CN113226361A - 疫苗多肽组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了免疫原性肽、包含该免疫原性肽的融合多肽和运载体分子，以及包含这些免疫原性肽、具备免疫原性肽的融合异源多肽和/或运载体分子的免疫原性组合物，并且该组合物能够引发针对感染性生物体的抗体产生。还公开了制备方法及其在引起针对感染性生物体诸如百日咳鲍特菌(B.pertussis，Bp)的一种或更多种菌株的抗体反应中的用途。

Description

疫苗多肽组合物及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月15日提交的美国临时申请第62/745,878号的优先权，并且该美国临时申请通过引用以其整体并入本文，如同以其整体阐述一样。
通过引用并入声明
本说明书中引用的所有参考文献的全部内容通过引用明确并入本文。
背景
许多疾病的无毒、有广泛交叉反应的免疫保护性抗原尚待鉴定。此外，由于导致疾病的一种或更多种生物体对疫苗组分的适应，存在有效疫苗的疾病的患病率可能随着时间的推移而增加。
例如，百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)是鲍特菌属(Bordetella)的革兰氏阴性、需氧的、致病性、有荚膜的球杆菌。其毒力因子包括百日咳毒素、丝状血凝素(filamentous
Figure BDA0003115139500000011
)、百日咳杆菌黏附素(pertactin)、菌毛(fimbria)和气管细胞毒素。2003年公布了4,086,186个碱基对的完整百日咳鲍特菌(B.pertussis)基因组。百日咳鲍特菌是人类特异性细菌病原体，是百日咳(whooping cough)(即百日咳(pertussis))最常见的致病原(causative agent)。百日咳的特征是早期卡他期(catarrhal phase)，随后是严重且持久的咳嗽。咳嗽的严重程度在未免疫的婴儿中是最糟糕的，因此他们经历最高的住院率和死亡率(Gabutti等人)。
在贯穿20世纪的大部分时间里，使用灭活全细胞疫苗来预防百日咳。全细胞疫苗在20世纪90年代被无细胞百日咳疫苗所替代。无细胞百日咳疫苗由3-5种蛋白组分组成，即由百日咳毒素亚基A(PtxA)、菌毛血清型2(fim2)、菌毛血清型3(fim3)、百日咳杆菌黏附素(Prn)和丝状血凝素(FHA)组成(Plotkin，2014)。
尽管有高水平的疫苗覆盖，最近，美国报道的百日咳病例数目已经增加[Burns]。报道的百日咳病例从1934年报道的265,269例病例减少至1976年的1010例最低点。然而，最近报道的病例数目在2012年达到48,277例病例的峰；2016年报道了17,972例病例(CDC,Pertussis[Whooping Cough])。
多种因素已经促成增加的百日咳发生率，包括提高的意识、改进的诊断方法和实施无细胞百日咳疫苗后减弱的免疫力。因为在美国分离的百日咳鲍特菌菌株不再一致地表达百日咳杆菌黏附素和FHA，百日咳鲍特菌的遗传疫苗逃逸也可能有所贡献[Marieke,Schmidtke]。由于降低的疫苗有效性以及由此导致的群体免疫力下降，目前对百日咳免疫接种的建议包括每次妊娠期间对每位孕妇进行免疫接种，以临时为新生儿提供保护(CDC,Pregnancy and Whooping Cough)。
因此，开发预防疾病(其中百日咳仅是最近的一个实例)的替代疫苗是重要的公共卫生需求。
发明概述
本文的实施方案涉及疫苗组合物和疾病治疗。在一些实施方案中，公开了由细胞外和表面暴露的表位构建细菌异源多肽疫苗的方法。
在特定实施方案中，采用了多种方法的组合，例如逆向疫苗学和计算机蛋白结构分析。逆向疫苗学使用基因组生物信息学来鉴定存在于所有(经测序的)菌株中并且可能具有细胞外或表面暴露区域的蛋白。计算机蛋白结构分析鉴定了这些蛋白中免疫***可及的区域。
通过将逆向疫苗学与计算机蛋白结构分析整合，人们可以鉴定潜在暴露于免疫***的氨基酸序列保守的区域的子集，即，可用作针对物种中所有菌株的靶。然后，细胞外/表面暴露的序列保守肽用于设计被克隆、表达和纯化的融合多肽。
这些和其他方面将在下文进一步描述。然而，本文描述的实施方案和实例并不意图是限制性的。
附图简述
本公开内容的若干实施方案在此于附图中示出。然而，应注意，附图仅图示了若干典型的实施方案，并且因此不意图被认为是对本公开内容范围的限制。
图1描绘了用BpPoly1对12只小鼠进行免疫接种的实验；最终免疫接种后出血几何平均滴度为11.22。如图示的，相比于对照小鼠，免疫接种的小鼠在第3天和第7天在肺中发现的总菌落形成单位较少。
图2描绘了用BpPoly1对24只小鼠进行免疫接种的实验；最终免疫接种后出血几何平均滴度为15.43。如图示的，相比于对照小鼠，免疫接种的小鼠在第3天、第10天和第14天在肺中发现的总菌落形成单位较少。
图3描绘了用BpPoly3对12只小鼠进行免疫接种的实验；最终免疫接种后出血几何平均滴度为16.39。如图示的，相比于对照小鼠，免疫接种的小鼠在第3天和第7天在肺中发现的总菌落形成单位较少。
图4描绘了使用肽的异源疫苗多肽的示意性表示，所述肽来源于同一蛋白上不同基因座的肽区域的序列和/或来源于同一菌株、物种或生物体内的不同蛋白。
图5描述了Bp Poly 100的设计。在这种情况下，单独的蛋白和具体的肽与来自deGouw等人的该蛋白的相对表达值一起列出。连接的肽的线性序列与掺入到各自Bp Poly中的实际肽序列一起示出。交替的红色/黑色(红色在黑白描绘中是斜体的)表示单独肽之间的划分。另外地，还示出了每种Bp Poly的计算的分子量和pI。a)百日咳鲍特菌菌株Tohama中蛋白的NCBI登录号。后缀是我们指定的肽编号。b)精选的(curated)百日咳鲍特菌(BP)蛋白名称。c)已知的基因名称或功能。Con.Hyp＝保守假设(conserved hypothetical)。d).基于de Gouw等人的数据的相对mRNA丰度。基因的相对表达由转录组分析确定。值范围为0至最大程度地表达的分泌蛋白ptxA的52,549。
图6描述了Bp Poly 101的设计。在这种情况下，单独的蛋白和具体的肽与来自deGouw等人的该蛋白的相对表达值一起列出。连接的肽的线性序列与掺入到各自Bp Poly中的实际肽序列一起示出。交替的红色/黑色(红色在黑白描绘中是斜体的)表示单独肽之间的划分。另外地，还示出了每种Bp Poly的计算的分子量和pI。a)百日咳鲍特菌菌株Tohama中蛋白的NCBI登录号。后缀是我们指定的肽编号。b)精选的百日咳鲍特菌(BP)蛋白名称。c)已知的基因名称或功能。Con.Hyp＝保守假设。d).基于de Gouw等人的数据的相对mRNA丰度。基因的相对表达由转录组分析确定。值范围为0至最大程度地表达的分泌蛋白ptxA的52,549。
图7描绘了感染了百日咳鲍特菌菌株Tohama的小鼠的肺中的细菌滴度。柱内的数字是指每个时间点时每个队列中的动物数目。
图8描绘了使用来自用BVP Hi Poly 1免疫接种的大鼠的免疫前血清和免疫后血清进行的12种流感嗜血杆菌(H.influenzae)菌株的活细胞ELISA。
图9描绘了细菌疫苗多肽Hi Poly 1的组成。Hi Poly 1以流感嗜血杆菌肽的线性序列来设计，如示出的，每个末端处具有BamA-3，N-末端处具有His-标签。显示了组合的流感嗜血杆菌肽的氨基酸长度和总体大小。
图10示出了经纯化的Hi Poly 1的SDS-PAGE。Hi Poly1从镍亲和柱洗脱，并且洗脱物的级分(fraction)通过变性SDS-PAG检查。分子量标志物(泳道A)用于估计多肽(泳道B)的大小。
图11描绘了来自用Hi Poly 1免疫接种的毛丝鼠(chinchillas)的抗血清的ELISA。针对全多肽和单独组分肽测试抗血清(数据以与HiPoly1中肽的顺序相同的顺序示出)。40份毛丝鼠抗血清样品的平均log2转化滴度在用Hi Poly 1最终免疫接种之后14天收集。
图12展示了保护由针对Hi Poly 1产生的抗血清提供。在菌血症幼龄大鼠(infantrat)模型中确定了保护。幼龄大鼠用毛丝鼠抗HiPoly1 BVP抗血清(BVP)匹配的免疫前血清(PIS)或PBS进行处理。24小时后，所有的大鼠都用NTHi菌株R2866攻击，并且另外的24小时后收集血液以确定细菌滴度。使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验比较细菌滴度(平均值±SD)，PBS相比于BVP，p＝0.018，并且PIS相比于BVP，p＝0.0098。
图13描绘了用NTHi 86-028NP攻击的毛丝鼠中的OM的鼓室测压(tympanometric)评估。示出了基于鼓膜宽度和顺应性通过鼓室造影术(tympanography)确定为中耳炎阳性的耳朵的百分比。对照毛丝鼠(用单独的佐剂免疫接种)以蓝色示出，并且用BVP Hi Poly 1免疫接种的毛丝鼠以绿色示出。在第3天、第7天、第10天和第14天进行鼓室测压术。使用Fisher精确检验，在第7天和第10天，对照动物和BVP动物之间存在统计学显著差异(分别地，p＝0.0002和0.0004)。柱内的数字是指检查的阳性耳朵数目和总队列大小)。
图14描绘了用NTHi 86-028NP攻击的毛丝鼠中的中耳炎的不知***耳镜评估(blinded video otoscopic assessment)。示出了通过不知情耳镜检查确定为中耳炎阳性的耳朵的百分比。对照毛丝鼠(用单独的佐剂免疫)以蓝色示出，并且Hi Poly 1免疫的毛丝鼠以绿色示出。在第3天、第7天、第10天和第14天进行耳镜检查。使用Fisher精确检验，在第7天、第10天和第14天，对照动物和BVP动物之间存在统计学显著差异(分别地，p＝0.0001、0.0001和0.019)。柱内的数字是指检查的阳性耳朵数目和总队列大小。
图15示出了可检测到积液的中耳(MEE)的百分比。示出了对照(蓝色)毛丝鼠组和BVP Hipoly1免疫接种的(绿色)毛丝鼠组中具有可检测到中耳积液的耳朵数目。如果在三次单独叩刺(taps)后没有观察到流体，则耳朵被确定为干燥。在第3天、第7天、第10天和第14天进行取样。使用Fisher精确检验，在第10天和第14天，对照动物和BVP动物之间存在统计学上显著差异(分别地，p＝0.0001和0.00028)。柱内的数字是指检查的阳性耳朵数目和总队列大小。
图16描绘了中耳积液(MEE)中的细菌滴度。示出了对照动物(蓝色)和用BVP HiPoly 1免疫接种的动物(绿色)的细菌滴度(cfu/ml)。来自不可检测到中耳液的动物的数据被算作0cfu/ml。在第10天和第14天对照组和Hi Poly 1组之间的差异是显著的(分别地，p＝0.004和0.00074；Wilcoxon-Mann-Whitney检验)。柱内的数字是每组中动物的总数目。
详细描述
在某些实施方案中，本公开内容涉及能够引发针对致病生物体(并且在一个实例中百日咳鲍特菌(Bp))的抗体产生的免疫原性肽。在某些实施方案中，本公开内容还涉及包含免疫原性肽的融合多肽和运载体分子，以及涉及包含这些免疫原性肽、融合多肽和/或具备肽的运载体分子的免疫原性组合物。
在某些实施方案中，本公开内容还涉及使用上文的免疫原性肽/多肽/运载体分子/免疫原性组合物引起针对致病生物体(例如(但不通过限制的方式)，Bp)的一种或更多种菌株的抗体反应作为疫苗或者用于产生用于受试者的主动或被动免疫接种的抗血清的方法。
在更详细地描述本公开内容的肽、融合多肽和运载体分子组合物及其使用方法的各种实施方案之前，应当理解，本公开内容在应用上不限于以下描述中阐述的方法和组合物的细节。本文提供的描述意图仅用于说明的目的，并不意图以限制性的意义来解释。本公开内容能够进行其他实施方案，或者能够以各种方式实践或进行。因此，本文使用的语言意图被赋予最广泛的可能范围和含义，并且实施方案意在是示例性的而非穷举性的。此外，将理解的是，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的并且不应被视为限制性的，除非另外如此指明。此外，在以下详细描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本公开内容的更彻底的理解。然而，对于本领域的普通技术人员将明显的是，本公开内容的各种实施方案可以在没有这些具体细节的情况下被实践。
在其他情况下，没有详细描述本领域普通技术人员熟知的特征，以避免不必要地使描述复杂化。对本领域普通技术人员而言明显的所有替代方案、置换、修改和等同物都意图包括在如本文定义的本公开内容的范围内。因此，包括特定实施方案的下文描述的实例将用于说明本公开内容的实践，应当理解，所示的细节仅是通过实例的方式并且是为了说明性地讨论特定实施方案的目的，并且是为了提供被认为是对本公开内容的程序以及原理和概念方面的有用且容易地理解的描述而呈现的。
本文公开的所有组合物以及其产生和应用方法及其用途根据本公开内容均可被制备和执行而无过度实验。因此，虽然本公开内容的组合物和方法已关于特定实施方案进行了描述，对于本领域普通技术人员而言将明显的是，变化可应用至本文描述的组合物和/或方法以及方法的步骤中或步骤的顺序中，而不偏离本公开内容的概念、精神和范围。
说明书中提及的所有专利、公布的专利申请和非专利出版物指示本公开内容所属领域的技术人员的技术水平。
除非本文另外定义，与本公开内容关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
除非另外指明，如根据本公开的方法和组合物使用的以下术语应理解为具有以下含义：
当连同权利要求书和/或说明书中的术语“包含(comprising)”使用时，使用词"一个/种(a)"或"一个/种(an)"可以意指“一个/种(one)”，但它还与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”、和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。在权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指示为仅指替代物或当替代物是相互排斥的时，尽管本公开内容支持仅指替代物和“和/或”的定义。术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2个/种、3个/种、4个/种、5个/种、6个/种、7个/种、8个/种、9个/种、10个/种、15个/种、20个/种、30个/种、40个/种、50个/种、100个/种或其中包含的任何整数。术语“至少一个/种”可以扩展至多达100个/种或1000个/种或更多个/种，这取决于所附的术语；此外，100个/种/1000个/种的数量不被认为是限制性的，因为更高的限值也可以产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X、单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。
如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和包括“(include)”)，或“包含(containing)”(和“包含(containing)”的任何形式，诸如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
如本文使用的术语“或其组合”是指在术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，"A、B、C或其组合”意图包括以下中的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果顺序在特定上下文中是重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明确包括了包含一个或更多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，通常不存在对任何组合中的项目或术语的数目限制，除非从上下文另外明显的。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括组合物、施用组合物所使用的方法的固有误差变化，或在研究受试者中间存在的变化。如本文使用的，限定词“约”或“大约”不仅意图包括精确的值、量、程度、取向或其他合格的特征或值，还意图包括由于例如测量误差、制造公差、施加在各种部件或组分上的应力、观察者误差、磨损及它们的组合而引起的一些微小变化。在本文提及可测量值诸如量、时间持续时间等时使用的情况下，术语“约”或“大约”意指涵盖例如从指定值±10％的变化，因为这样的变化适于进行所公开的方法，并且如本领域普通技术人员所理解的。如本文使用的，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况完全发生，或者随后描述的事件或情况很大程度发生。例如，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况至少90％的时间或至少95％的时间或至少98％的时间发生。
如本文使用的，对“一种实施方案(one embodiment)”或“一种实施方案(anembodiment)”的任何提及意味着结合该实施方案描述的特定要素、特征、组成、结构或特征被包括在至少一种实施方案中。措辞“在一种实施方案中”在说明书中各处地方的出现不一定都指同一种实施方案。
术语“突变体”或“变体”意图是指具有与野生型形式的蛋白、肽或核酸不同的至少一个氨基酸或核苷酸的蛋白、肽或核酸，并且包括但不限于点取代、多个连续或非连续取代、嵌合体或融合蛋白以及编码它们的核酸。保守氨基酸取代的实例包括，但不限于，在同一组中进行的取代，诸如在碱性氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(诸如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(诸如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(诸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(诸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(诸如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组中进行的取代。可能的取代的其他实例在下文描述。
术语“药学上可接受的”是指适于施用至人类和/或动物而没有与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(诸如毒性、刺激和/或过敏反应)的化合物和组合物。
“生物活性”意指修饰生物体的生理***的能力而不涉及活性剂如何具有其生理作用。
如本文使用的，“纯的”或“基本上纯的”是指目标物质是存在的优势物质(即，在摩尔基础上，它比其组合物中的任何其他目标物质更丰富)，并且特别地基本上纯化的级分是其中目标物质构成所有存在的大分子物质的至少约50％(基于摩尔)的组合物。通常，基本上纯的组合物会构成组合物中存在的所有大分子物质的多于约80％，更特别地多于约85％、多于约90％、多于约95％或多于约99％。术语“纯的”或“基本上纯的”也指其中目标物质(例如，肽化合物)是至少60％(w/w)纯的，或至少70％(w/w)纯的，或至少75％(w/w)纯的，或至少80％(w/w)纯的，或至少85％(w/w)纯的，或至少90％(w/w)纯的，或至少92％(w/w)纯的，或至少95％(w/w)纯的，或至少96％(w/w)纯的，或至少97％(w/w)纯的，或至少98％(w/w)纯的，或至少99％(w/w)纯的，或至少100％(w/w)纯的制品。
术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用，并且应理解为指温血动物，特别地，哺乳动物。在该术语的范围和含义内的动物的非限制性实例包括犬、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、毛丝鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、旧世界猴和新世界猴(Old and New Worldmonkeys)、非人类灵长类动物和人类。
“治疗”是指治疗性处理。“预防”是指预防性(prophylactic)或预防性(preventative)处理措施。术语“治疗”是指出于治疗性目的将组合物施用至患者。
术语“治疗性组合物”和“药物组合物”是指可以通过本领域已知的任何方法或本文考虑的其他方式施用至受试者的含活性剂的组合物，其中施用该组合物带来如本文其他地方描述的治疗效果。此外，本公开内容的组合物可以使用本领域熟知的制剂技术设计成提供延迟释放、控制释放、延长释放和/或持续释放。
术语“有效量”是指当以本公开内容的方式使用时足以表现出可检测到的治疗效果而没有与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)的活性剂的量。对于患者的有效量取决于患者的类型、患者的体型和健康状况、待治疗状况的性质和严重程度、施用方法、治疗持续时间、并行疗法(concurrent therapy)(如果有的话)的性质、所用的具体制剂等。因此，预先指定精确的有效量是不可能的。然而，用于给定情况的有效量可以由本领域普通技术人员基于本文提供的信息使用常规实验来确定。
术语“肽”在本文用于表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基基团和羰基基团之间的肽键相互连接形成氨基酸序列的一系列氨基酸残基。词语肽不被意图限定长度，但只是定义它是蛋白的一部分。具体地，表面暴露的肽是蛋白中暴露于抗体结合的任何区域。在某些实施方案中，免疫原性肽的长度范围可以为8个至15个至25个至40个至60个至75个至100个或更多个氨基酸，例如，8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个或60个氨基酸。术语“多肽”或“蛋白质”在本文用于表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基基团和羰基基团之间的肽键相互连接的一系列氨基酸残基，其中长度长于单个肽。“融合蛋白”或“融合多肽”是指通过重组或合成方法将肽组合成连续构型而产生的蛋白或多肽(并且可以可互换使用)。
如本文使用的，“免疫原性组合物”是指包含例如肽、多肽、融合蛋白或具有与其缀合的肽或多肽的运载体分子的组合物，该组合物引发免疫反应，诸如在宿主细胞或宿主生物体中产生抗体。免疫原性组合物可以任选地包含佐剂。在某些实施方案，免疫原性组合物是疫苗。
在本文使用的情况下，术语“抗原片段”是指本文描述的抗原肽中也能够引发免疫原性反应的片段。
如本文使用的术语“同源”或“％同一性”意指与对应参考(例如，野生型)核酸、肽或蛋白具有以下同源性程度的核酸(或其片段)或氨基酸序列(肽或蛋白)：可以等于或大于70％，或者等于或大于80％，或者等于或大于85％，或者等于或大于86％，或者等于或大于87％，或者等于或大于88％，或者等于或大于89％，或者等于或大于90％，或者等于或大于91％，或者等于或大于92％，或者等于或大于93％，或者等于或大于94％，或者等于或大于95％，或者等于或大于96％，或者等于或大于97％，或者等于或大于98％，或者等于或大于99％。例如，关于肽或多肽，如本文描述的同源性或同一性的百分比通常计算为在两个序列中较小的序列中发现的与被比较的序列中相同氨基酸残基对齐(当在100个氨基酸的长度中可以引入四个空位来帮助这种对齐时)的氨基酸残基的百分比(如Dayhoff在Atlas ofProtein Sequence and Structure，Vol.5,p.124，National Biochemical ResearchFoundation,Washington,D.C.(1972)中阐释的)。在一种实施方案中，如上文描述的同源性百分比被计算为在两个序列中较小的序列中发现的组分(也可以在两个序列中较大的序列中发现(引入空位))的百分比，其中组分被定义为四个连续氨基酸的序列。还包括了基本上同源的任何蛋白产物，所述蛋白产物可以通过与天然蛋白产物的抗体的交叉反应性来分离。序列同一性或同源性可以通过将比对时使得重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化的序列进行比较来确定。特别地，序列同一性可以使用许多数学算法中的任何一种来确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin&Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2264-2268；如在Karlin&Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-5877)中修改的)的算法。在至少一种实施方案中，“％同一性”表示在具有相同活性的蛋白或编码相似蛋白的两个序列中对应位置处相同的氨基酸或核苷酸的数目。例如，两个各自具有100个残基的氨基酸序列，在对应位置处的95个氨基酸相同时，具有95％的同一性。类似地，两个各自具有100个残基的氨基酸序列，在对应位置处的至少90个氨基酸相同时，具有至少90％的同一性。类似地，两个各自具有20个残基的氨基酸序列，在对应位置处的19个氨基酸相同时，具有95％的同一性，或者在对应位置处的至少18个氨基酸相同时，具有90％的同一性，或者在对应位置处的至少17个氨基酸相同时，具有85％的同一性，或者在对应位置处的至少16个氨基酸相同时，具有80％的同一性。
此外，当序列在本文被描述为与参考序列具有“至少X％同一性”时，除非另外指明，这意图包括大于X％的所有百分比，诸如例如，(X+1)％、(X+2)％、(X+3)％、(X+4)％，等等，直至100％。
用于序列比较的数学算法的另一个实例是Myers&Miller(CABIOS(1988)4:11-17)的算法。这样的算法被并入到作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版本)中。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。又另一种可用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的算法是FASTA算法，如Pearson&Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:2444-2448)中描述的。
另一种算法是WU-BLAST(Washington University BLAST)2.0版本软件(用于若干UNIX平台的WU-BLAST 2.0版本可执行程序)。该程序基于WU-BLAST 1.4版本，该版本继而基于公共领域NCBI-BLAST 1.4版本(Altschul&Gish，1996，Local alignment statistics，Doolittle编著，Methods in Enzymology 266，460-480；Altschul等人，Journal ofMolecular Biology1990，215，403-410；Gish&States，Nature Genetics，1993，3：266-272；Karlin&Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，5873-5877；所有文献通过引用并入本文)。
除了本文另外提及的那些，还提及了由美国国家生物技术信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)(Bethesda,MD)提供的程序BLAST、空位BLAST(gapped BLAST)、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中广泛用于此目的，并且可以比对两个氨基酸序列的同源区域。在套装(suite)中的所有搜索程序中，空位比对例程是数据库搜索本身不可或缺的部分。根据需要，可以关闭添加空位(gapping)。蛋白和BLASTP的用于长度为1的空位的默认罚分(Q)是Q＝9，并且BLASTN的用于长度为1的空位的默认罚分(Q)是Q＝10，但可以更改为任何整数。蛋白和BLASTP的用于使空位延伸的默认每残基罚分(R)是R＝2，并且BLASTN的用于使空位延伸的默认每残基罚分(R)是R＝10，但是可以改变为任何整数。可以使用Q和R值的任何组合来比对序列，以便使重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化。默认氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但也可以利用其他氨基酸比较矩阵，诸如PAM。
如本文使用的术语“多核苷酸序列”或“核酸”包括编码肽或融合蛋白(或多肽)的任何多核苷酸序列，包括RNA形式的多核苷酸，诸如mRNA，或者DNA形式的多核苷酸，包括例如通过克隆获得的或通过化学合成技术或通过它们的组合产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链的或单链的。单链DNA可以是编码链(也称为有义链)，也可以是非编码链(也称为反义链)。编码肽或融合蛋白或者编码其治疗有效变体的多核苷酸序列可以与内源编码序列的编码序列基本上相同，只要它编码免疫原性活性肽或融合蛋白。此外，肽或融合蛋白可以使用由于遗传密码的简并性或等位基因变异而导致在密码子使用上不同的多核苷酸序列来表达。此外，本公开内容的肽和融合蛋白以及编码它们的核酸包括包含另外取代(保守或非保守的取代)的肽/蛋白和核酸变体。
例如，免疫原性肽变体包括，但不限于，这样的变体：与本文公开的序列不完全相同，但是除了对本文列出的各种序列明确描述的取代之外，还具有基本上不损害本文描述的变体的活性或性质的氨基酸残基的另外取代(保守或非保守的)。这样的保守氨基酸取代的实例包括，但不限于：ala取代为gly、ser或thr；arg取代为gln、his或lys；asn取代为asp、gln、his、lys、ser或thr；asp取代为asn或glu；cys取代为ser；gln取代为arg、asn、glu、his、lys或met；glu取代为asp、gln或lys；gly取代为pro或ala；his取代为arg、asn、gln或tyr；ile取代为leu、met或val；leu取代为ile、met、phe或val；lys取代为arg、asn、gln或glu；met取代为gln、ile、leu或val；phe取代为leu、met、trp或tyr；ser取代为ala、asn、met或thr；thr取代为ala、asn、ser或met；trp取代为phe或tyr；tyr取代为his、phe或trp；以及val取代为ile、leu或met。本领域普通技术人员将容易地知道如何制备、鉴定、选择或测试这样的变体针对一种或更多种致病生物体的免疫原性活性。
术语“感染”、“转导”和“转染”在本文可互换使用，并且是指将基因、核酸或多核苷酸序列引入细胞，使得编码的蛋白产物表达。本公开内容的多核苷酸可以包含另外的序列，诸如相同转录单元内的另外的编码序列，控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、多腺苷酸化位点，相同或不同启动子控制下的另外的转录单元，允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及可能期望提供本公开内容的实施方案的任何这样的构建体。
在某些实施方案中，本公开内容包括能够表达本文描述的一种或更多种融合多肽的表达载体。不同细胞类型的表达载体是本领域熟知的并且可以被选择，而无需过度实验。通常，编码融合多肽的DNA以适当的取向和正确的表达阅读框***表达载体中，诸如(但不限于)质粒中。如果需要，可以将DNA连接至由期望的宿主识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。载体然后通过标准技术引入宿主。指导可以在，例如，Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY 2001))中找到。
疫苗中包含的每种肽的最佳量和最佳给药方案可以由本领域技术人员确定，而不需要过度实验。例如(但不通过限制的方式)，肽或其变体可以制备用于静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射。特别的，非限制性的DNA注射途径是：i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.。肽可以是基本上纯的或与一种或更多种免疫刺激佐剂(如本文其他地方描述的)组合，或者与免疫刺激细胞因子组合使用，或者与合适的递送***诸如(但不限于)脂质体一起施用。佐剂是非特异性增强或加强免疫反应(例如，由CTL和辅助-T(TH)细胞介导的对抗原的免疫反应)的物质，并且因此被认为可用于本公开内容的组合物(用作疫苗时)中。合适的佐剂包括，但不限于：1018ISS，铝盐，诸如但不限于明矾(硫酸铝钾)、氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、Mologen的dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、干扰素-α或干扰素-β、IS Patch、ISS、ISCOM、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A和其他无毒LPS衍生物、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50\1、Montanide ISA-51、OK-432和OM-174。
其他药学上合适的佐剂的非限制性实例包括无毒脂质A相关的佐剂，诸如，通过非限制性实例的方式，无毒单磷酰脂质A(参见，例如，Persing等人，Trends Microbial.10:s32-s37(2002))，例如，3De-0-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见，例如，英国专利申请第GB2220211号)。其他有用的佐剂包括QS21和QuilA，其包含从南美洲发现的Quillajasaponaria Molina树的树皮中分离的三萜苷或皂苷(例如，参见Kensil等人，于VaccineDesign：The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell和Newman,Plenum Press,NY,1995)中；以及美国专利第5,057,540号)。其他合适佐剂的非限制性实例包括聚合或单体氨基酸，诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸、脂质体和CpG(参见，例如，Klinman(Int.Rev.Immunol.(2006)25(3-4):135-54)和美国专利第7,402,572号。可以用于本文公开的组合物中的佐剂的其他实例包括，但不限于，美国专利第8,8955,14号中公开的那些。
细胞毒性T细胞(CTL)识别呈与MHC分子(例如I类或II类)结合的肽的形式的抗原，而不识别完整的外来抗原本身。MHC分子本身位于抗原呈递细胞(APC)的细胞表面。因此，仅在肽抗原、MHC分子和APC的三聚复合体存在时，CTL的激活才是可能的。对应地，本公开内容的某些实施方案包括含有这样的APC的组合物，所述APC具有通过MHC分子呈递在其上的肽。
在其他实施方案中，组合物可以包括作为框架形成物的糖、糖醇、氨基酸诸如甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和其他。糖可以是单糖、二糖或三糖。这些糖可以单独使用以及与糖醇组合。糖的非限制性实例包括：作为单糖的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或山梨糖；作为二糖的蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖；和作为三糖的棉子糖。糖醇可以是，例如(但不通过限制的方式)，甘露醇和/或山梨醇。此外，组合物可以包括生理上耐受良好的赋形剂，诸如(但不限于)抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；防腐剂，诸如苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、硫柳汞(thiomersal)(硫柳汞(thimerosal))或苯扎氯铵；和增溶剂，诸如聚乙二醇(PEG)，例如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 6000，或者环糊精，例如羟丙基-环糊精、磺丁基乙基-环糊精或γ-环糊精，或右旋糖酐或泊洛沙姆，例如泊洛沙姆407、泊洛沙姆188，吐温20或吐温80。
在其他实施方案中，本公开内容包括一种试剂盒，所述试剂盒包括(a)容器，该容器包含溶液或冻干形式的一种或更多种如本文描述的药物组合物；(b)任选地，第二容器，该第二容器包含用于冻干制剂的稀释剂或重构溶液；和(c)任选地，关于(i)溶液的使用或(ii)冻干制剂的重构和/或使用的说明。试剂盒还可以包括以下中的一种或更多种：(iii)缓冲液、(iv)稀释剂、(v)过滤器、(vi)针，或(vii)注射器。容器是(特别地，非限制性实施方案)瓶、小瓶、注射器或试管；并且它可以是多用途容器。容器可以由许多种材料诸如(但不限于)玻璃或塑料形成。试剂盒和/或容器可以包含在容器上或与容器关联的说明，该说明指示关于重构和/或使用的指导。例如，标签可以指示冻干制剂待被重构为如上文描述的肽浓度。标签还可以指示制剂可用于或意图用于皮下或肌肉内施用。容纳制剂的容器可以是多用途小瓶，允许重构制剂的重复施用(例如，2-6次施用)。试剂盒还可以包括含有合适稀释剂(例如，碳酸氢钠溶液)的第二容器。试剂盒还可以包括从商业和用户角度来看期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明的包装***物。
与免疫原性肽(以及与融合多肽、二聚肽、全长或成熟蛋白或者表达蛋白的细菌)特异性结合的抗体可以属于任何免疫球蛋白类别，例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA。为了表征本文描述的免疫原性肽和融合多肽，可能期望使用多克隆和/或单克隆抗体。抗体可以从动物获得或来源于动物，例如，家禽(例如，鸡)和哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、毛丝鼠、仓鼠、兔、其他啮齿动物、牛、马、绵羊、山羊、骆驼、人类或其他灵长类动物。如本文描述的，多克隆抗血清通过用包含一种免疫原性肽、多于一种免疫原性肽、一种融合多肽或多于一种融合多肽的免疫原性组合物对动物进行免疫接种而从动物获得。
与如本文描述的免疫原性肽或融合多肽结合的抗体的水平可以使用本领域普通技术人员常规实践的任何一种或更多种免疫测定容易地确定。通过非限制性实例的方式，免疫测定包括ELISA、免疫印迹、放射免疫测定、免疫组织化学和荧光激活细胞分选(FACS)。
可以用免疫原性肽、融合多肽或包含它们的免疫原性组合物中的任何一种或更多种免疫接种的非人类动物包括，通过非限制性实例的方式：小鼠、大鼠、兔、仓鼠、雪貂、犬、猫、骆驼、绵羊、牛、猪、马、山羊、鸡、美洲驼和非人类灵长类动物(例如，食蟹猴、黑猩猩、恒河猴、猩猩和狒狒)。通常用于非人类动物免疫接种的佐剂包括，但不限于，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、montanide ISA、Ribi佐剂***(RAS)(GlaxoSmithKline,Hamilton,Mont.)，以及硝酸纤维素吸附抗原。通常，在第一次注射之后，受试者根据特定(但非限制性)方案接受一次或更多次加强免疫接种，所述方案尤其可以根据免疫原、佐剂(如果有的话)和/或特定受试者物种而变化。
在动物受试者中，免疫反应可以通过以下来监测：定期给动物放血，从收集的血液中分离血清，并且在免疫测定诸如(但不限于)ELISA中分析血清，以确定特异性抗体滴度。当建立了足够的抗体滴度时，可以定期对动物受试者放血以积累多克隆抗血清。然后，如本领域普通技术人员所理解的，与免疫原特异性结合的多克隆抗体可以例如通过使用固定在合适的固体支持物上的蛋白A或蛋白G的亲和层析从免疫抗血清中纯化。可以进行亲和层析，其中对特定免疫接种的动物受试者的Ig恒定区有特异性的抗体被固定在合适的固体支持物上。亲和层析还可以包括使用一种或更多种免疫原性肽或融合蛋白，它们可用于通过多克隆抗体与特定免疫原性肽的结合活性来分离多克隆抗体。与免疫原性肽和/或融合蛋白特异性结合的单克隆抗体，以及产生具有所期望的结合特异性的单克隆抗体的永生真核细胞系(例如，杂交瘤)，也可以使用例如Kohler和Milstein((Nature,256:495-97(1976)；以及Eur.J.Immunol.6:511-19(1975))的技术及其改进形式来制备。
本文描述的免疫原性组合物可以通过将多于一种免疫原性肽和/或多于一种融合多肽和/或连接免疫原性肽的运载体分子与至少一种药学上可接受的赋形剂组合来配制。如本文描述的，免疫原性组合物还可以包含药学上合适的佐剂。通常，意图被施用至受试者的所有免疫原性肽或所有融合多肽被组合在单一免疫原性组合物中，该单一免疫原性组合物可以包含至少一种药学上可接受的赋形剂并且还可以包含至少一种药学上合适的佐剂。可选地，例如，多种免疫原性组合物可以单独配制以用于单独施用，所述施用可以通过本文描述的任何途径或本领域已知的其他方式并且可以是顺序的或并行的。
本文描述的免疫原性组合物可以配制成无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液或乳液，如本文描述的免疫原性组合物还可以包含生理学上可接受的赋形剂(也可以称为运载体)和/或稀释剂。免疫原性组合物可以是固体、液体或气体(气雾剂)的形式。可选地，本文描述的免疫原性组合物可以配制成冻干剂(lyophilate)(即冻干组合物)，或者可以使用本领域熟知的技术封装在脂质体内。如本文其他地方指示的，免疫原性组合物还可以包含其他组分，所述其他组分可以是生物活性的或无活性的。这样的组分包括，但不限于，缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)、甘露醇、蛋白(诸如白蛋白)、多肽或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽、稳定剂、染料、调味剂、悬浮剂和/或防腐剂。通常，如本文讨论的，赋形剂的类型基于施用模式进行选择。本文描述的组合物和制剂可以配制成用于任何适当的施用方式，包括，例如(但不通过限制的方式)：局部、含服、舌、口服、鼻内、鞘内、直肠、***、眼内、结膜下、经皮、舌下或胃肠外施用。
剂量大小通常可以根据本领域公认的实践来确定。剂量可以取决于被治疗受试者的身体质量、重量或血容量。通常，剂量中存在的如本文描述的一种或更多种免疫原性肽、一种或更多种融合多肽和/或一种或更多种运载体分子组合物的量在例如(但不限于)约1μg至约100mg、约10μg至约50mg、约50μg至约10mg的范围内，并且包括用于5-50kg受试者的适当剂量。加强免疫接种可以以期望的时间间隔(例如，范围为约2周至约26周)，诸如约2周、4周、8周、12周、16周或26周的间隔施用多次(例如，两次、三次、四次或更多次)。不同剂量之间(例如，第一剂量与第二剂量之间，或者第二剂量与第三剂量之间)的时间间隔可以不同，并且每两个剂量之间的时间间隔可以独立地确定。本公开内容的肽或融合多肽的治疗有效量的非限制性实施方案通常包含足以递送约0.1μg/kg至约100mg/kg(活性物质重量/受试者体重)的活性物质。特别地，组合物递送约0.5μg/kg至约50mg/kg，并且更特别地约1μg/kg至约10mg/kg。
在某些实施方案中，本公开内容涉及包含至少一种或两种或三种或四种或五种或更多种(例如，6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种)不同的肽和药学上可接受的运载体的肽组合物，所述肽具有表1、表3或表4中示出的肽的组中列出的氨基酸序列和/或其变体氨基酸序列，所述变体氨基酸序列与给定组中的所述一种或更多种肽具有至少80％，或至少81％，或至少82％，或至少83％，或至少84％，或至少85％，或至少86％，或至少87％，或至少88％，或至少89％，或至少90％，或至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％同一性。
肽可以是串接的(concatenated)(串联缀合(在肽之间有或没有接头序列)以形成一种或更多种融合多肽)，或者与一种或更多种运载体分子缀合，如下文进一步详细描述的。例如，肽可以与合适的运载体分子缀合或以其他方式偶联，所述运载体分子诸如，但不限于，破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白、CRM197蛋白、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)外膜复合物、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D、百日咳毒素突变体、匙孔
Figure BDA0003115139500000201
血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白和/或牛血清白蛋白(BSA)。可以使用的运载体蛋白的其他实例包括，但不限于，美国专利申请公布2013/0072881、2013/0209503和2013/0337006中公开的那些。
在某些实施方案中，一种或更多种免疫原性肽包括单一融合多肽或被包含在单一融合多肽中，或者与一种或更多种运载体分子偶联。除了包含第一融合多肽的组合物之外，可以任选地在单独的融合多肽或运载体分子中提供另外的肽。在一种特定实施方案中，融合多肽或运载体分子包含至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种免疫原性肽，其中至少5种彼此不同。免疫原性肽在融合多肽上的连接顺序可以由本领域普通技术人员使用本文描述的并在本领域中常规实践的方法和技术容易地确定，并且因此顺序不需要过度的经验、试验和误差分析来确保每种融合多肽的免疫原性的优化。在某些实施方案中，融合多肽的氨基末端处的免疫原性肽在融合多肽羧基末端处是重复的(即加倍的)。形成这样的融合多肽(融合蛋白)的方法是本领域普通技术人员已知的；因此，认为没有必要在本文中包括对其的详细讨论。然而，用于形成融合多肽的非限制性示例性方法示于美国专利第8,697,085号中，该专利的全部内容在此通过引用明确并入本文。
在其他实施方案中，公开了本质上异源的免疫原性多肽。异源意指由具有来源于同一蛋白上不同基因座的肽区域的序列和/或来源于同一菌株、物种或生物体中的不同蛋白的序列的肽构成。
通过参考以下实施例和描述，将更容易地理解本公开内容的实施方案，如上文指示的，包括这些实施例和描述仅仅是为了说明本公开内容的某些方面和实施方案的目的，并且不意图是限制性的。以下详细描述的实施例和方法描述了如何制备和使用本公开内容的各种肽、融合蛋白和肽连接的免疫原性载体分子，并且如上文指示的，应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容。本领域的技术人员将很快认识到本文描述的材料和程序的适当变化形式。
如本文描述的，递送作为融合多肽的细胞外/表面暴露的序列保守的肽的方法具有超过其他疫苗方法的若干优点。首先，疫苗仅包含对保护有用的表位，而不是由许多可能对保护没有贡献的区域组成的完整蛋白。第二，这些疫苗在同时使用实用的递送***时靶向许多蛋白。例如，如本文描述的针对百日咳鲍特菌、Bp Poly 1和Bp Poly 3测试的两种多肽分别靶向21个表位(来自13种蛋白)和30个表位(来自12种蛋白)。这对于保护有效性(大量靶)和防止选择出遗传上从疫苗逃逸的突变体二者可能都是重要的。
单独的肽太小以至于不具有可靠的免疫原性。相比之下，多肽是有免疫原性的。这与将肽附接至运载体蛋白是在功能上相似的，只是融合肽发挥自身-运载体(self-carriers)的功能。此外，制造线性多肽简单且不昂贵。
实施例
实施例1：抗原的设计
推定疫苗组分在跨越所靶向的生物体的所有分离株中的存在和保守性是开发成功疫苗的先决条件。因此，寻找了用于预防疾病诸如百日咳鲍特菌感染的保守抗原靶。最初，多种生物信息学分析工具可以用于基本上如先前关于流感嗜血杆菌所描述地(Whitby等人2015,PLoS One e0136867)鉴定百日咳鲍特菌菌株Tohama的推定表面暴露蛋白(SEP)的互补序列。在鉴定了菌株Tohama的SEP互补序列后，人们可以然后使用基本局部比对搜索工具(BLAST；可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得)来鉴定公共数据库中可获得的所有经完全测序的百日咳鲍特菌分离株中每种SEP的存在或不存在。以这种方式，鉴定了跨越所有百日咳鲍特菌菌株保守的所有SEP。
已鉴定的百日咳鲍特菌的保守SEP使用可通过蛋白模型门户(protein modelportal)(www.proteinmodelportal.org/)获得的建模算法进行单独检查，以确定与其他已知的结构明确的蛋白的同源性。生成的结构使用Chimera进行比较和可视化，以鉴定潜在的表面暴露区域。
从生成的蛋白模型中，选择长度大于25个氨基酸的预测的表面暴露区域。对每个核心蛋白进行多重序列比对。使用每个单独SEP的所有可得百日咳鲍特菌蛋白序列进行这些比对；比对用于确认每个预测的表面暴露区域的序列保守性。选择具有跨越物种在氨基酸水平100％的保守性的表面暴露区域作为潜在肽抗原用于进一步检查。
这些保守的表面暴露肽的子集被顺序连接以产生三个单独多肽。连接通过合成人工DNA片段(Thermo Fisher Scientific)来实现，该人工DNA片段按顺序编码每个选择的肽，其中第一个肽在末端重复。将人工DNA片段***表达载体pET100以允许所编码多肽的诱导型表达，并且另外地掺入多组氨酸标签以促进所表达多肽的金属亲和纯化。
如本文使用的，多肽“BpPoly1”包括来自13种百日咳鲍特菌蛋白的21种独特的肽，并且具有99-kDa的理论分子量。同样如本文使用的，多肽“BpPoly3”包含来源于12种蛋白的30种独特的肽并且分子量为99-kDa。
多肽的纯化
将编码多肽的质粒构建体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21 Star(DE3)中。使大肠杆菌培养物伴随摇动生长至在600nm处的OD为0.5-0.7，在该OD处它们通过添加1mM IPTG被诱导。IPTG添加后，培养物伴随摇动孵育4hr，在该点将细胞通过离心回收并且冷冻用于随后的纯化程序。
将解冻的细胞沉淀重悬在包含200μg/ml溶菌酶和50单位/ml benzonase的CelLyticB(10ml/克细胞)中，并且在RT孵育1hr。在以16,000g离心15分钟后，将沉淀重悬在胍裂解缓冲液中，在RT摇动1hr。在第二次相同的离心后，保存上清液用于施加至平衡的Ni纯化柱。与Ni柱结合的多肽在三次洗涤后通过标准方案洗脱，并且收集1ml级分。经纯化的多肽的纯度通过SDS-PAGE评估，并且具有纯度>90％的级分被选择用于下游使用。
小鼠的免疫接种
12只或24只未治疗的
Figure BDA0003115139500000221
雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)的组在第0天、第14天和第28天用10μg与明矾佐剂(AdjuPhos；Invivogen)结合的经纯化的多肽和2μg单磷酰基脂质A(MPLA；Sigma)进行肌肉内免疫接种。对照组仅用AdjuPhos和MPLA免疫接种。在每次免疫接种前和最终免疫接种后20天，给小鼠放血以获得血清，用于通过ELISA确定抗体滴度。
小鼠的感染
在第49天，将轻度麻醉的小鼠用20μl PBS中的大约3,000CFU的百日咳鲍特菌菌株Tohama进行鼻内攻击。在感染后的第3天和第7天的每一天，使来自12只小鼠的队列中的6只小鼠安乐死。对于24只小鼠的队列，在感染后第3天、第7天、第10天和第14天的每一天使6只小鼠安乐死。从所有安乐死的小鼠中无菌切离肺和气管，在PBS中进行匀浆，并且进行铺板来对存在的总细菌进行计数。
统计学
各组之间的肺中总细菌计数使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行比较。参见图1-3。在12只小鼠中分析每种Bp多肽的免疫原性，以定量与经纯化的多肽结合的抗体的血清滴度。每只小鼠针对每种Bp多肽的抗Bp多肽抗体滴度增加，展示每种Bp在每只小鼠中都是有免疫原性的(参见下文表1和表2)。Bp Poly1免疫接种后的抗体滴度范围为1/200-1/51,200，并且Bp Poly3免疫接种后的抗体滴度范围为1/12,800-1/204,800。免疫前血清的ELISA信号与背景相似。
表1：小鼠用10μg Bp Poly1免疫接种后的ELISA滴度
Figure BDA0003115139500000231
表2：小鼠用10μg Bp Poly3免疫接种后的ELISA滴度
Figure BDA0003115139500000241
实施例2：转录水平(mRNA)作为用于百日咳鲍特菌的细菌疫苗多肽(BVP)的肽选择 标准。
在我们的最初研究中，靶向百日咳鲍特菌的推定疫苗肽基于以下标准来选择：1)使用可得的百日咳鲍特菌基因组鉴定表面暴露蛋白(SEP)的物种保守核心(speciesconserved core)。这些包括包埋在外膜中的分泌蛋白和表面暴露蛋白，以及位于周质间隙中的蛋白，因为后者在表面和周质二者中都可变地表达；2)基于每个蛋白的多序列比对分析的序列保守性；3)基于计算机建模的核心蛋白的表面暴露，所述计算机建模确定三维结构和潜在的表面暴露残基。使用这些标准，已经鉴定了百日咳鲍特菌的长度≥20个氨基酸残基的大约150种肽的池(pool)。先前用肽的随机组合从这些中设计了单个细菌疫苗多肽(BVP)。该BVP(Bp Poly 1)在小鼠肺模型中显示出显著的保护性(数据未示出)。
为了进一步完善肽的选择，我们研究了全RNA转录组研究中基因特异性mRNA的相对丰度，以确定通常与细菌中产生的蛋白数量相关的高水平转录是否可以是鉴定保护性靶的有用标准。这样的方法具有若干优点。公共数据库包含许多病原体的转录组研究。随着RNA-seq的出现，数据是高质量的并且准确地反映了总RNA谱。RNA-seq也允许小样品尺寸，这与需要较大数量的起始细菌的旧微阵列数据不同。因此，现在存在多种定量转录数据来源，提高了可能重要的疫苗肽标准的可用性。为了研究这一标准，我们使用具有以上标准并且来源于具有低水平转录的基因的肽设计了多肽(Bp Poly 100)。我们还使用具有以上标准并且来源于具有高水平转录的基因的肽设计了多肽(Bp Poly 101)。每种多肽进行了纯化，并且它们的保护能力在百日咳小鼠模型中进行比较。
Bp Poly 100和Bp Poly 101的设计
为了测试转录水平是否可用于选择保护性肽，基于通过定量mRNA指示的转录组数据，使用疫苗肽选择优先化的最后步骤设计了Bp Poly 100和Bp Poly 101。我们使用公众可从de Gouw等人获得的数据与百日咳鲍特菌转录组的相对mRNA丰度来分析所鉴定的每种蛋白的个体相对丰度。基于de Gouw等人的数据，使用我们定义的SEP基因核心，确定每个的个体相对丰度(RA)。排除了商购可得百日咳鲍特菌疫苗中的蛋白。将来自具有最低的mRNARA(数值范围29-374)的蛋白的肽掺入到Bp Poly 100中。将来自具有最高的mRNA RA(数值范围11,819-47,656)的蛋白的肽掺入到Bp 101中(参见图6和图7)。如由de Gouw等人确定的，mRNA的RA的整个范围是0至最大程度地表达的分泌蛋白ptxA的52,549。编码Bp Poly100和Bp Poly 101的DNA被独立地掺入到pET100表达载体中，处于His标签下游以促进纯化。每个多肽通过标准镍亲和层析纯化。
Bp Poly 100对比Bp Poly 101的保护
Bp Poly 100对比Bp Poly 101在百日咳小鼠模型中的保护的测试按照本领域中先前建立的方法进行。三组中的每只小鼠每次免疫接种接受单独的佐剂(明矾+mPLA)，佐剂与10μg Bp Poly 100，或佐剂与10μg Bp Poly 101。免疫接种在T-0周、T-2周和T-4周进行。三周后，动物通过20uL PBS中的7.9E+03CFU的百日咳鲍特菌Tohama I菌株的鼻吸入来感染。在感染之后的第3天、第7天和第10天，将一个子组的动物处死，并且定量培养经匀浆的肺。
结果
Bp Poly 101(高水平转录)比Bp Poly 100(低水平转录)更具保护性。
为了测试mRNA转录物的数量是否可用于选择其中的肽纳入BVP中，设计并比较了两个BVP。Bp Poly 100由具有低水平mRNA的基因编码的蛋白中的肽组成，并且Bp Poly 101由具有高水平mRNA的基因编码的蛋白中的肽组成。在百日咳小鼠模型中比较了保护。图7示出了在感染之后的第3天、第7天和第10天时经匀浆的小鼠肺的定量培养物的结果。表格示出了由数据统计分析得出的p值。
表3.来自实验时间段内对照、Bp Poly 100和Bp Poly 101组的定量培养物的统计学意义。三个实验条件之间的P值通过Wilcoxon-Mann-Whitney检验确定。
天 Bp Poly 100对比对照 Bp Poly 101对比对照 Bp Poly 101对比Bp Poly 100
第3天 0.92 0.15 0.016
第7天 0.48 0.034 0.013
第10天 0.90 0.01 0.002
来自接受Bp Poly 100的组的细菌数量与对照组相比之间在每一天都不存在显著差异。相比之下，在第10天和第14天，从接受Bp Poly 101的组中分离的细菌数目比从对照组中分离的细菌数目显著更少。类似地，在第3天、第10天和第14天，与接受Bp Poly 100的组相比，从接受Bp Poly 101的组中分离的细菌数目显著更少。
结论
数据显示，Bp Poly 101(由来自具有高水平转录的基因编码的蛋白的肽组成)在每个时间点都显示出比对照组(单独的佐剂)或Hi Poly 100(由来自具有低水平转录的基因编码的蛋白的肽组成)显著更好的保护。先前的工作表明，蛋白中的肽存在于整个物种中，是序列保守的并且基于计算机是表面暴露的。
实施例3：针对Hi Poly 1的抗血清与代表物种的流感嗜血杆菌菌株结合。
我们已经提出了细菌疫苗多肽(BVP)方法，该方法基于存在于物种中的所有菌株中、序列保守并且基于计算机蛋白结构分析为表面暴露的肽的选择。使用流感嗜血杆菌，我们选择了在菌血症幼龄大鼠模型中是个体保护性的肽的子组。为了增强免疫原性，肽以连接在多肽中的形式存在。
由于多靶向设计，预期多肽会刺激抗体与物种中的每一种菌株结合。为了根据经验分析抗体的结合范围，我们在活细胞ELISA中使用了先前被表征为代表物种宽度(breadth of the species)的菌株。
材料和方法
流感嗜血杆菌菌株。Musser等人先前通过多基因座酶电泳表征了大量流感嗜血杆菌菌株的遗传学。我们测试了代表物种遗传宽度的9种Musser菌株。这些从患有OM的儿童中分离出的不可分型(nontypable)菌株是HI1371、HI1375、HI1380、HI1387、HI1392、HI1397、HI1403、HI1417和HI1425。我们还测试了两种有荚膜的b型菌株E1A和HI0693。
细菌生长。分离株常规维持在37℃在具有杆菌肽的巧克力琼脂上。流感嗜血杆菌的肉汤培养物在补充有10μg/ml血红素和10μg/mlβ-NAD的脑心浸液(BHI)琼脂(补充的BHI；sBHI)中生长。
抗HI Poly 1抗血清的产生。Hi Poly 1通过镍层析纯化，并且吸附至明矾(1:1)，并且用作免疫原以在大鼠中产生抗血清。在免疫接种前，从每只动物中获取血液(免疫前血清，PIS)。将三个剂量的Hi Poly 1以2周的间隔施用，并且抗BVP Hi Poly 1免疫后血清(BVPS)在最终免疫接种之后3周收集。血清样品被热灭活并储存在-80℃。
活细胞ELISA。在全细胞ELISA中使用流感嗜血杆菌活培养物。将过夜细菌悬浮液稀释以给出0.05的OD600，并且将100μl添加至Corning高结合96孔板的孔中。将板轻轻离心，并且允许细菌在4℃粘附4hr。孵育后，吸出上清液，并且将粘附的细菌洗涤并与作为一级抗体的大鼠免疫前血清(PIS)或免疫后血清(BVPS)一起孵育。按照制造商的指导，一级抗体的粘附用HRP缀合的山羊抗大鼠抗血清进行检测。结合的二级抗体通过添加100μl TMB定量，并且板在A450处进行读取。每个测定以一式三份进行并且对值进行取平均值。
统计学。由每种分离株的匹配的免疫前血清和免疫后血清产生的平均吸光度值使用学生T检验进行比较。
结果
结果(图8)显示，由免疫前血清中的抗体结合产生的吸光度范围为0.20至0.75。由免疫后抗血清中的抗体结合产生的吸光度范围为0.375至1.658。对于所检查的12种HI分离株中的每一种，使用免疫后抗血清(BVPS)的结果大于使用匹配的免疫前血清(PIS)的结果。对于每种菌株，PIS吸光度与BVPS吸光度之间的差异是统计学显著的(p<0.05)。
结论
BVP方法提出，连接的肽可用于递送具有重要疫苗特征的经特别鉴别的肽，所述重要疫苗特征包括跨越物种的存在、序列保守性和基于计算机蛋白结构分析的表面暴露。对诱导被动(抗体)保护的肽的鉴定提供了可以根据经验检验这样的假设的机会，该假设为连接的肽会诱导出与代表物种的菌株结合的抗体。我们的数据展示免疫后抗Hi Poly 1抗血清中的结合显著更大，这支持了该假设。免疫后抗血清与有荚膜的b型菌株的显著更大结合的存在增加了Hi Poly 1作为针对b型菌株和不可分型流感嗜血杆菌二者有保护的疫苗的引人入胜的可能性。这些数据支持细菌疫苗多肽方法的效用，并且支持Hi Poly 1作为疫苗候选物。
实施例3：制备针对不可分型流感嗜血杆菌有保护性的细菌疫苗多肽的方法。
NTHi仍然是重大的公共卫生负担并且也是疫苗开发的适当靶。
已经提出了各种NTHi表面蛋白作为疫苗候选物。这些蛋白中的一种是蛋白D，在临床试验中进行了测试，并且发现在预防NTHi OM方面有大约35％有效性，并且在欧洲商购可得。除了其相对低的有效性之外，蛋白D也不存在于NTHi的每一种临床分离株中。因此，应考虑其他NTHi疫苗方法，包括使用多靶的方法。
作为以全长蛋白作为疫苗的替代方案，我们提出了一种新方法，该方法整合了基因组生物信息学和计算机结构预测来映射NTHi的表面，以鉴定由多个基因组基因座编码的蛋白的序列保守的表面暴露区域(肽)。被动保护的证据用作确认表面暴露和抗体可及性(antibody accessibility)的进一步选择标准。
不幸的是，先前使用肽作为细菌疫苗的努力并不成功。在疫苗中使用肽的一个常见障碍是缺乏序列保守性，例如菌毛疫苗(pili vaccines)。因此，菌毛肽疫苗针对同源菌株有效，而针对具有非同源菌毛的同一物种的菌株无效。除了提出的肽疫苗中缺乏序列保守性之外，肽的小尺寸与较低的免疫原性相关。最小的商购可得疫苗是24KDa乙肝表面抗原(HBsAG)，并且在临床前研究中，较小的肽通常连接至运载体以获得免疫原性。
为了解决这些问题，我们假设由来自多个基因组基因座的连接的序列保守的表面暴露肽组成的BVP在已建立的中耳炎动物模型中会是有免疫原性的和生物学有效的。因此，我们由显示出个体生物学有效的肽设计了NTHi疫苗多肽Hi Poly 1，并且我们测试了HiPoly 1在菌血症幼龄大鼠模型中的免疫原性、保护以及在OM毛丝鼠(长尾毛丝鼠(Chinchilla lanigera))模型中的有效性。
材料和方法.
细菌菌株和生长条件
NTHi株R2866从在OM后具有脑膜炎的临床迹象的有免疫活性的儿童的血液中分离，并且被Arnold Smith表征。我们先前在侵入性流感嗜血杆菌病的幼龄大鼠模型中利用了这种菌株。用于中耳炎毛丝鼠(长尾毛丝鼠)模型的NTHi菌株86-028NP是经最少代次传代(minimally passaged)的临床分离株，该分离株来自在哥伦布儿童医院(ColumbusChildren’s Hospital)经历用于慢性中耳炎的鼓室造孔术和管***的儿科患者。菌株86-028NP已在OM毛丝鼠模型中广泛表征。我们和其他人先前在许多关于毛丝鼠中的NTHi毒力的研究中使用这种分离株。流感嗜血杆菌的分离株常规维持在37℃在具有杆菌肽的巧克力琼脂上。流感嗜血杆菌的肉汤培养物在补充有10μg/ml血红素和10μg/mlβ-NAD的脑心浸液(BHI)琼脂(补充的BHI；sBHI)中生长。
大肠杆菌分离株BL21(De3)常规维持在LB琼脂上，并且用质粒pHiPoly1转化的分离株维持在补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂上。
Hi Poly 1设计
我们先前报道了基于以下选择某些NTHi候选疫苗肽(包括Hel1、HxuC1、HxuC2和Hel2)的方法：它们1)在每个被检查基因组中的存在；2)基于结构分析的表面暴露；3)序列保守性；和4)诱导在菌血症幼龄大鼠模型中有保护性的抗体。按照同样的方法，我们鉴定了在菌血症幼龄大鼠模型中显示保护的其他肽候选物(数据未示出)，包括NucA-1、BamA-3、Lpte-2、Lpte-4和NlpI-2。细菌疫苗多肽Hi Poly 1被设计为9个肽的顺序组装，其中每个末端处具有肽BamA-3以增强免疫处理，并且在N末端处有6His标签(图9)。
Hi Poly 1纯化
表达载体由Invitrogen商业制造以表达Hi Poly 1多肽。编码构建体的DNA被优化用于大肠杆菌，合成，并且确认正确序列，然后***到pET100表达载体中处于His-标签下游。质粒构建体(pHiPoly1)转化到大肠杆菌BL21(De3)中，并且转化体在补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂上选择，并且经转化的菌株储存在-80℃。进一步检查选择的转化体，以确保***正确的DNA序列。将包含pHiPoly1的大肠杆菌接种到除了羧苄青霉素之外还补充有1％葡萄糖的LB肉汤中，并且在37℃生长至大约0.5-0的在A600处的光密度。pHiPoly1的表达通过添加IPTG至1mM持续4小时来诱导。细菌沉淀通过以4500rpm离心15分钟制备，并且检查了沉淀的细菌疫苗多肽相对于未诱导的阴性对照的表达。细胞级分的SDS-PAGE指示HiPoly 1表达为包涵体。包含Hi Poly 1包涵体的细菌沉淀在补充有Benzonase(50单位/ml最终)和溶菌酶(0.2mg/ml最终)(Sigma)的10ml Cell Lytic TM B缓冲液(Sigma)中裂解。在室温以轻轻摇动孵育1小时后，包涵体通过在4℃以16,000×g离心20分钟来沉淀。包含HiPoly 1多肽的沉淀溶解在6M盐酸胍、20mM磷酸钠pH 7.8和0.5M NaCl中，随后以16,000×g进一步离心以去除不溶性杂质。Hi Poly 1疫苗多肽的纯化如ProBondTM纯化***(Lifetechnologies)的方案所指导的，在变性条件下，通过预平衡的Ni+2亲和柱，使用His标签亲和完成。Hi Poly 1用结合缓冲液中的300mM咪唑从Ni+2柱洗脱，并且收集洗脱级分用于分析蛋白含量和纯度。经纯化的Hi Poly 1通过使混合物在室温以轻轻混合孵育2小时来吸附至AdjuPhos(1:1)。吸附的混合物在4℃针对PBS透析。Hi Poly 1对AdjuPhos的相对吸附通过测量经离心的制品的上清液的蛋白浓度来确定。明矾吸附的Hi Poly 1储存在4℃直至使用。
ELISA
ELISA按照各自制造商的特定方案进行。利用以N末端Cys残基合成的肽的肽ELISA在马来酰亚胺激活板(Pierce)中进行。特定肽以1mg/ml溶解在结合缓冲液中的20％二甲基甲酰胺、10％TCEP中，并且随后用结合缓冲液稀释至5μg/ml的浓度。将100微升的肽溶液添加至每个孔中，并且肽通过将板在4℃以轻轻摇动孵育过夜来固定。板通过添加200μl半胱氨酸溶液(10μg/ml)在室温持续1.5h来封闭。针对加his标签的Hi Poly1的ELISA在Corning高结合板中进行。疫苗多肽Hi Poly 1以20μg/ml的浓度溶解在4M尿素、0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6中。将100μl添加至每个孔中，并且将板在4℃孵育过夜以固定多肽。在每个ELISA中，毛丝鼠血清用作一级抗体，并且山羊抗大鼠HRP缀合的IgG用作二级抗体。结合的二级抗体通过添加100μl TMB检测并且板在A370处读取。确定的滴度是最终抗体稀释度，其中与免疫前血清相比，免疫后抗血清的吸光度大于0.1。
动物
动物研究根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行，并且得到亚利桑那州立大学(毛丝鼠研究)和亚利桑那大学(幼龄大鼠研究)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)的批准。
菌血症幼龄大鼠模型
如先前描述的，Hi Poly 1的保护在被动保护的幼龄大鼠模型中进行测试。来源于免疫接种的毛丝鼠的免疫接种前和免疫接种后血清样品用于对幼龄大鼠进行被动免疫接种。两日龄的幼崽随机分配至母兽，以给出三个队列，每个队列10只幼崽。在四日龄时，每个队列中的幼龄鼠(infants)不同地接受免疫前毛丝鼠血清、免疫后血清或作为对照的PBS的100μl IP注射。在5日龄时，每只幼崽通过50μl PBS中的大约1.5×105CFU NTHi菌株R2866的IP注射进行攻击。在攻击后24h，从每只动物收集血液用于定量铺板。
中耳炎毛丝鼠模型
为了测试Hi Poly 1在OM中的保护有效性，3月龄至5月龄的毛丝鼠(长尾毛丝鼠)购自Moulton Chinchilla Ranch。在开始研究前，动物在到达后休息至少7天以适应环境。如先前描述的，使用在研究开始后通过耳镜检查或鼓室测压没有中耳感染迹象的动物。进行初步实验以确定用Hi Poly1免疫接种毛丝鼠的最佳剂量。与明矾佐剂以1:1混合的经纯化的Hi Poly 1蛋白用于以10μg、50μg、100μg、200μg和400μg剂量对毛丝鼠队列(3只动物/队列)进行免疫接种。动物以两周的间隔免疫接种三次，并且血清样品在最后一次加强后三周获取。收集血清并且用于ELISA中，其中Hi Poly 1或单独肽作为抗原。Hi Poly 1是有免疫原性的，并且与免疫前血清相比，200μg的剂量诱导了针对多肽和所有单独肽的IgG的明显增加(数据未示出)。200μg/免疫接种的剂量用于保护研究中。
进行了两个免疫接种/保护毛丝鼠实验。在第一个实验中，队列由测试组和对照组中的18只动物组成；重复研究由对照组中的23只动物和疫苗组中的22只动物组成(疫苗队列最初包含23只动物；然而，在免疫接种阶段期间，由于非方案相关的健康问题，一只动物从研究中去除)。这两个实验的免疫接种、感染攻击和OM测试是相同的，并且数据被汇集在一起进行分析。
细菌攻击
将毛丝鼠队列以2周的间隔用200μg Hi Poly 1与明矾或PBS-明矾进行三次免疫接种。来自每只动物的免疫接种前和最后一次免疫接种后2周获取的样品的抗血清进行热灭活并储存在-80℃，直至通过ELISA检查抗体滴度并用于被动保护的幼龄大鼠模型中。最后一次免疫接种之后三周，每只毛丝鼠通过将细菌悬浮液直接注射到上泡(superiorbullae)中用300μl PBS-明胶(0.1％w/v)中的大约1500CFU的NTHi菌株86-028NP在双耳中进行攻击。攻击剂量通过板计数确认。
中耳炎迹象的检查
在直接感染前和攻击后第3天、第7天、第10天和第14天，通过视频耳镜检查和鼓室测压检查每只毛丝鼠的OM迹象；检查每个队列的子集的中耳积液(MEE)并且从研究中去除。如先前描述的，通过视频耳镜检查(Video VetScope System,MedRx,Seminole,FL,USA)对鼓膜炎症的迹象按0至4+等级进行评级。检查每只耳朵时，记录视频耳镜检查，并且根据可见红斑、鼓胀、鼓膜混浊的变化和鼓膜后积液的可视化分级为0-4。评分在≥2的个体耳朵被认为是OM阳性。记录的视频耳镜检查由第二个不知情的观察者进行评估。第一次评估与第二次评估之间的差异被不知情地解决，包括第三个不知情的观察者。如先前描述的，鼓室测压(EarScan,South Daytona,FL,USA)用于监测鼓膜宽度和鼓膜顺应性两者的变化。使用鼓室测压，鼓室图的顺应性或高度测量了鼓膜的阻抗，并且以等效体积的毫升数表示。超出0.75-1.5范围的异常顺应性被认为是OM的迹象。相似地，鼓室图的宽度和整体形状是OM的有用指示物，并且大于150daPa的鼓室宽度(TW)被认为是OM的迹象。MEE使用1.5英寸25号皮下针通过经泡叩刺(trans-bullar tap)从中耳腔抽取流体来收集。如果没有检测到MEE，同一只耳朵再被叩刺两次以确保MEE不存在。这样的耳朵被评分为“干燥的”。如先前描述的，MEE中的细菌滴度使用痕量稀释法确定。
统计学分析。汇集了在每个测量的时间点(感染后的天数)的每个结果的来自毛丝鼠实验1和实验2的数据。疫苗接种组与对照组之间每天的耳镜检查、鼓室测压和MEE存在的比例使用Fisher精确检验进行比较。疫苗接种组与对照组之间的定量测量，包括毛丝鼠中MEE的CFU/ml和幼龄大鼠模型中的血液，使用Kruskal-Wallis检验进行比较。灵敏度分析检查了干燥耳朵MEE，干燥耳朵MEE被算作0CFU/ml。MEE中的细菌滴度使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行分析。统计分析使用9.2版的SAS软件(SAS Institute Inc.,Cary,NorthCarolina)进行。所有的统计检验都是双侧的，其中显著性以5％水平进行评估。
结果：
Hi Poly 1
图1中示出了来自6种蛋白的9种独特肽的顺序排列。计算所得249个氨基酸的构建体具有27,724Da的理论分子量(与His标签一起为31,844)和9.57的pI(与His标签一起为9.71)。
亲和纯化之后，Hi Poly 1的纯度通过SDS-PAGE分析(图10)；单个蛋白条带与32KDa的理论MW相关。这种Hi Poly 1的制品以1:1吸附至Adju-Phos。
Hi Poly1疫苗多肽的免疫原性.
对照、免疫接种前血清和免疫接种后血清的抗原特异性IgG通过ELISA进行检查。抗体滴度表明，用Hi Poly 1免疫接种在40只动物中的每只中引起对多肽的强且可再现的免疫反应(log2滴度平均值为17.04)，而来自免疫接种前和对照动物的抗血清处于背景水平(log2滴度≤1.0)(图11)。使用Hi Poly 1作为免疫原，对每种组分肽的免疫反应是有意义的，其中log2滴度平均增加≥4，在4.03与15.27之间变化。在每个实验疫苗组中，最低的反应针对来自HxuC的两种肽。数只动物未能对一种和/或另一种HxuC肽引发可测量的免疫反应。在接受Hi Poly 1的40只动物中，其中13只和18只分别没有显示出对HxuC-1和HxuC-2的抗体滴度的显著增加。此外，10只动物不具有对LptE-4的抗体滴度的显著增加。相比之下，其他组分的滴度是高的，在11-15范围内。
针对菌血症的保护
为了研究Hi Poly 1在菌血症中的保护能力，将毛丝鼠免疫接种后抗血清与PBS和免疫接种前毛丝鼠血清进行比较，以确定幼龄大鼠中针对菌株NTHi 2866的被动保护(图12)。PBS与免疫前血清之间的保护不存在可检测到的差异。与PBS或免疫前血清相比，免疫后抗血清显著减轻菌血症(分别地，p＝0.018和0.0098)。
中耳炎中的保护
在最后一次免疫接种之后21天，毛丝鼠用300μl PBS中的NTHi 86-028NP经泡接种。接种物的定量计数确认在两个实验中大约1.4×103CFU被灌输到每个泡中。
鼓室图测量揭示了，在14天的实验中，与对照组相比，Hi Poly 1治疗组的OM阳性耳朵显著减少(图13)。在接种后第3天攻击之后的早期，对照动物耳朵的96％(82只中的79只)具有OM的临床迹象，而Hi Poly 1免疫接种的动物的89％(80只中的71只)具有OM。到第7天前，两个队列之间存在统计学显著差异；Hi Poly 1组的70％(66只中的46只)具有OM，而对照组的94％(68只中的64只)是OM阳性的(p＝0.0002)。这种差异在第10天继续存在，其中疫苗组的52％(48只中的25只)和对照组的86％(50只中的43只)具有OM的迹象(p＝0.0004)。在接种后第14天，对照组已经开始清除感染；疫苗队列的50％具有OM，而对照组的66％具有OM。
与鼓室图数据相似，在第3天的视频耳镜检查显示所有耳朵都具有与OM一致的迹象(图14)。在第7天，对照组的99％(68只中的67只)被定义为OM阳性的，而疫苗组的74％(66只中的49只)为OM阳性的(p＝0.0001)。在第10天，对照组中动物耳朵的100％(50/50)为OM阳性的；疫苗组中动物耳朵的仅50％(48只中的24只)为OM阳性的(p＝0.0001)。到第14天前，对照组已经开始显示出疾病清除，并且耳朵的66％(32只中的24只)出现OM迹象，而疫苗队列的OM阳性降低至43％(30只中的13只)(p＝0.019)。鼓室图和视频耳镜数据二者都表明，与对照相比，经疫苗治疗的动物显示出更快的疾病清除。
除了OM的外部检查之外，还对来自每个队列的动物的子组进行了上鼓室叩刺。在取样的点，每只耳朵被分级为有积液的湿耳和无积液的干燥耳。对干燥耳进行单独三次取样以确保不存在积液。积液进行定量培养以确定细菌滴度。图15示出了在每个时间点的干燥耳的百分比。在第3天，检查的所有耳朵都存在积液。在第7天，疫苗治疗组与对照组之间存在趋势差异。在第10天和第14天，这两组之间的差异非常显著(分别地，p＝0.001和0.0028)，超过70％的经疫苗感染的耳朵显示出中耳液的清除。
图16示出了MEE的平均CFU/ml。在第3天，疫苗组与对照组之间的MEE中的细菌密度相似。然而，随着疫苗组清除MEE，疫苗组的中耳的细菌密度显著更少(在第10天和第14天分别地p＝0.001和0.0028)。对照动物中的MEE细菌密度在感染的最初几天上升，并且在实验的剩余时间内平均为106cfu/ml，这与使用该模型的先前实验一致。Hi Poly 1免疫接种的组的大多数耳朵在14天时间段内清除了积液；然而，在所剩不多的MEE中的细菌密度与对照组中的MEE没有统计学上差异，即大约106cfu/ml。
讨论
尽管由于NTHi引起的严重粘膜和侵入性感染具有持续性和高发病率，但不可获得高度有效的商购可得疫苗。研究了若干毒力因子的免疫保护，所述毒力因子包括主要和次要外膜蛋白、黏附蛋白和脂寡糖。菌毛蛋白的肽基序被展示具有保护。然而，保护限于同源菌株，这可能是已知的菌毛蛋白蛋白序列异质性的结果。此外，使用Hi蛋白D作为运载体分子的11价肺炎球菌(pneumococcal)疫苗在临床试验中提供了35％的针对NTHi OM的保护。
使用生物信息学和蛋白结构分析，我们先前已经鉴定了存在于整个物种中的、序列保守的并且单独介导幼年大鼠模型中的被动保护的多个NTHi表面蛋白的肽区域。鉴定保护性肽的过程关于生物学功能是无偏倚的(unbiased)，并且值得注意的是，肽来源于具有多种功能和结构的蛋白。掺入Hi Poly 1中的肽来自β-桶状物(β-barrels)和脂蛋白。HxuC是TonB依赖性、跨外膜的门控膜孔蛋白，参与血红素的摄取。蛋白BamA也是β-桶状物，并且参与其他蛋白的组装和掺入到OM中。脂蛋白LptE是有桶状结构的LptD的辅助蛋白，并且对脂寡糖掺入OM中有所贡献。NucA是膜锚定的、表面暴露的5’-核苷酸酶，并且Hel(脂蛋白e:P4)是参与血红素和NAD获得二者的磷酸单酯酶。新型脂蛋白(Novel Lipoprotein)NlpI的生物功能尚未确定。因此，28kDa多肽Hi Poly 1靶向多种生物多样蛋白。
先前使用肽作为细菌疫苗的努力尚未成功。由于尺寸小而缺乏免疫原性、不能够鉴定表面暴露以及缺乏序列保守性，限制了肽在细菌疫苗中的效用。目前研究的中心假设是，这些障碍可以通过BVP的方法使用顺序递送的NTHi保护性肽来克服。Hi Poly 1被展示是有免疫原性的，具有17.04(1/134,756)的Log2滴度。Hi Poly 1还诱导肽特异性抗体，Log2滴度范围为4.03(1/16.3)至15.27(1/39,500)。总体上，Hi Poly 1是有免疫原性的，与用作疫苗的其他蛋白相似。因为特定蛋白区域的免疫原性和保护有效性通常不被表征，与目前的疫苗进行详细比较是困难的。除了免疫原性之外，我们还展示了靶向Hi Poly 1的抗体在两种单独的感染模型中针对两种不同的NTHi分离株是有保护性的。
疫苗佐剂是免疫原性的重要决定因素。我们使用明矾作为佐剂用于本发明的研究来模拟儿童疫苗。可能的是，Hi Poly 1的免疫原性和免疫原性谱可以随着商购可得佐剂(例如新Shingrix疫苗中使用的ASO1)列表的扩大而得到进一步改进。因此，可能的是，新开发的佐剂可以改进未来BVP的免疫原性和免疫谱。由于先前的研究，包括被动保护的有效性，已经展示针对OM的保护主要由血清抗体介导，所以我们集中于将抗体作为OM中的保护的手段。然而，可能需要旁路免疫途径来防止其他细菌，例如百日咳。
细菌疫苗已经在历史上利用1)全细胞，诸如20世纪90年代以前的百日咳疫苗，2)蛋白毒力因子，诸如破伤风毒素和菌毛，或3)表面碳水化合物，所述表面碳水化合物单独或与运载体蛋白缀合以改进免疫原性。最近，通过逆向疫苗学对基因组数据的***挖掘已经产生了可用于脑膜炎球菌(meningococcus)疫苗的保护性脂蛋白。这些方法在控制流行性感染方面非常成功。它们也有一定的限制。例如，荚膜疫苗靶向具有特定荚膜类型的物种成员，并且留下不具有荚膜的菌株(在流感嗜血杆菌的情况下)或具有不同荚膜类型的菌株(在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的情况下)而导致残留疾病。在百日咳的情况下，目前的疫苗具有3-5种蛋白，其中之一是百日咳杆菌黏附蛋白；最近出现了不产生百日咳杆菌黏附蛋白的菌株，并且可能促成降低的疫苗有效性。在BVP方法中这些限制减少，因为靶是免疫可及的蛋白区域并且多个蛋白区域被有效地递送。
其他人使用来自保护性蛋白的序列可变区的多种肽来克服序列异质性。然而，靶向多种蛋白的序列保守区域的BVP存在显著优势。表面暴露蛋白的序列保守区域跨越物种的存在表明这些区域可能是蛋白功能所必需的；因此，抗体对蛋白功能的抑制可以增强疫苗的有效性，这与对毒力因子(如毒素)的干扰类似。多个位点的有效靶向降低了遗传逃逸的机会，因为会需要多个同时发生的突变来避免暴露。最后，靶向BVP中的多个不同的蛋白靶提供了高度有成本效益的制造方法。
目前BVP的一个限制是缺乏基本的工具来鉴定可用于免疫攻击的特定蛋白区域。细菌表面结构的复杂性和受调节的表达使这种限制变得复杂。例如，HxuC受铁/血红素调节，并且在本发明研究中通过广泛的动物筛选检测到。此外，杀伤不同细菌物种所需的特定免疫机制可能影响肽的选择，并且未被良好研究。类似地，鉴定和区分线性表位和二级表位(secondary epitope)的保护性作用的方法未被良好表征。这些领域的研究对BVP的进一步开发是至关重要的。
多肽已经被计算机设计以执行多种功能，例如酶促和治疗性多肽。我们提出特异性设计BVP以诱导靶向细菌表面上的多种蛋白的保护性免疫力。我们的数据集中在相关的人类病原体NTHi上。然而，因为理解生物功能不是BVP方法的关键步骤，所以该方法可以直接应用于其他细菌物种。例如，我们具有证据表明BVP在百日咳临床前模型中是有效的(数据未示出)。
结论.Hi Poly 1是一种细菌疫苗多肽，被设计为多靶向多肽(multi-targetedpolypeptide)，由来自所有流感嗜血杆菌菌株中存在的表面暴露蛋白的序列保守肽构成。Hi Poly 1在毛丝鼠中是有免疫原性的，并且诱导出针对每种组分肽的抗体。与PBS或免疫前血清相比，免疫后毛丝鼠抗血清降低了幼龄大鼠模型中的NTHi R2866菌血症。类似地，在建立良好的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)中耳炎的毛丝鼠模型中，疫苗组比对照组显著更快地清除了NTHi菌株86-028的感染。这些数据支持Hi Poly 1作为NTHi疫苗的进一步研究，并且为用于其他病原体的细菌疫苗多肽的开发提供了模型。
上文的描述或本文以其他方式考虑的任何肽组合物还可以包含药学上可接受的运载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
本公开内容的某些实施方案涉及包含能够诱导针对感染性生物体的抗体反应的至少一种融合异源多肽(融合蛋白)的肽组合物。融合多肽可以包括串联连接的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的肽，其中一种或更多种肽中的每一种的长度是10个至60个氨基酸。
在某些其他实施方案中，本公开内容涉及能够诱导针对百日咳鲍特菌的抗体反应的肽组合物，其中肽组合物是包含至少一种与运载体分子偶联的肽的运载体分子组合物。
上文描述或本文以其他方式考虑的任何运载体分子组合物可以存在于还包含药学上可接受的运载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的组合物中。
在某些实施方案中，本公开内容涉及在受试者中诱导针对感染性生物体的主动或被动免疫原性反应的方法。该方法包括将免疫原性有效量的如上文描述或本文以其他方式考虑的肽组合物、融合多肽和/或运载体分子组合物中的任一种施用至受试者的步骤。
在某些实施方案中，本公开内容涉及在受试者中提供针对百日咳鲍特菌的主动或被动免疫保护的方法。该方法包括将有效量的针对如上文描述或本文以其他方式考虑的肽组合物、融合多肽和/或运载体分子组合物中的任一种产生的抗体组合物施用至受试者的步骤。
此外，在一些实施方案中，编码异源多肽的DNA可以用作疫苗组合物，无论是直接递送还是通过病毒载体递送都可以用作疫苗组合物。
虽然已经结合某些实施方案描述了本公开内容以便可以更全面地理解和领会其方面，但是本公开内容并不意图被限于这些特定实施方案。相比之下，所有的替代方案、修改和等同物都包括在如本文定义的本公开内容的范围内。因此，包括特定实施方案的上文描述的实例用于说明本公开内容的实践，应当理解示出的细节仅通过实例的方式并且是为了说明性地讨论特定实施方案的目的，并且是为了提供被认为是对本公开内容的程序以及原理和概念方面的最有用且容易地理解的描述而呈现的。在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对本文描述的各种组合物的配制、本文描述的方法或者本文描述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。此外，虽然本公开内容的各种实施方案已经在下文的权利要求中进行了描述，但是并不意图本公开内容被限于这些特定的权利要求。申请人保留在后续专利申请中修改、增加或替换本文下文指明的权利要求的权利。
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35 40

Claims (12)

1.一种由细菌物质制备疫苗组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)选择具有高相对丰度的mRNA表达的一种或更多种细菌基因；
(b)通过保护测定测试步骤(a)中选择的所述一种或更多种基因的肽的免疫原性作用；和
(c)使用步骤(b)中展示有保护的一种或更多种基因的肽构建细菌疫苗多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述高相对丰度的mRNA在约11,819至约47,656之间。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括基于遍及感兴趣细菌物种的表达，选择用于步骤(a)的一种或更多种细菌基因。
4.根据权利要求1或3所述的方法，所述方法还包括基于所述一种或更多种细菌基因是细胞表面暴露的计算机结构分析，选择用于步骤(a)的一种或更多种细菌基因。
5.一种在受试者中诱导免疫原性反应的方法，所述方法包括以下步骤：将一定量的异源融合多肽组合物施用至受试者，所述异源融合多肽组合物有效刺激针对感染性生物体的免疫原性反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述感染性生物体是百日咳鲍特菌(B.pertussis)(Bp)，并且其中所述异源融合多肽选自由BpPoly1和BpPoly3组成的组。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述异源融合多肽与运载体分子连接，以形成运载体分子组合物。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述异源融合多肽还包括药学上可接受的运载体、媒介物、稀释剂和/或佐剂。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述异源融合多肽组合物根据权利要求1制备。
10.一种在受试者中诱导针对百日咳鲍特菌的免疫原性反应的方法，所述方法包括以下步骤：
将一定量的包含BpPoly1或BpPoly3的异源融合多肽组合物施用至所述受试者，其中所述量的所述异源融合多肽有效刺激所述受试者中针对百日咳鲍特菌的免疫原性反应。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述异源融合多肽与运载体分子连接，以形成运载体分子组合物。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述异源融合多肽还包括药学上可接受的运载体、媒介物、稀释剂和/或佐剂。
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