KR101922414B1 - 클로스트리디움 퍼프린젠스의 알파 독소를 표면 발현하는 재조합 독소원성 대장균 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지에 식중독을 유발하는 주요 원인균인 독소원성대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)를 감염을 예방하기 위한 백신에 관한 것으로, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 주요 독소인 알파독소를 독소원성대장균의 표면에 발현한 재조합 표면 발현 백신주를 이용함으로써 뛰어난 면역원성 및 세균 방어능력을 가지며, 따로 항원을 정제하지 않아도 높은 항체가를 유도해 낼 수 있어 백신 제조공정을 획기적으로 간소화 할 수 있고, 대량생산화가 용이하여 고효율 저비용의 백신을 생산 및 공급할 수 있다.

Description

클로스트리디움 퍼프린젠스의 알파 독소를 표면 발현하는 재조합 독소원성 대장균{Enterotoxigenic Escherichia coli that surface displaying alpha toxin of Clostridium perfringens}

돼지에 식중독을 유발하는 주요 원인균인 독소원성대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)를 감염을 예방하기 위한 백신에 관한 것으로, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 주요 독소인 알파독소를 독소원성대장균의 표면에 발현한 재조합 표면 발현 백신주로 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성대장균에 대한 효과적인 방어적 면역 반응을 유도하는 것에 관한 것이다.

클로스트리디아(Clostridia)는 포자를 형성하는 그람양성의 혐기균주이다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 A 및 C(Clostridium perfringens type A.C), 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile),클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리디움 노바이(Clostridium novyi), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 셉티쿰(Clostridum septicum) 그리고 클로스트리디움 샤보이(Clostridium chauvoiei)가 돼지에 질병을 일으키는 대표적인 클로스트리디아 균주 들이다. 그중에서도 C.perfringens 및 C.difficile이 장에 염증을 일으키는 주요 병원체 이다. C.perfringens는 주요 독소인 alpha(C.perfringens alpha toxin;CPA), beta(C.perfringens beta toxin;CPB), epsilon(C.perfringens epsilon toxin;ETX), iota(C.perfringens iota toxin)에 따라 A,B,C,D,E 총 5개 타입으로 나뉘어지며 그중에서 알파 독소(alpha toxin)는 전 혈청형에서 발견되는 독소이다. 알파 독소는 인지질 분해효소로 작용하여 장관 막 점막을 소실시켜 장염, 심근이상, 혈관수축 등으로 인한 급성 폐사를 유발하여 해당 질병에 주요 원인이라고 알려져 있다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 A는 새끼양, 염소, 송아지, 닭, 돼지, 말, 등을 감염시키며, 주로 알파 독소를 생산한다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 타입 A는 신생 돼지와 이유돼지에게 감염하여 돼지 괴사성 장염(necrotic enterocolitis)를 일으킬 수 있다. 폐사율은 10~30%이며, 감염시 식중독 증상이 나타나며, 가스성 괴저(근육 괴사), 조직괴사, 균혈증, 폐기종성 담낭염을 유발할 수 있다. 균의 장관 내 이상증식 기전에 대한 메커니즘은 아직 불분명 하나, 해당 균의 이상증식으로 괴사성 장염을 유발하며, 균체 외독소의 혈류 내 유입으로 인해 임상증상 없이 수시간 내에 폐사하는 경우가 많다. 보균돼지는 양돈 자간에 전파가 가능하며, 아포를 형성하기 때문에 국내 양돈장에 지역적, 산발적으로 발생한다. 이에 따라 가축의 폐사 및 체중감소와 같은 심각한 생산적, 경제적 손실을 가져올 수 있다. 현재 대부분 연구된 클로스트리디움 퍼프린젠스 백신은 타입 C형에 대한 백신으로 이에 대한 면역화가 이유식 전 폐사율을 매우 감소시켰으나, 타입 A형에 대해 상업적으로 이용가능한 백신은 현재 없다. 특히, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 혐기성 균으로 배양이 까다롭고 독소를 따로 분리 및 정제를 해야 하는 번거로움이 있으며, 이유식 전 돼지의 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형에 대한 진단 및 예방법은 C형감염에 대한 메카니즘보다 훨씬 복잡하고 상이하여 연구가 제대로 이루어지지 않았을 뿐만 아니라, 현재 이유식 전 돼지의 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형 감염의 빈도가 더더욱 증가하는 것으로 인식되고 있어 타입 A에 대한 예방 백신이 필요한 실정이다.

한편, 병원성 대장균은 돼지에서 주로 식중독 및 부종병과 같은 장관감염을 유발하는 병원체로, 주로 ETEC(enterotoxigenic E.coli) 및 EPEC(Enteropathogenic E.coli)에 의해 유발된다. 독소원성 대장균(ETEC)은 설사성 질환을 유발하는 비침입성 세균의 일종으로, 소장 상피세포에 정착, 증식 후 이열성 및 내열성 독소를 분비하여 소장벽 세포의 GS-cAMP 또는 Gi-cGMP 시스템을 자극함으로써 전해질 등의 이온분비를 촉진 시켜 수액성 설사를 유발한다. ETEC는 가축의 세균성 식중독에서 가장 흔히 발견되는 주요 원인균이며, 감염될 경우 주로 설사와 같은 식중독 증상이 나타나며, 증세가 심한 경우에는 체액의 손실로 인한 탈수 증상에 의해 폐사할 수 있다. 특히 어린 돼지에서 많이 발생하며 1~4일령 자돈에서 발생하는 신생자돈설사는 그 치사율이 90% 이상으로 매우 치명적이다. ETEC는 소장 상피세포에 부착하여 감염을 일으키기 위한 부착인자(Fimbriae)를 갖고 있으며, 현재 여러 타입의 소장상피세포가 설사증세가 있는 신생 자돈에서 분리되었다. 대표적으로 K88, K99, F41, 987p가 있으며, 이들 부착인자가 대장균감염의 주요 역할을 담당하고 있어 이들 4가지 섬모를 가진 백신을 임신 모돈에게 접종하는 백신 연구가 주로 이루어지고 있다.

이에 본 발명자들은 돼지의 세균성 식중독 감염 예방백신개발에 있어 면역원성과 안전성이 뛰어나고 저비용으로 고효율을 창출해 낼 수 있는 돼지 세균성 식중독 감염 예방백신을 연구하였다.

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스의 알파 독소(alpha toxin)를 표면에 발현하는, 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 감염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 돼지 식중독 예방용 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

아울러, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 백신 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 클로스트리디움 퍼프린젠스 전 타입에서 생산되며 가스괴저증을 유발하는 알파독소를 K88ab 부착인자를 지닌 ETEC 표면에 발현하여 높은 면역반응을 유도하는 백신주를 개발하였다. 구체적으로, 표면발현 기술을 적용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스의 알파독소를 세포표면에 발현되도록 하는 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 독소원성 대장균에 형질전환하여 백신주를 제작 한 후 이의 항체유도능 및 방어력을 확인하였다.

본 발명에서 가축의 장관계 질환의 주요 원인이 되는 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성대장균을 예방하기 위한 백신으로 제조한 재조합 독소원성 대장균은, 표면발현 기술을 적용하여 뛰어난 면역원성 및 세균 방어능력을 가지며, 표면발현 기술을 이용하였기 때문에 따로 항원을 정제하지 않아도 높은 항체가를 유도해 낼 수 있어 백신 제조공정을 획기적으로 간소화 할 수 있고, 대장균을 기반으로 한 재조합 기술을 사용하기 때문에 대량생산화가 용이하여 고효율 저비용의 백신을 생산 및 공급할 수 있다.

도 1은 클로닝에 사용 한 enzynomics사의 pTOP Blunt V2의 개열지도이다.
도 2는 pTrcHis2B 벡터에 OmpA 유전자를 클로닝하여 표면 발현 벡터인 OmpA-pTrcHis2B 벡터를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도식도이다.
도 3은 OmpA-pTrcHis2B 벡터에 CPA 유전자를 클로닝하여 CPA-OmpA-pTrcHis2B 최종 벡터를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도식도이다.
도 4는 표면 발현용 재조합 벡터인 CPA-OmpA-pTrcHis2B 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 5는 ETECk88ab/CPA 균주의 CPA, OmpA 그리고 k88ab 유전자를 PCR법을 이용하여 확인한 도이다.
도 6은 IPTG에 의하여 시간대별로 과발현 되는 CPA 단백질을 SDS PAGE 젤로(쿠마시블루 스테이닝) 확인한 도이다.
도 7은 IPTG에 의하여 시간대별로 발현되는 CPA 단백질이 표면에 발현되는지 여부를 확인하기 위해 쿠마시블루 스테이닝을 통해 확인한 사진이다.
도 8은 IPTG에 의하여 시간대별로 발현되는 CPA 단백질이 표면에 발현되는지 여부를 확인한 도이다.
도 9는 CPA 표면 발현여부를 Whole cell-ELISA 방법으로 확인한 도이다.
도 10은 CPA 표면 발현 여부를 전자현미경으로 확인한 도이다.
도 11은 CPA/ETEC 백신(불활성 ETECk88ab/CPA 균주) 접종에 따른 마우스에서의 CPA IgG 항체가 (A) 및 CPA IgA 항체가 (B)를 확인한 도이다.
도 12는 CPA/ETEC 백신 접종에 따른 마우스에서의 ETEC k88ab IgG 항체가를 확인한 도이다.
도 13은 CPA/ETEC 백신을 접종한 마우스의 혈청을 CPA blocking ELISA를 통해 CPA blocking 효과를 확인한 도이다.
도 14는 CPA/ETEC 백신 (CPA/K88ab)을 접종한 마우스의 C.perfringens 감염에 대한 방어력을 확인한 도이다.
도 15는 CPA/ETEC 백신 (CPA/K88ab)을 접종한 마우스의 ETEC 감염에 대한 방어력을 확인한 도이다.

본 발명을 보다 충분히 이해할 수 있도록 하기 위하여 하기의 상세한 설명을 기재한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.

일 측면에서, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)의 알파 독소(alpha toxin)를 표면에 발현하는 (surface display), 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)에 관한 것이다.

일 구현예에서, 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소가 독소원성 대장균의 외막 단백질 A(Outer membrane protein A, OmpA)에 결합되어 독소원성 대장균의 표면에 발현될 수 있다.

일 구현예에서, 독소원성 대장균의 외막 단백질 A는 서열번호 7의 염기서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

일 구현예에서, 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소는 서열번호 8의 염기서열로 이루어질 수 있고, 339개의 아미노산 중 초기 20개 시그널 펩타이드를 제거한 나머지 319개 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 독소원성 대장균은 K88ab 필러스를 가질 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 불활화한 본 발명의 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 감염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형일 수 있다.

불활화백신 조성물은 죽은 세포주 또는 이의 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 백신 세포주가 높은 역가로 증식되면, 이를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 이성분 에틸렌이민(BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 이어서 비활성화된 세포주를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.2% 포름알데히드에서 불활화한 것일 수 있다.

일 구현예에서, 면역강화제(아주번트)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 아주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 아주번트는 프로인트 완전아주번트, 프로인트 불완전아주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드,오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 애주번트는 Quil A 및 Carbopol이다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 클로스트리디움 퍼프린젠스 및/또는 독소원성 대장균의 감염의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 클로스트리디움 퍼프린젠스 및/또는 독소원성 대장균 감염에 의한 감염증 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 치료용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

일 측면에서, 본 발명은 불활화한 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균을 유효성분으로 포함하는 돼지 식중독 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 돼지 식중독은 클로스트리디움 퍼프린젠스 또는 독소원성 대장균에 의해 유발된 돼지 식중독일 수 있다.

일 구현예에서, 생독 백신, 사독 백신, 제 1항의 재조합 독소원성 대장균의 유전자를 사용하여 생산한 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 불활화 백신인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 세포주 또는 죽은 세포주의 적절한 요소를 함유할 수 있고 (서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 세포주 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 바이러스, 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화)제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

본 발명의 백신조성물은 필요에 따라 기술분야의 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 또는 안구 접종될 수 있으며, 피하 투여인 것이 가장 바람직하다.

백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 애주번트로서 Quil A 및 Carbopol를 사용하였다.

예방접종 또는 치료를 위해, 동결건조물은 0.1 내지 0.5ml의 수용액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 트리스 완충액에 용해되며 전신적으로 또는 국소적으로, 즉 비경구, 피하, 근육내 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 형태, 복용량 및 투여횟수는 공지된 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 2주 간격으로 2회 접종하였다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 돼지에서 돼지 식중독에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 불활화한 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균을 유효성분으로 포함하는 돼지 식중독 예방용 백신 조성물의 면역 유효량을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 보호성 면역 반응의 유도법에 관한 것이다.

상기 면역 반응은 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.

상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 낮아진 치사율에 의해 입증된다.

상기 면역 유효량은 면역 반응을 유도하여 돼지에서 유행성설사병 바이러스 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소 항원 및 독소원성 대장균의 외막 단백질 A(OmpA) 발현 유전자를 증폭시키는 단계; 증폭된 유전자들을 재조합 벡터에 클로닝하는 단계; 클로닝된 벡터를 독소원성 대장균에 형질전환시키는 단계; 형질전환된 독소원성 대장균을 선별하는 단계; 선별한 재조합 대장균에서 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소 항원 표면 발현을 유도하는 단계; 및 표면 발현된 재조합 독소원성 대장균을 불활화하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 백신 조성물 제조방법에 관한 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 표면발현 벡터 제작

1-1. 유전자 분리 및 합성

OmpA(Outer membrane protein A)의 유전자 확보를 위해 페놀-클로로폼 추출법을 통해 독소원성 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC)의 유전자를 분리한 후, 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 2의 OmpA-F 및 OmpA-R 프라이머로 OmpA (a.a 1-184)의 PCR을 수행하였다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소(Clostridium perfringens alpha toxin)는 바이오니아 업체에 유전자 합성을 의뢰하여 확보한 뒤, 대장균 내 원활한 발현을 위해 최적화를 진행하였다. 이후 하기 표 1에 기재된 서열번호 3 및 4의 CPA-F 및 CPA-R 프라이머로 PCR을 수행하여 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 독소원성 대장균의 OmpA 유전자와 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소 유전자를 각각 확보하였다.

프라이머명	서열 (5'->3')	제한효소 자리 종류	서열번호
OmpA-F	CCATGGCCAAAAAGACAGCTATCGCGA	NcoI	1
OmpA-R	GAATTCGGTTGTCCGGACGAGTGCCGA	EcoRI	2
CPA-F	GAATTCCCGGGGCATCAACTAAAGTCTAC	EcoRI	3
CPA-R	GTCGACTTTTATATTATAAGTTGAA	SalI	4
K88ab-F	GGTGATTTCAATGGTTCGGTC		5
K88ab-R	TGCAGCACCCGAAACAGTCGTCGT		6

1-2. 벡터 제작

상기 실시예 1-1에서 확보한 OmpA 및 CPA DNA를 도 1에 나타낸 pTOP Blunt V2 (enzynomics)로 클로닝하여 서열 일치여부를 먼저 확인하였다. 이후, CPA 발현을 위한 표면 발현 벡터(surface display vector)로서 pTrcHis2B vector를 기본벡터로 사용하였다. 제한효소 NcoI 및 EcoRI을 이용하여 pTOP Blunt V2에 클로닝 한 OmpA유전자를 pTrcHis2B vetor에 삽입하여 표면 발현 벡터를 완성하였으며 (도 2), pTOP Blunt V2에 클로닝한 CPA 유전자를 EcoRI 및 SalI을 이용하여 표면 발현 벡터에 라이게이션(ligation)하여 (도 3) 최종적으로 pTrcHis2-OmpA-CPA vector (도 4)을 완성하였다. 그 결과, trc 프로모터에 의해 OmpA 및 CPA가 융합되어 표면에 발현하였고, 엠피실린으로 선별이 용이한 벡터가 제작되었다.

실시예 2. 백신주 제작 및 확인

독소원성 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC-k88ab) 표면에 외래 단백질인 CPA를 발현시키기 위해 상기 실시예 1에서 제작한 pTrcHis2B-OmpA-CPA 벡터를 ETEC-k88ab strain에 형질전환(transformation)하기 위해 CaCl₂ 방법을 이용하였다. 구체적으로, CPA DNA와 ETEC-k88ab균주를 섞어 얼음에서 20분간 인큐베이션한 후, 42℃에서 60초 동안 열처리한 뒤, 다시 얼음에서 5분간 인큐베이션하였다. 형질전환 후 25분간 LB (Amp^-)에서 전배양 후, LB (Amp⁺)에 도말하여 형질전환 세포주 ETECk88ab/CPA를 수득하여 KCTC에 기탁하였다 (KCTC13144BP). 그 후, ETECk88ab/CPA를 배양한 후, 플라스미드 추출하여 이를 주형으로 OmpA 및 CPA의 유전자의 존재 여부를 PCR 방법으로 확인하였다. 사용한 PCR 조건은 하기의 표 2와 같다.

DNA	condition	Initial denaturation	denaturation	annealing	extension	Final extension	end	cycle
OmpA	Temperature	95℃	95℃	60℃	72℃	72℃	12℃	35cycle
	time	1분	15초	30초	40초	5분
CPA	Temperature	95℃	95℃	60℃	72℃	72℃	12℃	35cycle
	time	1분	15초	30초	90초	5분
k88ab	Temperature	94℃	94℃	58℃	72℃	72℃	12℃	35cycle
	time	3분	30초	30초	1분	10분

그 결과, 재조합 형질전환 세포주 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP)에 OmpA 및 CPA가 존재하였으며, fimbriae도 존재함을 알 수 있었다 (도 5).

실시예 3. 재조합 형질전환 세포주 ETECk88ab/CPA의 단백질 발현 확인

3-1. 단백질 발현 확인

200ug/ml 농도의 엠피실린이 함유된 LB배지에 37℃에서 200rpm으로 본 발명의 재조합 형질전환 세포주를 배양한 후, 배양 3시간부터 OD 0.4~0.5일 때 IPTG 0.5mM을 사용하여 CPA 단백질의 표면 과발현을 유도하였다. 최적의 배양 시간대를 확인하기 위해 상기 유도 후 6시간 동안 배양하여 시간대별로 샘플링하였다. OmpA 및 CPA가 융합(fusion)된 단백질의 C-terminal 말단에 his-tag이 있어, His-prob mouse monoclonal antibody-HRP (santa cruz, sc-8036)를 1:1000 희석한 항체와 CPA를 특이적으로 인지하는 CPA-rabbit polyclonal antibody (biorbyt, orb4595)를 1:1000 희석 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 또한, 융합된 단백질이 표면에 발현되었는지 확인하기 위하여, 재조합 균주 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP)를 6시간 동안 배양한 후, 전체 세포를 PBS에 세척하여 tryspin accessibility test를 수행하였다. 구체적으로, 재조합 균주 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP)를 과발현시킨 후, 트립신을 처리하여 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. PBS 버퍼로 4회 세척한 후, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 표면발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 약 63kDa의 크기를 가지는 OmpA 및 CPA가 융합된 단백질의 발현을 세포주 배양 시간에 따라 확인할 수 있었다. 특히, 배양 시간이 늘어날수록 63kDa인 OmpA 및 CPA가 융합된 재조합 단백질의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다 (도 6). 또한, Trypsin accessibility test 결과, 트립신을 처리한 샘플은 트립신을 처리하지 않은 결과와 대조적으로 단백질이 트립신에 의해 제거 되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7 및 도 8). 이를 통해, CPA 유전자 내에 트립신에 의해 절단되는 자리가 존재하기 때문에 트립신처리 시 균주 표면에 발현된 CPA 단백질이 분해되는 것을 알 수 있었다.

3-2. 표면 발현 확인

3-2-1. ELISA 분석

표면발현여부 확인을 위한 다른 방법으로 전세포 ELISA를 CPA ELISA KIT(BioX, BIO K 289/2)를 사용하여 진행하였다. 6시간 동안 과발현 유도된 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP)를 PBS에 1회 세척하여 1x10^6 CFU, 1x10^7 CFU로 희석하였다. 그 후, CPA 항체가 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 해당 세포들을 1시간동안 처리하였다. 이후 anti-alpha toxin-peroxidase coloured conjugate를 1시간 동안 처리하여 OD 450nm에서의 결과를 확인하였다.

그 결과, 과발현을 유도하지 않은 전세포(whole cell)에 비해 과발현 유도된 전세포(whole cell)의 OD값이 8배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 9). 이는, CPA 단백질의 과발현이 유도됨에 따라 균주의 표면에 CPA 단백질이 발현됨을 의미하며, 이를 통해 CPA 단백질이 성공적으로 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 균주 표면에 발현되었음을 알 수 있었다.

3-2-2. IFA 분석

표면발현여부 확인을 위한 또 다른 방법으로 IFA(Immunofluorescence Assay)를 진행하였다. 6시간 동안 과발현된 균주 (ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP))를 PBS로 1회 세척한 후, His 프로브 마우스 항체를 2시간 동안 반응시켰다 (해당 단백질은 His 태깅이 되어있기 때문에 His 택 항체로 검출이 가능함). 이후 10000rpm에서 10분간 원심분리 후, Goat anti-mouse IgG-FITC와 상온에서 1시간 동안 반응되었다. 형광현미경을 통해 40배율에서 FITC 발광 여부를 확인하였다.

그 결과, IPTG 과발현이 유도된 균주는 과발현이 유도되지 않은 균주보다 형광 발광을 하는 수준이 월등 하게 높았다 (도 10). 이를 통해, ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 균주 표면에 His-tag을 가진 CPA 단백질이 과발현되었음을 알 수 있었다.

실시예 4. 백신 제조

CPA/ETEC 백신주 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 균주를 6시간 과발현 유도하여 배양한 후 PBS에 4회 세척하여 배지의 영향을 최소화한 뒤, 생균수를 측정하여 1×10^10.0 CFU/ml로 희석하였다. 이후 포름알데히드 0.2%를 첨가하여 37℃에서 2일 동안 불활화한 뒤 LB agar에서 불활화 되었음을 확인하였다. 이후, ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주 1×10^9.0 CFU/dose에 아주번트(Adjuvants)로 Quil A 0.2mg/dose 및 Carbopol 0.5㎕/dose을 첨가하여 백신을 제조하였다. 백신 투여는 2주 간격으로 2회 피하접종을 통해 수행한다.

실시예 5. 백신 효과 확인

5-1. CPA 항체가 확인

백신주의 접종 농도에 따른 CPA 항체 형성을 마우스에서 확인하기 위하여, 대조군으로 PBS 100ul 투여 그룹, ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주 투여 그룹으로 나누어 각 6마리씩 격리 사육하면서 백신 접종에 의한 항체 생성 시험을 실시하였다. 백신 접종 시기는 2주 간격으로 2회 피하 접종하였고, 1차 접종 2주차 및 2차 접종 3주차에 채혈을 진행하여 항체가 변화를 지켜보았다. 백신주에 대한 CPA 항체가를 측정하기 위하여 CPA 항원을 200ng/100ul씩 ELISA 측정용 96웰 플레이트에 코팅하여 일반적인 ELISA측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다.

그 결과, 백신을 접종한 그룹의 CPA IgG 항체가가 대조군과 유의한 차이를 나타냈으며, 2차 접종까지 진행할 경우 1차 접종만 진행 한 것 보다 유의한차이로 항체가가 증가함을 확인할 수 있었다 (도 11A). 점막면역반응을 확인하기 위해 CPA IgA 항체가를 분석한 결과에서도, 백신을 접종 한 그룹의 CPA IgA 항체가가 대조군과 유의한 차이를 나타냄을 확인하였다 (도 11B). 이를 통해, 본 발명의 백신주 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP)는 마우스에서 CPA IgG 및 IgA 항체 형성이 현저히 효과적임을 알 수 있었다.

5-2. ETEC-k88ab 항체가 확인

ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주의 접종 농도에 따른 ETEC-k88ab 항체 형성을 마우스에서 확인하기 위하여, 대조군으로 PBS 그룹 (음성대조군), 수이셍(Suiseng, Hipra) 백신 그룹 (양성대조군) 및 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 그룹으로 나누어 각 6마리씩 투여한 뒤, 격리 사육하면서 백신접종에 의한 항체 생성 시험을 실시하였다. 각 그룹은 2주 간격으로 2회 접종하였고, 접종 3주차에 채혈하여 항체가 변화를 지켜 보았다. ETEC로부터 정제한 k88ab fimbriae 항원을 300ng/100ul씩 ELISA 측정용 96웰 플레이트에 코팅하여 일반적인 ELISA 측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다.

ETEC-k88ab IgG 항체가 확인 결과, ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주를 피하로 접종했을 경우 PBS 그룹보다 현저히 높게 항체가가 유도되었으며, 양성대조군인 수이셍 백신보다도 유의한 정도로 항체가가 높게 유도됨을 확인하였다 (도 12).

이처럼, 본 발명의 재조합 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주는 C.perfringens 알파 독소(alpha toxin)에 대해 항체 생성 효과를 나타낼 뿐만 아니라, ETEC 감염에 대해서도 우수한 항체 생성 효과를 지니는 다가백신으로서, C.perfringens 및/또는 ETEC에 의해 발생하는 질병 예방에 효과적임을 알 수 있다.

5-3. 클로스트리디움 퍼프린젠스 블럭킹 테스트

ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주의 접종에 따른 마우스 혈청학적 면역반응을 확인하기 위해 블럭킹 테스트를 진행하였다. 상기 실시예 5-1의 CPA 항체가 확인 실험과 동일한 방법으로 마우스 실험을 진행하였고, 2차 접종 3주차에 채혈한 혈청을 그룹 당 각 4개의 샘플을 이용하여 C.perfringens 혈청학적 분석 적용 ELISA kit (Bio-X, Bio K 291/2)로 분석하였다. 구체적으로, 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소가 코팅된 96웰 플레이트에 채혈 혈청을 50ul씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 알파 독소를 검출하는 컨쥬게이트(conjugate)를 100ul 처리하여 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 이용하여 하기의 수학식 1 내지 3을 통해 분석하였다.

(neg: 음성 대조군; pos: 양성 대조군; sample: 샘플)

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, PBS 그룹과 수이셍 그룹은 20% 미만의 positivity를 나타내어 음성의 결과를 나타내었지만, ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 그룹은 40% 이상의 positivity를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 이는 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주를 접종한 마우스 내에 생성된 항체가 C.perfringens alpha toxin을 효과적으로 저해할 수 있음을 의미한다.

실시예 6. 백신 방어력 확인

공격접종에 사용된 균주는 연구소재은행 항생제내성균주은행으로부터 분양받은 C.perfringens CCARM 18020 균주로 혈액 한천 배지 플레이트(blood agar plate)에서 혐기 배양하였고, 혐기 배양된 콜로니를 쿡드 미트 배지(cooked meat broth)에 접종하여 혐기 정치 배양 후 수득(harvest)하였다. 야외에서 분리한 ETEC-k88ab균주는 LB 플레이트에서 호기 배양 후, 배양된 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하여 호기 배양하여 수득하였다. 백신 접종은 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주 및 아쥬번트(adjuvants)가 혼합된 백신을 2주 간격으로 2회에 걸쳐 마우스에 피하접종하였다. 접종 3주차에 C.perfrigens 1x10^12 CFU/ml 및 ETEC 1x10^10 CFU/ml로 100ul씩 복강접종하여 일주일간 마우스 폐사 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 백신 접종 3주 후에 C.perfringens 공격 접종을 실시한 경우, PBS 그룹에서 5마리가 폐사하였으며, 수이셍 그룹에서는 6마리가 폐사하였다. 반면 본 발명의 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주를 접종한 CPA/K88ab 그룹은 1 마리가 폐사하여 83.3%의 생존률을 나타냈다. 또한 ETEC-k88ab 공격접종을 실시한 경우, PBS 그룹에서 6마리가 폐사하였으나, 수이셍 그룹 및 CPA/K88ab 백신 접종 그룹은 모두 100% 생존률을 나타냈다. 이를 통해, 본 발명의 ETECk88ab/CPA (KCTC13144BP) 백신주는 마우스 내에서 C.perfringens 및 ETEC-k88ab에 대한 충분한 방어 효과를 유도하는 것을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원 KCTC13144BP 20161101

<110> WOOGENE B&G CO., LTD. <120> Enterotoxigenic Escherichia coli that surface displaying alpha toxin of Clostridium perfringens <130> PN1710-382 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpA-F primer <400> 1 ccatggccaa aaagacagct atcgcga 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpA-R primer <400> 2 gaattcggtt gtccggacga gtgccga 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPA-F primer <400> 3 gaattcccgg ggcatcaact aaagtctac 29 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPA-R primer <400> 4 gtcgactttt atattataag ttgaa 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K88ab-F primer <400> 5 ggtgatttca atggttcggt c 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K88ab-R primer <400> 6 tgcagcaccc gaaacagtcg tcgt 24 <210> 7 <211> 1134 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaagattg atggaacagg aactcatgct 60 atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtccaaaaa tgaaccagaa 120 agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 180 acttatccag attatgataa gaatgcatat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 240 gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 300 acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 360 aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 420 actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggacatgt taagtttgaa 480 acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 540 gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaggatttta atgcatggtc aaaagaatat 600 gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 660 agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 720 gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 780 aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 840 gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 900 gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 960 gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1020 gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1080 gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaa 1134 <210> 8 <211> 552 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 8 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gccgctccga aagataacac ctggtacact ggtgctaaac tgggctggtc ccagtaccat 120 gacactggtt ttattcctaa caatggtccg acccacgaaa accaactggg tgcaggtgct 180 tttggtggtt accaggttaa cccgtatgtt ggttttgaaa tgggttacga ctggttaggt 240 cgtatgccgt acaaaggcga caacatcaac ggtgcataca aagctcaggg cgttcaactg 300 actgctaaac tgggttaccc aatcactgac gatctggacg tatacactcg tctgggtggt 360 atggtatggc gtgcagacac caaggctaac gtacctggtg gcgcatcctt taaagaccac 420 gacactggcg tttctccggt tttcgcaggt ggtgttgagt acgcgatcac tcctgaaatc 480 gctacccgtc tggaatacca gtggaccaac aacatcggtg acgcacacac catcggcact 540 cgtccggaca ac 552 <210> 9 <211> 282 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 9 Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys Asp Gly Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Met Val Thr Gly Val Ser Asn Asp Ser Lys Asn Ser Val 20 25 30 Arg Lys Asn Lys Asn Met His Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Asp Lys Asn 35 40 45 Ala Tyr Asp Tyr Asp His Trp Asp Asp Thr Asp Asn Asn Ser Lys Asp 50 55 60 Asn Ser Trp Tyr Ala Tyr Ser Asp Thr Gly Ser Arg Lys Ser Ala Ala 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Arg Gly Asn Tyr Lys Ala Thr Tyr Gly Ala Met His Tyr 85 90 95 Gly Asp Asp Thr Tyr His Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly 100 105 110 His Val Lys Thr Ala Arg Lys Tyr Lys Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr 115 120 125 Asn Asp Tyr Ala Asp Lys Asn Lys Asp Asn Ala Trp Ser Lys Tyr Ala 130 135 140 Arg Gly Ala Lys Thr Gly Lys Ser Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser 145 150 155 160 His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Ala Asn Ser 165 170 175 Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Tyr Arg His Asp Val Ser Gly Asn Asp Ser 180 185 190 Val Gly Lys Asn Val Lys Val Ala Tyr Ser Thr Ser Gly Lys Asp Ala 195 200 205 Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Gly Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Trp 210 215 220 Met Asp Asn Gly Asn Asp Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Asn Lys Asp Asp Asn Met Trp Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala 245 250 255 Asp Ala Tyr Lys Asn Lys Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp 260 265 270 Asn Trp Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Lys 275 280 <210> 10 <211> 138 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Lys Lys Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Gly Ala Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala Lys Gly Trp Ser Tyr His 20 25 30 Asp Thr Gly Asn Asn Gly Thr His Asn Gly Ala Gly Ala Gly Gly Tyr 35 40 45 Val Asn Tyr Val Gly Met Gly Tyr Asp Trp Gly Arg Met Tyr Lys Gly 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gly Val Thr Ala Lys Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Asp Val Tyr Thr Arg Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr 85 90 95 Lys Ala Asn Val Gly Gly Ala Ser Lys Asp His Asp Thr Gly Val Ser 100 105 110 Val Ala Gly Gly Val Tyr Ala Thr Ala Thr Arg Tyr Trp Thr Asn Asn 115 120 125 Gly Asp Ala His Thr Gly Thr Arg Asp Asn 130 135

Claims (10)

1. 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)의 알파 독소(alpha toxin)를 표면에 발현하는 (surface display), 수탁번호 KCTC13144BP의 재조합 독소원성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli).
2. 제 1항에 있어서, 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소가 독소원성 대장균의 외막 단백질 A(Outer membrane protein A, OmpA)에 결합되어 독소원성 대장균의 표면에 발현되는, 재조합 독소원성 대장균.
3. 제 2항에 있어서, 클로스트리디움 퍼프린젠스 알파 독소는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는, 재조합 독소원성 대장균.
4. 제 1항에 있어서, 독소원성 대장균은 K88ab 필러스(fimbriae)를 가지는, 재조합 독소원성 대장균.
5. 불활화한 제 1항의 재조합 독소원성 대장균을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 감염 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 면역강화제를 추가로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 독소원성 대장균의 감염 예방 또는 치료용 조성물.
7. 불활화한 제 1항의 재조합 독소원성 대장균을 유효성분으로 포함하는 돼지 식중독 예방용 백신 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 돼지 식중독은 클로스트리디움 퍼프린젠스 또는 독소원성 대장균에 의해 유발된 것인, 돼지 식중독 예방용 백신 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 백신의 형태는 생독 백신, 사독 백신, 제 1항의 재조합 독소원성 대장균의 유전자를 사용하여 생산한 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 돼지 식중독 예방용 백신 조성물.
10. 삭제

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