l’on condense avec la fonction amine (Na) libre (i.e. non protégée) d’un ester méthylique de l’acide aminé AA1 , ce qui génère un dipeptide. Ensuite on déprotège la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA2 (i.e. on clive le groupement protecteur Boc avec un acide, tel que l’acide trifluoroacétique) du dipeptide formé. On protège la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA3. Puis on active la fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide aminé AA3 que l’on couple avec la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA2 (du dipeptide déprotégé) pour générer le tripeptide protégé. Après la déprotection du groupement Boc porté par AA3, on obtient un tripeptide. Ce processus comprend un minimum de cinq étapes réactionnelles, dont deux étapes (activation/couplage - déprotection) pour chaque acide aminé additionnel ajouté au peptide.
[Chem 1]
Schéma réactionnel 1 :
Ce procédé peut se dérouler avec ancrage de l’acide aminé AA1 sur un support solide ou sur une molécule organique solubilisante en phase liquide. Le fluorénylméthoxycarbonyle peut être utilisé comme groupement protecteur de la fonction amine, selon la stratégie dite « Fmoc » montrée sur le schéma réactionnel 2. Cette stratégie convient particulièrement pour la synthèse sur support solide. On approvisionne un premier, un deuxième et un troisième acide aminé (AA1 , AA2 et AA3). Tout commence par la protection de la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA1 par un groupement fluorénylméthoxycarbonyle (appelé couramment « Fmoc »), puis son ancrage sur une résine solide (symbolisée sur le schéma réactionnel 2 par le cercle noir) via sa fonction acide carboxylique (C-terminal), formant une liaison covalente de type ester ou amide avec une fonction chimique de la résine fonctionnalisée (alcool ou amine). On déprotège la fonction amine (Na) de l’acide aminé ancré sur la résine. Ensuite, on protège la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA2 par un groupement protecteur Fmoc. Le dérivé obtenu est couplé via l’activation de son acide carboxylique (C- terminal), à la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA1 ancré sur la résine, ce qui génère un dipeptide N-protégé et ancré sur la résine. On clive le groupement Fmoc du dipeptide (sur AA2). La protection de la fonction amine (Na) de l’acide aminé AA3 par un groupement Fmoc est suivie de l’activation de son acide carboxylique (C-terminal) puis, on procède au couplage de l’espèce obtenue avec le dipeptide ancré et ayant la fonction amine libre, générant ainsi un tripeptide N-protégé, qui reste fixé sur le support solide par la fonction acide (C-terminal) de son acide aminé AA1. Ce procédé comprend un minimum de sept étapes réactionnelles, dont deux (activation/couplage - déprotection) pour chaque acide aminé additionnel ajouté au peptide.
[Chem 2]
Schéma réactionnel 2 :
Ces deux voies de synthèse sont bien connues de l’homme du métier (voir la Section 7-5 du manuel « Biochimie » de D. Voet et J .G. Voet, 2ème édition, Bruxelles 2005). Elles peuvent être mises en œuvre en phase liquide ou sur support solide (dans ce cas l’acide aminé est fixé sur un support solide, i.e. synthèse de Merrifield). En pratique, les acides aminés sont approvisionnés à l’état protégé par le groupement Fmoc ou Boc, et engagés directement dans les réactions d’activations/couplages dans cet état protégé. Lors de la synthèse peptidique en phase liquide (SPPL), toutes les réactions ont lieu en solution homogène. Cette méthodologie a été décrite par Bodansky et du Vigneaud (J. Am. Chem. Soc., 1959, 51 , 5688-5691). La fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide aminé de départ est protégée sous forme d’un ester méthylique et les acides aminés suivants sont condensés successivement après la protection de leur fonction amine (Na) par un groupement benzyloxycarbonyle et l’activation de leur fonction acide carboxylique (C-terminal) par un ester nitrophénylique. Tous les intermédiaires synthétiques sont purifiés par précipitation ou lavage à l’eau (extraction). Cette méthodologie de synthèse peptidique est longue, fastidieuse et génère des peptides avec de faible rendement. A titre d’exemple, on peut citer la synthèse de l’ACTH avec un rendement global d’environ 7%, décrite par Schwyzer et Sieber (Helv. Chim. Acta 1966, 49, 134-158).
Une modification de cette méthodologie a été rapportée par Beyermann et al. (Rec. Trav. Chim. Pays Bas 1973, 92, 481-492). Elle consiste à protéger la fonction acide carboxylique (C-terminal) d’un acide aminé ou d’un peptide sous la forme d’un ester benzylique et de réaliser la réaction de couplage (ou condensation) en présence d’un excès d’anhydride d’acide aminé N-protégé (Na), dans l’optique d’améliorer le rendement. Finalement, bien que les rendements des réactions de couplage soient augmentés, on constate une perte de solubilité en phase organique lorsque le peptide formé atteint environ cinq acides aminés.
Pour gagner en solubilité, l’acide aminé ou la protéine peut être lié à un groupement protecteur dit solubilisant, tel que la phénylazobenzyl sulfonyléthyloxy (OPSE), décrit dans EP 0 017 536 (CM Industries). En effet, ce groupement protecteur permet la solubilisation de l’acide aminé ou du peptide synthétisé dans le N,N-diméthylformamide. Après chaque itération (activation/couplage - déprotection), la purification se fait par précipitation et filtration des solides, ce qui engendre des difficultés opératoires.
Une approche faisant usage d’un polymère linéaire non réticulé, tel que le polyéthylène glycol (PEG), afin de maintenir l’acide aminé ou le peptide en solution, a été décrite par Mutter et Bayer (Nature 1972, 237, 512-513). Dans ce cas aussi, les sous-produits sont éliminés par précipitation ou ultracentrifugation.
Plus récemment, EP 2 612 845 A1 et US 2014/0296483 (Ajinmoto Co., Inc.) ont décrit de nouveaux groupements protecteurs (ou molécules d’ancrage) permettant la solubilisation de l’acide aminé et du peptide. Ainsi, selon la molécule d’ancrage utilisée, la purification se fait soit par simple lavage à l’eau, soit par précipitation et filtration. Grâce à ces groupements protecteurs très lipophiles de la fonction acide carboxylique, la bivalirudine, un anticoagulant constitué de 20 résidus d’acides aminés a été préparée avec un rendement global de 73% et une pureté de 84% (voir D. Takahashi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 7803-7807). Malgré les avantages de cette technique, sa limite, à savoir le nombre de résidus d’acides aminés susceptibles d’être ancré, reste inconnu. De plus, le coût financier et le coût environnemental de ces molécules d’ancrage constituent un handicap.
D’autres stratégies de couplage d’acides aminés sont connues. A titre d’exemple, on peut utiliser des groupements bi-fonctionnels qui à la fois, activent la fonction acide carboxylique (C-terminal) et protège la fonction amine (Na) de l’acide aminé, en formant des structures cycliques intermédiaires hautement réactives. Généralement, celles-ci réagissent facilement avec la fonction amine (Na) d’un second dérivé d’acide aminé pour former un dipeptide. Malheureusement, les espèces obtenues sont très réactives et souvent une réaction indésirable de polymérisation à lieu. Parmi les groupements bi-fonctionnels qui ont été décrits, on peut citer le phosgène (voir R. B. Woodward et C. H. Schramm, J. Am. Chem. Soc., 1947, 69, 1551- 1552), le dichlorodiméthylsilane (voir S. H. van Leeuwen et al., Tetrahedron Letters 2002, 43, 9203-9207), l’hexafluoroacétone (voir J. Spengler et al., Chem. Rev., 2006, 106, 4728-4746) et le formaldéhyde (voir J. M. Scholtz, P. A. Bartlett, Synthesis 1989, 542-544).
La synthèse peptidique en phase solide a été décrite par Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154). Elle consiste à fixer la fonction acide carboxylique (C-terminal) du premier acide aminé ou du peptide sur une résine (support) insoluble. En conséquence, les réactifs sont utilisés en excès afin de s’assurer de la conversion totale des étapes d’activations/couplages. Les purifications se font par simple filtration et lavage de la résine. Bien que cette technique soit automatisable et plus simple, de nombreux inconvénients existent tels que le coût et la perte des réactifs utilisés en excès, et le manque d’homogénéité des peptides synthétisés car il est quasiment impossible d’obtenir des peptides homogènes : on dit que le système est dégénéré. De plus, la purification en chromatographie en phase liquide à haute performance préparative de ces peptides hétérogènes est onéreuse car très consommatrice en solvants et écologiquement peu acceptable.
Sachant que chaque étape réactionnelle est rarement quantitative et donc engendre des pertes qui se cumulent tout le long de la synthèse, et sachant que chaque étape implique des réactifs en solution (agents de couplage et produits secondaires) dont l’élimination est problématique, il serait intéressant de disposer d’un procédé plus simple, engendrant à la fois des peptides de haute pureté, un coût de production moindre et plus écologiquement compatible. Ce procédé devrait convenir pour tous types d’acides aminés naturels et pour un large spectre d’acides aminés non naturels. Tel est l’objectif de la présente invention.
Il convient de souligner que dans le cas d’un peptide thérapeutique, un rendement inférieur à 100 % implique non seulement la perte de réactifs, mais également la formation de produits secondaires qui peuvent être difficiles à séparer du peptide cible ; dans la mesure où l’on souhaite avoir des peptides aussi purs que possible pour caractériser clairement leurs effets biologiques, cela veut dire que soit on accepte le surcoût que présente la purification, soit on accepte la présence d’impuretés susceptibles d’engendrer un risque d’erreur d’appréciation des effets biologiques observés.
Le problème que la présente invention cherche à résoudre est de présenter une méthode de synthèse de peptides ou protéines plus purs, à plus fort rendement, plus écologique, moins coûteuse et qui soit automatisable. Ce procédé doit convenir au moins pour tous les acides aminés naturels et de préférence pour un large spectre d’acides aminés non naturels. Cette méthode ne devrait pas faire intervenir des molécules d’ancrage ou supports coûteux ou difficiles à synthétiser.
Objet de l’invention
La présente invention propose de résoudre les difficultés laissées dans l’art antérieur par l’utilisation de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes pour la production de peptides ou protéines de haute pureté en phase liquide. En effet, les inventeurs ont trouvé que l’utilisation de polyoléfines, et en particulier de dérivés de polyisobutènes (PIB), comme molécules d’ancrage ou support liquide, permet la solubilisation des acides aminés et la synthèse de peptides en solution organique (solvants halogénés et non halogénés), tout en facilitant leur purification par simple extraction ou lavage, en l’occurrence avec de l’eau ou un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, ou par simple filtration. En outre, certaines de ces molécules d’ancrage (notamment certains dérivés de polyisobutènes (PIB)) sont des produits disponibles dans le commerce ou alors leur synthèse est simple, directe et peu coûteuse.
L’objet de l’invention est dès lors un procédé de synthèse de peptides ou protéines par élongation successive de la deuxième extrémité (Na) d’une chaîne peptidique dont la première extrémité est fixée, par l’intermédiaire de sa fonction acide carboxylique (C-terminal) ou de sa fonction amine (Na), sur une molécule d’ancrage soluble dans un solvant apolaire, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine avec au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 50 unités. Avantageusement elle est fonctionnalisée à l’une de ses extrémités, pour permettre l’ancrage du premier acide aminé.
Avantageusement ladite molécule d’ancrage est une polyoléfine.
Avantageusement ladite molécule d’ancrage ne comporte qu’une seule chaîne polyoléfine ; cette chaîne polyoléfine peut ainsi être obtenue par une simple réaction de polymérisation (de l’isobutène).
Ladite molécule d’ancrage peut comprendre dans chacune de ses unités des groupements alkyles identiques ou non, qui sont de préférence sélectionnés dans le groupe formé par le méthyle et l’éthyle. Ladite chaîne polyoléfine présente avantageusement une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000. Ladite chaîne polyoléfine peut comprendre un nombre de liaisons carbone-carbone insaturées ne dépassant pas 5 %, et de préférence ne dépassant pas 3 %. De préférence il s’agit d’une chaîne de polyisobutène.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l’invention, ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine (ou est une chaîne polyoléfine) qui est terminée par un groupement sélectionné dans le groupe formé par :
o une fonction -X, où X est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, -NH2, -SH ;
o une fonction -Z-C6H4X1 , où
■ Z est O ou absent,
■ X1 est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, - NH2, -SH, -NH-NH2, -CXRR1, -C6H3R’(CRX)
où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, - NH2, -SH, et R est sélectionné dans le groupe formé par -H, Aryl, Hétéroaryl, et R’ est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Alkyl, -O-Alkyl, -Aryl, - O-Aryl, Hétéroaryl, -O-Hétéroaryl,
o une fonction -CR”=CH-CHX ou une fonction -CR”H-CH=CH- CHX, où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, -NH2, -SH, et R” est méthyle ou éthyle.
Ce groupement représente alors la fonctionnalisation de la chaîne polyoléfine.
Ladite première extrémité de ladite chaîne peptidique est une première unité d’acide aminé AA1 ; c’est sur ce premier acide aminé AA1 qu’est lié la molécule d’ancrage, soit sur sa fonction acide carboxylique (C-terminal), soit sur sa fonction amine (Na). Ladite chaîne peptidique est formée de n unités d’acide aminé; sa deuxième extrémité est une autre unité d’acide aminé AAn. Lors du déroulement du procédé la chaîne peptidique s’allonge par élongation successive, et pendant chacune de ces étapes d’élongation on ajoute une autre unité d’acide aminé AA(n+1) à ladite deuxième extrémité. La fonction amine (Na) des acides aminés engagée dans le procédé selon l’invention peut être protégée par un groupement Boc ou Fmoc, ou par tout autres groupements protecteurs appropriés.
On peut utiliser dans ladite chaîne peptidique des acides aminés naturels et/ou non naturels et/ou synthétiques.
Le procédé selon l’invention comprend au moins une étape dans laquelle ladite chaîne peptidique est fixée sur ladite molécule d’ancrage et est séparée du milieu réactionnel par extraction dans un solvant apolaire.
Le procédé selon l’invention permet d’obtenir des peptides ou protéines très purs, qui sont clivés de leur molécule d’ancrage après la dernière étape d’élongation de la chaîne peptidique, pour être utilisés selon leur destination, par exemple en tant que principe actif pour des essais précliniques ou cliniques.
Description détaillée
Définitions
Dans le cadre de la présente invention, nous entendons par « acide aminé » : les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels. Les acides aminés « naturels » comprennent la forme L des acides aminés qui peuvent être trouvés dans des protéines d’origine naturelle, c’est-à-dire : alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gin), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (ILe), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), sérine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr) et valine (Val).
Les acides aminés « non naturels » comprennent la forme D des acides aminés naturels définis ci-dessus, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que : arginine, lysine, phénylalanine et sérine), et les formes nor de la leucine et de la valine. Ils comprennent aussi des acides aminés non naturels, tels que :
Abu = acide 2-aminobutyrique CH3-CH2-CH(COOH)(NH2) iPr = Isopropyl-lysine (CH3)2C-NH-(CH2)4-CH(COOH)(NH2)
Aib = acide 2-aminoisobutyrique
F-trp = N-formyl-tryptophane
Orn = ornithine
Nal2 = 2-naphthylalanine
Les acides aminés « non naturels » comprennent aussi tous les acides aminés synthétiques.
Le terme « acide aminé protégé» est utilisé ici aussi pour désigner des acides aminés temporairement protégés, comme cela est décrit ci-dessus, notamment ; par exemple la fonction amine (Na) peut être protégée par un groupement Fmoc, Boc, benzyle ou tous autres groupements protecteurs appropriés.
Le procédé de préparation de peptides selon l’invention utilise des polyoléfines, ou plus précisément des oligomères de polyoléfines (les polyoléfines étant appelés aussi polyalcènes), et leurs dérivés comme molécules d’ancrage ou groupement protecteur que ce soit de la fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide aminé ou du peptide, ou de la fonction amine (Na) de l’acide aminé ou du peptide, ou de la chaîne latérale dudit acide aminé ou peptide (sous forme de liaisons ester, amide, éther, thioéther ou toutes autres fonctions) en phase liquide. Les molécules de polyoléfines comprennent une chaîne d’atomes de carbone reliés par des liaisons simples. Elles peuvent comprendre des ramifications constituées de groupements alkyles identiques ou différents, mais de préférence identiques. De préférence on utilise des polymères avec un nombre d’unités de monomères d’au moins 10 et de préférence compris entre 15 et 50. On préfère des homopolymères, mais on peut également utiliser des copolymères, et dans ce dernier cas le nombre de liaisons insaturées dans la chaîne d’atomes de carbone ne dépasse avantageusement pas 5 %, et préférentiellement ne dépasse pas 3 %. De préférence il s’agit de dérivés de polyisobutènes (PIB), une classe de polymères connue depuis les années 30 du siècle dernier, mais on peut également utiliser des dérivés de polypropylènes.
Ces molécules d’ancrage sont de préférence employées dans le procédé selon l’invention sous la forme de dérivés fonctionnalisés, comme cela sera expliqué en plus grand détail par la suite.
Selon l’invention, ces molécules d’ancrage sont liées à la fonction acide carboxylique d’un acide aminé (C-terminal) ou à la fonction amine (Na) par une liaison covalente de type amide, ester, benzyle, allyle ou toutes autres fonctions. Cela suppose que les molécules d’ancrage soient engagés sous une forme convenablement fonctionnalisée, qui est appelé dans la présente description « dérivés de PIB », sachant que ce terme englobe ici aussi les dérivés de molécules d’ancrage qui ne sont pas des dérivés du polyisobutène, mais qui sont des dérivés d’autres polyoléfines selon la définition qui est donnée ci-dessus. Cette fonctionnalisation de la molécule d’ancrage est en règle générale une fonctionnalisation terminale, de préférence à l’une des extrémités de la chaîne d’atomes de carbone ; elle sera décrite ci-dessous.
Les oligomères de polyoléfines utilisés comme molécule d’ancrage sont typiquement caractérisés par une masse moléculaire moyenne en masse, mais on peut aussi également utiliser des oligomères « purs » qui comportent des molécules identiques d’une longueur de chaîne donnée.
Cette réaction entre le dérivé de PIB et l’acide aminé conduit à un produit caractérisé par le fait que lorsque le dérivé de PIB est lié à un acide aminé ou un dérivé d’acide aminé, ayant éventuellement une chaîne latérale protégée, on obtient une molécule dont la solubilité dans l’eau est faible (< 30 mg/ml).
Plus précisément, le procédé de synthèse de peptides, éventuellement protégés, en phase liquide (solution) selon l’invention est caractérisé par le fait que l’on solubilise un acide aminé ou un peptide en milieu organique par un dérivé de PIB lié à la fonction acide carboxylique (C-terminal) ou à la fonction amine (Na) de l’acide aminé ou du peptide. Le dérivé de PIB agit comme molécule d’ancrage ou support liquide de l’acide aminé ou du peptide qui est synthétisé par accrochage successif d’acides aminés sur le dernier acide aminé fixé sur cette molécule ancrée. Ainsi, la molécule d’ancrage sert également comme groupement protecteur pendant la synthèse du peptide au cours d’itérations successives.
L’acide aminé ou le peptide éventuellement protégé, ancré sur une molécule de PIB est caractérisé en ce que la fonction acide carboxylique (C-terminal) ou la fonction amine (Na) dudit acide aminé ou peptide est lié par une liaison covalente de type ester, amide, benzyle, allyle ou toutes autres fonctions chimiques à un dérivé de PIB lipophile, donnant une solubilité dans l’eau très faible (< 30 mg/ml). C’est en ce sens que dans le procédé selon l’invention, ladite molécule d’ancrage, qui est de préférence un dérivé de PIB, agit comme un support liquide pour la synthèse de peptides ou protéines.
Cette dérivation de l’acide aminé (Na-protégé ou non) ou du peptide (Na- protégé ou non) avec le dérivé de PIB augmente de manière significative la solubilité dudit acide aminé ou dudit peptide en phase liquide organique apolaire. Plus précisément, ces acides aminés et ces peptides deviennent solubles dans des solvants organiques, tels que les solvants halogénés (chlorure de méthylène, chloroforme), l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le cyclohexane, l’hexane(s) ou des solvants aromatiques tels que le benzène ou le toluène. En conséquence, les acides aminés et les peptides accrochés à un dérivé de PIB ont un haut coefficient de partage pour la phase organique lors d’une extraction/décantation en présence d’eau ou d’un mélange eau/éthanol ou encore eau/acétonitrile, permettant ainsi leur purification simple et rapide.
La présente invention propose aussi un procédé de synthèse de peptides (protégés ou non), en phase liquide, caractérisé en ce que l’on part d’un acide aminé ou d’un peptide en solution (ou d’un dérivé d’acide aminé ou de peptide en solution), qui sera lié à l’une des molécules d’ancrage tel que défini précédemment, par l’intermédiaire de la fonction acide carboxylique (C-terminal) ou de la fonction amine (Na) du dérivé de l’acide aminé ou du peptide de départ, et que l’on additionne ou condense les acides aminés ou les peptides suivants, qui sont protégés sur leur fonction amine (Na) et éventuellement sur leur chaîne latérale, après l’activation de leur fonction acide carboxylique (C-terminal). L’activation de la fonction acide carboxylique (C-terminal) de l’acide aminé Na-protégé ou du peptide peut être réalisée par toutes les techniques connues de synthèse via la formation d’un anhydride au moyen de divers réactifs tels que : carbodiimide, chlorure d’acide, chloroformiate d’alkyle, ou toute autre technique d’activation d’un acide aminé Na-protégé.
Le procédé de synthèse de peptides selon l’invention est également caractérisé par le fait que l’on additionne ensuite les acides aminés ou les peptides à condenser. Ces acides aminés ou peptides étant activés sur leur fonction acide et protégés sur leur fonction amine (Na), et protégés si nécessaire aussi sur leur chaîne latérale.
Nous présentons ici le procédé selon l’invention étape par étape, en utilisant un exemple dans lequel on vise un tripeptide H-Tyr-Gly-Phe-OH, en utilisant soit les groupements protecteurs Boc ou Fmoc.
Le schéma réactionnel 3 montre la première étape du couplage de la fonction acide du premier acide aminé (AA1), en l’occurrence la phénylalanine (Phe), sur un dérivé de PIB fonctionnalisé par un phénol. L’acide aminé AA1 est engagé à l’état protégé par un groupement Fmoc. [Chem 3] Schéma réactionnel 3 :
Dans ce schéma réactionnel DCM signifie dichlorométhane, EDC signifie 1- éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide, HOBt signifie hydroxy-benzo- triazole et DMAP signifie 4-diméthyl-aminopyridine.
Le schéma réactionnel 4 montre la variante dans laquelle AA1 est engagé à l’état protégé par un groupement Boc.
Chem 4]
Schéma réactionnel 4 :
Dans une deuxième étape le groupe de protection (Fmoc ou Boc) est clivé pour libérer la fonction amine (Na) de AA1. Cette étape dite de déprotection est illustrée sur les schémas réactionnel 5 pour le cas du Fmoc et 6 pour le cas du Boc. Elle conduit à une molécule que nous appelons ici PIB-AA1.
[Chem 5]
Schéma réactionnel 5 :
[Chem 6]
Schéma réactionnel 6 :
Boc-Phe
ACN signifie acétonitrile, HNEÎ2 signifie diéthylamine et TFA signifie acide trifluoroacétique.
Dans une troisième étape on répète la première étape en ajoutant à la molécule PIB-AA1 , le deuxième acide aminé (appelé ici AA2), en l’occurrence la glycine (Gly) à l’état protégé (Boc ou Fmoc) ; la fonction acide (C-terminal) de AA2 (dont la fonction Na est protégée) se lie à la fonction N- terminale de PIB-AA1. Dans une quatrième étape la fonction Na de PIB- AA1 -AA2 est déprotégée, générant le dipeptide PIB-AA1 -AA2 ancré sur son support.
Dans une cinquième étape on répète la première étape en ajoutant à la molécule PIB-AA1 -AA2, le troisième acide aminé (appelé ici AA3), en l’occurrence la tyrosine protégée sur sa chaîne latérale par un groupement tert- butyle, à l’état protégé (Boc ou Fmoc) ; la fonction acide (C-terminal) de AA3 (dont la fonction Na est protégée) se lie à la fonction Na de PIB-AA1 - AA2. Dans une sixième étape, la fonction Na de PIB-AA1 -AA2-AA3 est déprotégée, et on obtient le tripeptide ancré montré sur le schéma réactionnel 7.
[Chem 7]
Schéma réactionnel 7 :
On voit aisément que ce procédé permet, par des itérations successives, d’ajouter à l’acide aminé puis au peptide accroché sur le dérivé de PIB, des acides aminés successifs, pour obtenir ainsi un peptide ayant la séquence voulue. Le peptide étant accroché sur le support liquide, il peut être séparé à tout moment, et notamment après la dernière itération, de tous produits polaires par extraction dans un solvant apolaire. A la fin de cette séquence d’élongation on peut détacher le peptide du polymère support ; ainsi le peptide perd sa solubilité dans une phase apolaire, et on peut le séparer du polymère support, pour l’utiliser conformément à sa destination.
Cette réaction de décrochage du peptide de son support liquide est illustrée sur le schéma réactionnel 8 pour le cas du tripeptide du schéma réactionnel 7. On peut utiliser un mélange d’acide trifluoroacétique (TFA), de triisopropylsilane (TIPS) et d’eau. [Chem 8]
Schéma réalctionnel 8 :
H-Tyr(f-Bu)-Gly -Phe
Le schéma 9 montre un certain nombre de dérivés de PIB avec leur fonctionnalisation qui conviennent en tant que support liquide pour exécuter la présente invention.
[Chem 9] Dans ces formules :
• X est un groupement sélectionné dans le groupe formé par : OH, NH2, NH-NH2 , SH ;
· R est un groupement sélectionné dans le groupe formé par : H, aryl, hétéro-aryl ;
• R’ est un groupement sélectionné dans le groupe formé par : H, alkyl, O-alkyl, hétéro-aryl, O-(hétéro-aryl) ;
• R" est un groupement sélectionné dans le groupe formé par : H, alkyl, O-alkyl, hétéro-aryl, O-(hétéro-aryl),
• Y est une groupement sélectionné dans le groupe formé par : O, CH2CH2.
• le nombre n est un nombre entier qui est typiquement supérieur à 10, et avantageusement compris entre 15 et 50.
En particulier, X peut être une amine libre, une hydrazine, un alcool, un thiol ou un phénol.
Dans un mode de réalisation avantageux, la masse moléculaire moyenne en masse des molécules d’ancrage, hormis la fonctionnalisation terminale (par exemple -X, -Z-C6H4X1 ou -CR”=CH-CHX comme définis ci-dessus), est comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000. Au-delà d’une masse moléculaire d’environ 20 000 ces molécules présentent une viscosité trop grande, ce qui risquerait de limiter leur solubilité dans les solvants (halogénés ou non) utilisés pour l’étape d’activation/couplage.
Certains dérivés de PIB utilisables dans le cadre de la présente invention sont disponibles dans le commerce, en tant que ligands pour la catalyse homogène. A titre d’exemple, on peut utiliser le 2-Méthyl-3-[polyisobutyl (12)]propanol (masse moléculaire moyenne en masse 757, y compris la fonctionnalisation terminale) ou le 4-[Polyisobutyl(18)]phénol (masse moléculaire moyenne en masse 1104, y compris la fonctionnalisation terminale), qui sont distribués, respectivement, sous les références 06-1037 et 06-1048 par la société Strem Chemicals. Ces deux molécules sont des dérivés de polyisobutènes, dont la chaîne est terminée, respectivement par un groupement-CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH (i.e. isopropanol) et par un groupement -CH2-C(CH3)2-C6H5-OH (i.e. phénol).
Les molécules d’ancrage préférées, à savoir les dérivés de polyisobutène, peuvent être préparés à partir de l’isobutène biosourcé. Le concept de la teneur biosourcée est défini dans la norme ISO 16620-1 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 1 : Principes généraux », notamment par une définition des termes « polymère synthétique biosourcé », « teneur en polymère synthétique biosourcé », « teneur en carbone biosourcé » et « teneur en masse biosourcée », ainsi que dans les normes ISO 16620-2 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 2 : Détermination de la teneur en carbone biosourcé » et ISO 16620-3 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 3 : Détermination de la teneur en polymère synthétique biosourcée », pour les méthodes de détermination et quantification du caractère biosourcé.
Avantageusement, les molécules d’ancrage présentent une teneur en carbone biosourcé supérieure à 90%, de préférence supérieure à 93%, et encore plus préférentiellement supérieure à 95%. 20 exemple -X, -Z-CehhX1 ou -CR”=CH-CHX comme définis ci-dessus), est comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000. Au-delà d’une masse moléculaire d’environ 20 000 ces molécules présentent une viscosité trop grande, ce qui risquerait de limiter leur solubilité dans les solvants (halogénés ou non) utilisés pour l’étape d’activation/couplage.
Certains dérivés de PIB utilisables dans le cadre de la présente invention sont disponibles dans le commerce, en tant que ligands pour la catalyse homogène. A titre d’exemple, on peut utiliser le 2-Méthyl-3-[polyisobutyl (12)]propanol (masse moléculaire moyenne en masse 757, y compris la fonctionnalisation terminale) ou le 4-[Polyisobutyl(18)]phénol (masse moléculaire moyenne en masse 1104, y compris la fonctionnalisation terminale), qui sont distribués, respectivement, sous les références 06-1037 et 06-1048 par la société Strem Chemicals. Ces deux molécules sont des dérivés de polyisobutènes, dont la chaîne est terminée, respectivement par un groupement-CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH (i.e. isopropanol) et par un groupement -CH2-C(CH3)2-C6H5-OH (i.e. phénol).
Les molécules d’ancrage préférées, à savoir les dérivés de polyisobutène, peuvent être préparés à partir de l’isobutène biosourcé. Le concept de la teneur biosourcée est défini dans la norme ISO 16620-1 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 1 : Principes généraux », notamment par une définition des termes « polymère synthétique biosourcé », « teneur en polymère synthétique biosourcé », « teneur en carbone biosourcé » et « teneur en masse biosourcée », ainsi que dans les normes ISO 16620-2 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 2 : Détermination de la teneur en carbone biosourcé » et ISO 16620-3 :2015 « Plastiques - Teneur biosourcée - partie 3 : Détermination de la teneur en polymère synthétique biosourcée », pour les méthodes de détermination et quantification du caractère biosourcé.
Avantageusement, les molécules d’ancrage présentent une teneur en carbone biosourcé supérieure à 90%, de préférence supérieure à 93%, et encore plus préférentiellement supérieure à 95%. 21
Le procédé selon l’invention présente de nombreux avantages.
Un premier avantage est qu’il permet une production de peptide en phase liquide, où le peptide (Na-protégé ou non) lié à la molécule d’ancrage, définie précédemment, reste en solution organique.
Un second avantage est qu’il permet d’obtenir des peptides de haute pureté par un simple lavage à l’eau ou d’un mélange eau/éthanol ou encore eau/acétonitrile, ou par filtration, engendrant ainsi l’élimination des sous- produits (sels, acides ou toutes autres espèces moléculaires survenant par exemple pendant la déprotection de la fonction amine) qui ne sont pas liés au dérivé de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes et des réactifs en excès de la phase organique. Des solvants organiques tels que le cyclohexane, l’heptane(s), l’hexane(s) qui ont des points éclairs < 15°C, sont appropriés pour solubiliser les dérivés de polyoléfines ou d’oligomères de polyoléfines ou polyalcènes pendant l’extraction ou le lavage. Le procédé selon l’invention permet donc d’éviter toutes les étapes de purification nécessaires dans les procédés de l’état de la technique.
Un troisième avantage, particulièrement important, est que le procédé selon l’invention permet de synthétiser des peptides voire des protéines, en ajustant la longueur du dérivé de polyoléfines ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes, en les rendant plus lipophiles.
Un autre avantage est la possibilité de contrôler la pureté du peptide en cours de synthèse, à tout instant, par le prélèvement d’un aliquote suivi d’une analyse par les différentes techniques connues de l’homme du métier (telles que la spectrométrie de masse, la chromatographie en phase liquide à haute performance, la résonance magnétique nucléaire du proton ou du carbone- 13).
Encore un autre avantage est que les molécules d’ancrage préférées, à savoir les dérivés de polyisobutène, peuvent être préparés à partir de l’isobutène biosourcé, comme cela a été expliqué ci-dessus.
D’autres avantages sont la possibilité d’automatiser le procédé selon l’invention, et la possibilité de recycler les molécules d’ancrage (polyoléfines 22 ou oligomères de polyoléfines ou polyalcènes). En effet, lorsque la série d’itérations pour obtenir la séquence du peptide cible est achevée, le peptide est déprotégé de ses groupements protecteurs et finalement de la molécule d’ancrage par une des réactions habituellement utilisées en synthèse peptidique (telles que l’hydrolyse, la saponification, l’hydrogénolyse), ce qui libère la molécule d’ancrage. Ainsi, la molécule d'ancrage peut être recyclée. Grâce à leur haute pureté, les peptides ou protéines produits par ce procédé peuvent être utilisés en tant que produits pharmaceutiques (médicaments et vaccins), produits cosmétiques, produits phytosanitaires ou produits agroalimentaires, ou pour accéder à l’un quelconque de ces produits.
Exemples
Ces exemples illustrent des modes de réalisation de l’invention, mais ne limitent pas sa portée. Les exemples 1 et 2 illustrent deux variantes de la réaction de couplage du premier acide amine (AA1) du peptide cible (engagé dans la réaction sous la forme Na-protégé par le Fmoc ou le Boc) avec un support liquide (en l’occurrence un dérivé de PIB). Les exemples 3 et 4 illustrent deux variantes de la déprotection de l’acide aminé suivant (AA2), engagé dans la réaction sous la forme Na-protégé par le Fmoc ou le Boc (appelé ici, respectivement, « dérivé de Fmoc » ou « dérivé de Boc »). L’exemple 5 illustre le décrochage du peptide de la molécule d’ancrage, conformément au schéma réactionnel 8 ci-dessus.
Ces exemples utilisent des solvants chlorés, à savoir le DCM. Des résultats similaires ont été obtenus avec des solvants de nocivité moindre, tels que : tétrahydrofurane, 2-méthyltétrahydrofurane, carbonate d’éthylène, purs ou en mélange.
Exemple 1 : Réaction de couplage utilisant EDC/HOBt
L’acide aminé Na-protégé (Fmoc-AA-OH ou Boc-AA-OH) (1 ,3 mmol) a été dissous dans le DCM (5 mL) sous agitation magnétique et sous atmosphère d’azote, puis refroidi à 0°C dans un bain de glace. Ont été ajoutés successivement le 4-[Polyisobutyl(18)]phénol à titre de dérivé de PIB (1 23 mmol) dissout dans le DCM (5 mL) et l’hydroxybenzotriazole (1 ,4 mmol). Après 10 minutes, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (1 ,5 mmol) a été ajouté et le milieu réactionnel a été laissé remonter lentement à température ambiante (3 h ou 16 h). Le milieu réactionnel a été concentré sous pression réduite. Le cyclohexane a été ajouté au résidu puis lavé trois fois avec de l’eau ou avec un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, puis avec une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur Na2S04, filtrée, et le solvant a été évaporé sous pression réduite.
Exemple 2 : Réaction de couplage utilisant EDC/DMAP
L’acide aminé N-protégé (Fmoc-AA-OH ou Boc-AA-OH) (1 ,3 mmol) a été dissous dans le DCM (5 mL) sous agitation magnétique et sous atmosphère d’azote, puis refroidi à 0°C dans un bain de glace. Ont été ajoutés successivement, le dérivé de PIB (amine libre, alcool, thiol ou phénol) (1 mmol) dissout dans le DCM (5 mL), la 4-diméthylaminopyridine (DMAP) (0,3 mmol). Après 10 minutes, l’EDC (2 mmol) a été ajouté et le milieu réactionnel a été laissé remonter lentement à température ambiante (3 h ou 16 h). Le milieu réactionnel a été concentré sous pression réduite. Le cyclohexane a été ajouté au résidu puis lavé trois fois avec de l’eau ou avec un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, puis avec une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur Na2S04, filtrée, et le solvant a été évaporé sous pression réduite.
Exemple 3 : Déprotection du fluorénylmethylcarbamate (Fmoc)
Le dérivé du fluorénylmethylcarbamate (1 mmol) a été dissous dans le DCM (5 mL) sous agitation magnétique, et a été refroidi à 0°C dans un bain de glace. Une solution d’ACN/FINEt2 (2/1) (5 mL) a été ajoutée, puis le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 4 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Le cyclohexane a été ajouté au résidu qui a ensuite été lavé trois fois avec de l’eau ou avec un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, puis avec une solution aqueuse saturée en 24 hydrogénocarbonate de sodium et avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur Na2S04, filtrée, et le solvant a été évaporé sous pression réduite.
Exemple 4 : Déprotection du fe/f-butoxycarbonyle (Boc)
Le dérivé du tert- butylcarbamate (1 mmol) a été dissout dans le dans le DCM (5 mL) sous agitation magnétique, et a été refroidi à 0°C dans un bain de glace. Un mélange DCM/TFA (1/1) (35 mL) a été ajouté, puis le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 1 h. Les solvants ont été évaporés sous pression réduite. Le cyclohexane a été ajouté au résidu qui a été ensuite lavé trois fois avec de l’eau ou avec un mélange eau/éthanol ou eau/acétonitrile, puis avec une solution aqueuse saturée en hydrogénocarbonate de sodium, et avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La phase organique a été séchée sur Na2SC>4, filtrée, et le solvant a été évaporé sous pression réduite.
Exemple 5 : Décrochage du peptide de la molécule d’ancrage
Le tripeptide ancré sur son support solide (1 mmol) dissout dans le DCM (5 mL) a été ajouté à un mélange d’acide trifluoroacétique/triisopropylsilane/eau (v/v/v, 95/2,5/2,5) (5 mL) préalablement refroidi à 0°C dans un bain de glace. Le milieu réactionnel a été agité pendant 3 h à température ambiante. De l’éther éthylique a été ajouté au milieu réactionnel et le précipité a été collecté par filtration et a été séché sous vide.

Claims

25 REVENDICATIONS
1 . Procédé de synthèse de peptides ou protéines par élongation successive de la deuxième extrémité (Na) d’une chaîne peptidique dont la première extrémité, par l’intermédiaire de sa fonction acide carboxylique (C- terminal) ou de sa fonction amine (Na), est fixée sur une molécule d’ancrage soluble dans un solvant apolaire, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine avec au moins 10 unités de monomères, et de préférence entre 15 et 50 unités.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage ne comporte qu’une seule chaîne polyoléfine.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine est une chaîne de polyisobutène.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage est une polyoléfine.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine est fonctionnalisée à l’une de ses extrémités.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine comprend un nombre de liaisons carbone-carbone insaturées ne dépassant pas 5 %, et de préférence ne dépassant pas 3 %.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite chaîne polyoléfine présente une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 600 et 20 000, et de préférence entre 700 et 15 000.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage comporte une chaîne polyoléfine (ou est une chaîne polyoléfine) terminée par un groupement sélectionné dans le groupe formé par :
o une fonction -X, où X est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, -NH2, -SH ;
o une fonction -Z-C6H4X1 , où
■ Z est O ou absent, 26
■ X1 est sélectionnée dans le groupe formé par : -OH, - NH2, -SH, -NH-NH2, -CXRR1, -C6H3R’(CRX)
(où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, - NH2, -SH, et R est sélectionné dans le groupe formé par -H, Aryl, Hétéroaryl, et R’ est sélectionné dans le groupe formé par -H, -Alkyl, -O-Alkyl, -Aryl, - O-Aryl, Hétéroaryl, -O-Hétéroaryl,
o Une fonction -CR”=CH-CHX ou une fonction -CR”H-CH=CH- CHX, où X est sélectionné dans le groupe formé par -OH, -NH2, -SH, et R” est méthyle ou éthyle.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que :
- ladite première extrémité de ladite chaîne peptidique est une première unité d’acide aminé AA1 , et
- ladite chaîne peptidique est formée de n unités d’acide aminé, et
- la deuxième extrémité de ladite chaîne peptidique est une autre unité d’acide aminé AAn.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lors de ladite élongation on ajoute une autre unité d’acide aminé AA(n+1) à ladite deuxième extrémité.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant au moins une étape dans laquelle ladite chaîne peptidique fixée sur ladite molécule d’ancrage est séparée du milieu réactionnel par extraction dans un liquide apolaire.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que la solubilité de ladite chaîne peptidique fixée sur ladite molécule d’ancrage dans l’eau est inférieure à 30 mg/mL.
13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisé en ce que ladite molécule d’ancrage présente une teneur en carbone biosourcé supérieure à 90%, de préférence supérieure à 93%, et encore plus préférentiellement supérieure à 95%.
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