CN100500689C - 酸枣仁皂苷a和b的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用高速逆流色谱法从酸枣仁皂苷提取物(正丁醇萃取的酸枣仁粗品原料或该粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70%乙醇：水洗脱组分)中分离制备出高纯度单体酸枣仁皂苷A和B的方法。其特点是两相体系为含水溶剂体系；所用的溶剂可为正构烷烃、醚类、脂肪酯、脂肪醇、脂肪酮、水等溶剂。含水溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自石油醚，正己烷、正戊烷等正构烷烃或乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类。B组分可选乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮。C组分为水。其适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备单体酸枣仁皂苷A和B，能直接进大量粗品或合成混合物，分离效果能达到很高的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从酸枣仁粗提物中分离制备出高纯度单体酸枣仁皂苷A和B的制备分离方法。
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.Var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.chou的干燥成熟种子。酸枣仁为中国药典收载的首选养心安神中药，有补肝、宁心、敛汗、生津之功效，主要用于治疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗和津伤口渴。《神农本草经》列为上品，《本草纲目》列为本部类，《中药学》教科书中列为养心安神药类。临床用药及药理实验均证明酸枣仁具有显著的镇静催眠作用。随着社会的发展，人们工作生活的压力越来越大，随之产生的焦虑、失眠等症状也不断地困扰着人们的正常生活，对于养心安神药的研究和开发就日益迫切。其中酸枣仁皂苷A及B为其镇静催眠的有效成分之一。
现有文献报道采用柱层析及高效液相色谱的方法分离，经反相硅胶柱，碳十八柱，及Sephadex LH-20柱从正丁醇萃取后粗品分离获得酸枣仁皂苷A，或者经反复多次硅胶柱分离获得酸枣仁皂苷A、B，工艺繁琐，成本高，回收率低。逆流色谱分离制备方法可以达到高纯度，成本低，回收率高，优于传统的柱层析及高效液相色谱分离方法在两方面，一方面没有固态支持体无不可逆吸附损失，另一方面粗品可以直接上柱。由于高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是近些年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题---样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱法进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。逆流色谱仪能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，甚至能直接接质谱仪等仪器，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是以正丁醇萃取的酸枣仁粗品为原料或采用大孔树脂从含量仅为0.3％的酸枣仁皂苷A和B提高到50％左右为原料，然后高速逆流色谱的方法得到纯度95％以上的酸枣仁皂苷A和B。本发明的方案是：正丁醇萃取的酸枣仁粗品原料或该粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分通过逆流色谱法分离制备高纯度酸枣仁皂苷A和B：选择溶剂的两相组合，可选用的两相体系为含水溶剂体系。含水溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自石油醚，正己烷、正戊烷等正构烷烃或乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类。B组分可选乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮。C组分为水。
采用含水溶剂体系，以上相为固定相，下相为流动相，在保证上下相体积比小于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A∶B∶C三组分的体积比：10-5∶1∶10-5，经过一次逆流分离得到酸枣仁皂苷A和B。
实验条件适合室温15-30℃，室温对分离效率影响不大。在上述温度范围内，室温较高时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对酸枣仁皂苷A和B峰形无影响。
首先按体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用分析型或半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，2mL或20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40或240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。将酸枣仁皂苷粗提物或通过大孔树脂乙醇梯度洗脱获得(70％乙醇：水)洗脱组分溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为500-1000rpm(半制备型仪器转速)1500-2000rpm(分析型仪器转速)，以0.5-3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，得到固体。
用本方法提取的酸枣仁皂苷A和B其纯度可达到95％以上。适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备酸枣仁皂苷A和B单体，能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度。
具体实施方式
实施例1：
选取正己烷-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化酸枣仁皂苷提取物(正丁醇萃取的酸枣仁粗品原料或该粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分)，首先按8∶1∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取300mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品原料溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％左右。
实施例2：
选取乙酸丁酯-甲醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物。先按5∶1∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取100mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分溶解于20mL流动相中待用，进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到97％左右。
实施例3：
取乙酸乙酯-甲醇-水组分在分析型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物。首先按10∶1∶10体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用分析型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，1mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取15mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品溶解于1mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为1600rpm，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％以上。
实施例4：
选取乙酸乙酯-乙腈-水在半制备型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物，首先按6∶1∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取370mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到97％左右。
实施例5：
选取乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物。首先按5∶1∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取360mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％左右。
实施例6：
选取乙酸异丙酯-乙腈-水在半制备型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物，首先按6∶1∶6体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取365mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，得到黄色固体，其HPLC纯度达到97％左右。
实施例7：
选取石油醚-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离酸枣仁皂苷提取物，首先按7∶1∶7体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取300mg正丁醇萃取的酸枣仁粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，得到黄色固体，其HPLC纯度达到97％左右。
Claims (6)
1.一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：它是采用逆流色谱法从酸枣仁皂苷提取物中分离制备出高纯度酸枣仁皂苷A和B，其溶剂可为正构烷烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、腈类、醚类、水，溶剂的组分可由其中的三个组分构成；
其中所述的酸枣仁皂苷提取物是正丁醇萃取的酸枣仁粗品原料或该粗品采用大孔树脂通过乙醇梯度洗脱获得70％乙醇：水洗脱组分。
2.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：其三个组分构成的含水溶剂体系是由正构烷烃或脂肪酯、乙腈或脂肪醇或脂肪酮、水构成，体积比依次为：10-5:1:10-5。
3.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：正构烷烃是正己烷、正庚烷、正戊烷。
4.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：脂肪醇、脂肪酮是：甲醇、乙醇、丙酮。
5.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：脂肪酯是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯。
6.根据权利要求1所述的一种酸枣仁皂苷A和B的分离制备方法，其特征在于：醚类是***、石油醚、甲基叔丁基醚。
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