WO2012115298A1 - 양수 유래 줄기세포를 함유하는 요실금 치료제 - Google Patents

양수 유래 줄기세포를 함유하는 요실금 치료제 Download PDF

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stem cells
cell
amniotic fluid
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임정옥
권태균
전소영
제이 유제임스
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경북대학교병원
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Definitions

  • the present invention is a sphincter regenerative cell therapy containing amniotic fluid derived stem cells, and more specifically, it is a urethral sphincter regenerative cell therapy comprising amniotic fluid derived stem cells.
  • the present invention also relates to an incontinence cell therapeutic agent comprising amniotic fluid-derived stem cells.
  • the cell therapy agent of the present invention is characterized in that it is prepared in a formulation for injection.
  • the amniotic fluid-derived stem cells of the present invention may be injected into a hydrogel complex.
  • the present invention relates to an optimal medium for inducing differentiation of amniotic stem cells into myocytes, and more particularly includes 5-azaC or TGF- ⁇ , more preferably skeletal muscle supernatant in the basal muscle differentiation medium.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Totipotent stem cells pluripotent stem cells, Can be classified as multipotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8 cells after fertilization of eggs and sperm have these properties. Transplantation can result in one complete individual. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer.The inner cell mass inside the blastocyst appears 4-5 days after fertilization. It is called embryonic stem cells and differentiates into a variety of other tissue cells but does not form new life. Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into specific cells that form tissues and organs that contain these cells.
  • Pluripotent stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002) and subsequently identified in other adult tissues (CM Verfaillie, Trends Cell Biol., 12: 502, 2002).
  • bone marrow is the most widely known source of stem cells, but pluripotent stem cells have also been identified from skin, blood vessels, muscle and brain (JG Toma et al., Nat. Cell Biol., 3: 778, 2001; M Sampaolesi et al., Science, 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30: 896, 2002).
  • stem cells in adult tissues such as bone marrow are very rare, and these cells are difficult to culture without induction of differentiation, making them difficult to culture without specifically screened media. That is, it is very difficult to separate stem cells and preserve them in vitro.
  • Amniotic stem cells in humans surrounding the fetus can be easily obtained during pregnancy and childbirth, are able to proliferate in large quantities, and do not form tumors when transplanted into animals, such as embryonic stems. It is a promising stem cell with very high potential for cell therapy because there is no ethical problem.
  • As a cell source autologous muscle tissue, bone marrow, fat, bone, etc. are used, but most stem cells are collected by invasive methods and are accompanied by a restraint caused by bleeding, infection, or damage to organs. have. Amniotic stem cells can be easily obtained during the pregnancy test and during childbirth, are capable of proliferating in large quantities, and do not require immunosuppressive agents.
  • female urinary incontinence is caused by sagging of the urethra and bladder resulting from weakened support of the pelvic muscles caused by damage to the genital nerves due to fertility and old age.
  • the number of female incontinence patients is estimated to be between 4 and 5 million, and the number of patients is increasing every year due to the rapid increase in elderly women.
  • women's incontinence has emerged as one of the most serious social problems worldwide.
  • Injection therapy or surgery and injection therapy to support the urethra and bladder are used to treat incontinence patients.
  • Current surgery has the problem that complications can occur in an invasive way, and injection therapy is a expensive material that can not be easily used in patients, and the success rate is only 50-60%, requiring re-injection and reoperation. There is this.
  • Stem cell injection therapy does not require anesthesia and can be easily injected into the urethral sphincter, so urinary incontinence can be a good indication of stem cell therapy if stem cell injection can improve the contractile force of the urethral sphincter and increase the urinary leak pressure. There will be.
  • Urinary sphincter regenerative cell therapy using stem cells has been actively applied to urinary incontinence therapy research.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2009-0056925 discloses treatment of urinary incontinence using adipose derived stem cells
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2010-0018655 discloses treatment of sphincter disorders including differentiated immature fat cells. There is no satisfactory therapeutic effect.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a urinary incontinence drug, and confirmed that the amniotic fluid-derived stem cells are effective in the treatment of urinary incontinence, thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a composition and method for treating sphincter disorders containing amniotic fluid derived stem cells.
  • the present invention provides a composition for treating sphincter disorders, including amniotic fluid-derived stem cells.
  • the composition of the present invention can be utilized for the purpose of treating incontinence.
  • amniotic fluid-derived stem cells of the present invention may be injected with a mixed hydrogel complex to further increase the in situ differentiation effect in the affected area.
  • Cell-type hydrogel of the present invention can be injected into the body simply by incorporating the stem cells without surgical surgery, by helping the cells stay in one place in the body to differentiate or organize the cells in the body Promoted.
  • the hydrogel of the present invention comprises an alginate / PF-127 / hyaluronic acid complex.
  • the mixing ratio of each polymer in the composite is preferably 6/6/1.
  • the amount of stem cells injected in the present invention is preferably 10 5 to 10 6 cell / sphincter, and more preferably about 10 6 cell / sphincter may be injected.
  • 'stem cells' refers to master cells that can be regenerated without limitation to form specialized cells of tissues and organs.
  • Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells.
  • Stem cells can divide into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one derived ('transit') cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.
  • the term "differentiation” refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and proliferate and grow, that is, a cell or tissue of an organism has a shape or function to perform a task given to each. It means to change.
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems. For example, qualitatively between parts of a biological system that were initially nearly homogeneous, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in population development, or cells such as myocytes or neurons. Phosphorus difference, or as a result, is a state divided into subclasses or subclasses that can be distinguished qualitatively.
  • the term 'cell therapeutic agent' is a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture and special chewing from humans, and functions of cells or tissues. It refers to a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and screening live autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or otherwise changing the biological properties of the cells in order to restore them.
  • Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to amniotic fluid-derived stem cell therapy.
  • the inventors of the present invention by directly injecting the amniotic fluid stem cells into the urinary incontinence animal model and performed experiments on whether stem cells are differentiated into the muscle in the body to restore muscle function that can control urinary incontinence and completed the present invention.
  • Injectable introduction of stem cells and evaluation of in situ differentiation capacity performed in the present invention have clinical significance, which means that the injected amniotic stem cells undergo only minimal process of in vitro propagation without genetic manipulation or differentiation treatment. It was performed simply by injection without invasive procedures such as surgery, because it was proved that the injected stem cells could be in situ differentiated into the target tissue urethral sphincter.
  • various kinds of cell culture medium for differentiating amniotic fluid stem cells into muscle were used.
  • a conditioned medium obtained from human bone abscess culture medium
  • Urinary function was restored, but better recovery was observed when cells were injected into the alginate / pluronic acid / hyaluronic acid complex hydrogel and injected into the affected area.
  • three differentiation media were used for the induction of myocyte differentiation of amniotic stem cells, and the differentiation capacity was evaluated by morphological, genetic, and immunochemical methods.
  • a medium consisting of 5-azaC or TGF-ß was added to the basal muscle differentiation medium and a medium consisting of human skeletal muscle supernatant. Based on cell proliferation, gene and protein expression related to myocyte differentiation, supernatant medium was evaluated as the most suitable medium for amniotic fluid stem cell differentiation.
  • amniotic fluid stem cells have differentiation ability to myocytes, high efficiency in differentiation into human skeletal muscle supernatant, and significant in situ differentiation potential in combination with hydrogel.
  • compositions containing amniotic fluid stem cells of the present invention can be directly injected into the urinary incontinence individual stem cells are differentiated into the muscles in the body can effectively control the urinary incontinence to restore muscle function.
  • Amniotic fluid stem cells of the present invention can be differentiated into in situ muscles in vivo, and cells can be differentiated into muscles to restore function.
  • functional recovery may be further improved when cells are injected together in a biocompatible cell-injectable hydrogel of the present invention.
  • A is antigen markers expressed by cells from human amniotic fluid
  • B is c-kit positive for more than 90% of the second class c-kit (+) cells.
  • FIG. 2 shows myocyte potential of hAFSCs in vitro.
  • A is morphological change under different myogenic conditions
  • B is cell survival rate through CCK8 analysis
  • C is positive for stem cell and early myogenic marker expression after culture
  • D is double staining of first antibody and nucleic acid staining DAPI in culture cells
  • E relates to the regulation of differentiation into myoblasts.
  • Figure 3A is a visualization of the residual, migration and maintenance of the injected hAFSCs
  • B for the urethral sphincter regeneration effect of the injected cells C is histological analysis of the urethral sphincter regeneration
  • D is Nestin, MyoD
  • Immunohistochemical analysis of ⁇ -SM actin and ⁇ -actinin shows E-real-time PCR analysis
  • F shows the result of myogenic gene expression analysis using mouse primer.
  • Figure 4 shows the functional immunoassay results of hAFSCs
  • A is the surface phenotype analysis results
  • B is the immunohistochemical staining of the urethral sphincter section for CD8 active lymphocytes.
  • FIG. 5 relates to Confocal laser scanning microscopic image of hAFSCs labeled with MNPs @ SiO 2 (RITC), where A is the result of imaging according to different concentrations of MNPs @ SiO 2 (RITC), and B is labeled hAFSCs of whole cells. Where C is the cytotoxicity result of MNPs @ SiO 2 (RITC) and D is the optical image of nanoparticle-labeled hAFSCs.
  • Figure 6 is a graph showing the results of significantly improved LLP and CP of heterologous hAFSCs.
  • Figure 7 is a graph showing the results of significantly improved LLP and CP hAFSCs mixed with a hydrogel containing alginate, pluronic acid and hyaluronic acid.
  • Consent was obtained from women who underwent conventional amniotic membrane puncture at 15 to 19 weeks of gestation.
  • Amniotic fluid containing cells was incubated with Amino MAXTMII (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY) for at least two weeks in a cover glass.
  • Amino MAXTMII Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY
  • cells were cultured at 5% CO 2 atmosphere, 37 ° C in Chang Medium (a-MEM, 15% ES-FBS, 1% glutamine and 1% penicillin / streptomycin, Gibco), 18% Cultured on Petri dishes with Chang B and 2% Chang C (Irvine Scientific, Irvine, Calif.). Cells were maintained at 70-80% confluence without the feeder layer.
  • Embryonic stem cells c-kit, SSEA-4, Oct-3 / 4
  • mesenchymal stem cells CD44, CD45, CD73, CD90, CD105
  • immunogenic markers HLA-ABC, DR
  • Isotype immunoglobulin of each antibody was used as an intrinsic control.
  • Stem cell groups were separated by c-kit antibody.
  • c-kit (+) cells were cultured on Petri dishes in Chang Medium and then maintained up to 4 passages. These cells were reclassified as c-kit and called human amniotic stem cells (hAFSCs).
  • muscle-induced medium (0.5% chick embryo extract, 10% horse serum, 1% penicillin / streptomycin) treated with 5-aza-20-deoxycytidine (5-azaC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) of 3 , DMEM low glucose, all from Gibco-Invitrogen
  • muscle induced medium treated with TGF-ß (5ng / ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) and
  • condition medium CM
  • hAFSCS was seeded in culture medium at a density of 3,000 cells / cm 2 and incubated for 24 hours in Chang medium. The medium was then replaced with muscle induced medium. After 24 hours of culture, the muscle induction medium was replaced with myocyte culture medium. Cells were grown up to 14 days for analysis. For 5-azaC conditions, Matrigel pre-coated dishes (BD Biosciences) were used.
  • ICC ICC
  • cultured cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 5 minutes. After washing three times with PBS, cells were incubated with 5% BSA for 1 hour to prevent non-specific antibody binding, incubated overnight at 4 o C with primary antibody, washed three times with PBS and 2 at room temperature. Incubated with primary antibody for 1 hour.
  • Antibodies were Nestin, MyoD, ⁇ -SM actin, ⁇ -actinin (all Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) and Desmin (BD Biosciences). Secondary antibodies bound to Alexa Fluro594 immunofluorescence were washed with PBS after 30 min application.
  • Samples were mounted in ProLongGold antifade reagent (Invitrogen) containing 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) for nuclear staining.
  • C2C12 cell line was used as a positive control, human fibroblasts as a negative control.
  • mice were treated according to the National Institutes of Health Animal Care Guidelines, which were approved by the Animal Ethics Committee of Kyungpook National University Medical School. All experiments were performed using 4-week old (2025 mg) female ICR mice. Prior to surgical damage of the urethral sphincter, abdominal leak point pressure (LPP) and closing pressure (CP) were measured. Immediately, anesthesia was induced by intramuscular injection of 30 Zoletil (30 mg / kg, virbac animal health, France) and Rumpun (10 mg / kg, Bayer, Korea). Lower midline abdominal incisions were performed and genital nerves on both sides were identified. Bilateral genital nerves were transectioned using surgical scissors under a microscope.
  • LPP abdominal leak point pressure
  • CP closing pressure
  • HAFSCs (1 ⁇ 10 6 ) prepared using 26G Hamilton microsyringe (Hamilton Company, Reno, NV) attached with microscopic guidance were injected.
  • the test group was divided into three groups: a mock cut-out and a cell-injected control group, Ctrl; Cell nerve cutting and saline injection, Cell (-) and hAFSC injection after nerve cutting, Cell (+).
  • Alginate solution (3%) was prepared by dispersing 300 mg of alginic acid sodium salt in 10 ml of PBS (pH 7.4), followed by complete mixing using a homogenizer. To prepare a Pluronic F-127 (PF-127) (25%) solution, stir was dispersed with 5 g of polymer in 20 ml of PBS. The partially dissolved PF-127 solution was stored using a 0-4 ° C. refrigerator or ice-bath until the entire polymer was completely dissolved. 20 ⁇ g of hyaluronic acid was dissolved in 1000 ⁇ l of distilled water. The mixing ratio of alginate / PF-127 / hyaluronic acid was 6/6/1.
  • the mixture was homogeneously mixed for 5 minutes and left in the refrigerator for 6 hours.
  • sodium hyaluronate was prepared by dispersing 100 mg in 10 ml of PBS.
  • 100 mg of 50 ml of PBS was dispersed to prepare Ca 2+ (CaCl 2 , 0.2%).
  • 1 ⁇ 10 6 amniotic stem cells were added to alginate / PF-127 / hyaluronic acid with slow mixing.
  • LPP Leak point pressure
  • CP closing pressure
  • urethra was obtained each time.
  • Infused human cells were identified using anti-human nuclear antibodies (HuNu, Chemicon) and analyzed for stem / myogenic lineage cells present in the urethral sphincter. To identify the appropriate cell number for infusion, 10 4 , 10 5 and 10 6 cells / sphincters were used. Optimal cell numbers were selected through analysis of stem and myogenic antibodies (Nestin, MyoD, ⁇ -SMA). Through histological analysis, tumor formation in vivo was also observed. Differentiation of injected hAFSCs into myocytes was confirmed by real-time PCR using human primers, and the host response required for cell cell therapy was measured using mouse myogenic primers.
  • IHC immunohistochemistry
  • Magnetic nanoparticles were used to track the injected hAFSCs.
  • Cobalt ferrite silica coreshell nanoparticles containing RITC [MNPs @ SiO 2 (RITC)] were provided by Dr. Jae-Sung Bae (Kyungpook National University, Daegu, Korea).
  • hAFSCs (10 4 ) were incubated in 24 wells to reach about 70% confluence and then MNPs @ SiO 2 (RITC) was added for 24 hours.
  • the concentration range was set to 0.01, 0.05, 0.1 or 0.2 mg / mL.
  • ICC Time-dependent labeling efficiency assessment
  • ICC was performed every 6 hours, and the location in the vesicles of MNPs @ SiO 2 (RITC) was measured.
  • MNPs @ SiO 2 (RITC) 0.1 mg / mL
  • Labeled cells were passaged up to seven passages to determine the rate maintained when going to the next passage.
  • FIG. 1A Human amniotic cells expressed embryonic stem cell markers such as Oct-4, c-kit and SSEA-4, which are interpreted to have pluripotential capacity. They were positive for mesenchymal stem cells, neural stem cells and / or endothelial progenitor markers (CD44, CD73, CD90 and CD105) while negative for hematopoietic lineage markers (CD45). For immune response markers, cells were negative for Class II major histocompatibility antigen (HLA-DR). The first sorted c-kit (+) cell population was 0.65.0% of the total cell population. The second sorted c-kit (+) cells were more than 90% positive for c-kit (FIG. 1B).
  • HLA-DR Class II major histocompatibility antigen
  • stem and myogenic lineage markers in three different media showed varying gene expression intensities. At 3 days after incubation, increased stem cell and early myocyte marker expression could be seen, and on day 7 markers that were expressed mid or late (late) were markedly identified. These results indicate that hAFSCs could be differentiated according to myogenic lineage in the proposed medium. Although the groups treated with 5-azaC and TGF-ß showed relatively increased gene expression, CM medium is considered an appropriate myogenic condition for hAFSCs given the viability of the cells. To confirm gene expression results, immunohistochemical staining (immunohistochemical, IHC) was performed (FIG. 2D).
  • hAFSCs More than 90% of cultured hAFSCs were positively stained for myogenic markers.
  • Nestin a stem cell marker, was expressed throughout the culture period. Cells cultured on day 3 expressed myogenic markers simultaneously. On day 7, the initial markers MyoD and Desmin gradually weakened, whereas the late expression markers ⁇ -SM actin and ⁇ -actinin were expressed more than before. Characteristically, the cells expressed prominent ⁇ -actinin labeled thick filaments in the cytoplasm and spindle-shaped cells were found in the CM-treated group.
  • C2C12 cell line was used as a positive control for differentiation into myoblasts and human fibroblast was used as a negative control (FIG. 2E).
  • Human nucleus Antibodies specific to the human nucleus (HuNu) were used to confirm the persistence, migration and maintenance of the injected human cells.
  • Human nuclei stained with anti-HuNu were matched with in vitro DAPI (FIGS. 3A-A). No in vivo presence of human nuclei injected from the urethral sphincter was found (FIGS. 3A-B). Positive staining was found locally at the injection site on day 3, and the intensity gradually decreased and lasted for up to 14 days. In the PBS-infused urethral sphincter, no HuNu-positive cells were found in the cell wall.
  • Mouse urethral sphincter included smooth muscle and skeletal muscle (Fig. 3C-a).
  • the urethral sphincter area injured by neurotomy was identified as atrophic tissue, such as contracted muscle, and had little or no smooth muscle and straight muscle layer structure at 2 and 4 weeks (FIGS. 3C-b, c).
  • Groups injected with cells showed recovery of circular muscle mass and thick packed layers ( Figures 3C-d, e).
  • the transplanted organ retained normal urethral sphincter-shaped fragments and effects for 4 weeks.
  • Increased urethral sphincter in all experimental groups was considered evidence of complete muscle regeneration.
  • IHC was used to identify stem cells and myogenic markers.
  • cells injected with cells increased Nestin, MyoD and ⁇ -SM, and ⁇ -actinin positive cells formed layered muscle structures showing normal urethral sphincter structure (FIG. 3D).
  • the cell (+) group had decreased early markers (Nestin and MyoD) expression on smooth and striated muscle layer, and continued to be followed by late markers ( ⁇ -SM and ⁇ -actinin) positive cells. Maintained.
  • the cell (-) group expressed weakly these proteins.
  • Human stem cells injected in real-time PCR analysis continuously expressed genes associated with myogenic lineage (FIG. 3E). Gene expression using human primers initially increased relatively, but gradually decreased over time.
  • hAFSCs influence host cell differentiation in an unclear mechanism.
  • hAFSCs surface phenotypes of hAFSCs were analyzed using phycoerythrin-conjugated antibodies against HLA-DR. hAFSCs expressed HLA-DR weakly (0.26 2.29%) and had small changes but no significant difference in surface phenotype compared to the sample (FIG. 4A). The mean percentage of positive cells was lower than isotype Ab control. hAFSCs were injected into the mouse urethral sphincter and activated CD8 lymphocytes were stained 1 week after injection (FIG. 4B). In the group injected with cells, CD8 lymphocytes (red) were observed to show a significantly weaker response at the site of injection, suggesting that hAFSC did not cause an immune response. On the other hand, the urethral sphincter with nerve removed and injected with human fibroblasts showed a significant CD8 lymphocyte response.
  • the optimal concentration of MNPs @ SiO 2 (RITC) for hAFSC was determined at 0.2 mg / ml, providing sufficient images in vitro using a fluorescence microscope (FIG. 5A). Signal intensity increased with time, peaked at 24 hours, and there was no significant change in intensity until 72 hours. Looking at the efficiency label at 24 hours, 94.31% of the cells in the total group showed a RITC signal (FIG. 5B). Nanoparticles were located in the cytoplasm and were clearly distinguished by a merged image. HAFSCs viability using the MTS cell proliferation assay showed that cells treated with 0.01, 0.05, 0.1 and 0.2 mg / mL MNPs @ SiO 2 (RITC) for 24, 48 and 72 hours showed similar survival rates over four periods.
  • MNPs @ SiO 2 (RITC) does not cause cytotoxicity in hAFSCs (FIG. 5C).
  • MNPs @ SiO 2 (RITC) -labeled cells were injected into the urethral sphincter (1 ⁇ 10 6 cells). The optical image expressed a signal to the right of the injected area, labeled cells, while not expressing control and unlabeled cells. Over time, signal strength slowly decreased and was detected by day 10 (FIG. 5D).
  • LLP of Ctrl, Cell (-) and Cell (+) groups was 30.25 ⁇ 2.56 cmH 2 O, 16.55 ⁇ 2.10 cmH 2 O and 17.90 ⁇ 0.49 cmH 2 O, CP was 19.45 ⁇ 2.67, 9.13 ⁇ 0.87 And 9.88 ⁇ 1.34.
  • LLP was 28.67 ⁇ 0.72, 11.59 ⁇ 1.18 and 18.06 ⁇ 2.78 cmH 2 O, and CP was 16.99 ⁇ 2.20, 6.85 ⁇ 1.09 and 12.42 ⁇ 1.71.
  • LLP was 27.59 ⁇ 3.64, 15.24 ⁇ 2.10 and 20.24 ⁇ 3.25 cmH 2 O, and CPs were 15.38 ⁇ 1.64, 8.35 ⁇ 1.10 and 14.4 ⁇ 3.40.

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Abstract

본 발명은 양수 유래 줄기세포를 함유하는 괄약근 재생 세포치료제, 더 구체적으로는 양수 유래 줄기세포를 포함하는 요도 괄약근 재생 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 상기 세포치료제는 주사형 도입을 위한 제형으로 제조될 수 있으며 하이드로겔 (hydrogel) 복합체에 주입되어 그 효과가 증대될 수 있다. 본 발명의 양수 줄기세포를 포함하는 조성물은 요실금 개체에 직접 주사하여 줄기세포가 체내에서 근육으로 분화되어 요실금을 효과적으로 제어하여 근육 기능을 회복할 수 있다. 즉, 본 발명의 양수 줄기세포는 in situ 근육으로 분화되고, 세포만으로도 근육으로 분화되어 기능이 회복될 수 있다.

Description

양수 유래 줄기세포를 함유하는 요실금 치료제
본 발명은 양수 유래 줄기세포를 함유하는 괄약근 재생 세포치료제로서, 더 구체적으로는 양수 유래 줄기세포를 포함하는 요도 괄약근 재생 세포치료제이다. 또한, 본 발명은 양수 유래 줄기세포를 포함하는 요실금 세포 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 상기 세포치료제는 주사형 도입을 위한 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다. 또한, 더 바람직하게는 본 발명의 양수 유래 줄기세포는 하이드로겔 (hydrogel) 복합체에 주입될 수 있다.
또한, 본 발명은 양수 줄기세포의 근세포로의 분화를 유도하는 최적의 배지에 관한 것으로, 더 구체적으로는 기본 근 분화배지에 5-azaC 또는 TGF-β, 더 바람직하게는 골격근 상층액을 포함한다.
줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cells), 전능성(전분화능) 줄기세포 (pluripotent stem cells), 다능성 (다분화능) 줄기세포 (multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포 (totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성(다능성) 줄기세포 (multipotent stem cells)는 이세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.
다능성 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고 (Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다 (C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다능성 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다 (J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기 세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
태아를 둘러싸고 있는 사람의 양수줄기세포는 임신 중에 그리고 출산 때에 손쉽게 얻을 수 있고 대량으로 증식이 가능하고 배아줄기처럼 동물에 이식하였을 때 종양을 형성하지 않는 점이 매우 중요한 장점이며 특히, 배아줄기세포가 가진 윤리적인 문제가 없어 세포치료에 쓰일 수 있는 가능성이 매우 높은 유망한 줄기세포이다. 세포원으로 자가 근조직, 골수, 지방, 뼈 등이 이용되고 있으나 대부분 침습적 방법으로 채취되어 출혈, 감염, 채취장기의 손상 등에 의한 휴유증이 수반되어 비침습적인 방법으로 얻을 수 있는 줄기세포원이 요구되고 있다. 양수줄기세포는 임신시 검사과정과 출산 때 손쉽게 얻을 수 있고 대량으로 증식이 가능하고 비면역원성으로 면역억제재가 필요하지 않다. 배아줄기세포와 비교하였을 때, 동물에 이식시 종양을 형성하지 않고, 채취에 윤리적인 문제가 없으며, 전분화능을 지니고 있어 궁극적으로 인체 모든 장기로 분화가 가능하므로 질병치료에 이상적인 줄기세포원이라 할 수 있다.
한편, 여성 요실금은 다산과 노령으로 인한 음부신경의 손상으로 인한 골반근육의 지지 약화에서 오는 요도 및 방광의 처짐이 원인이 된다. 현재 국내 여성 요실금 환자 수는 400~500만 명으로 추정되며, 노년층 여성의 급격한 증가로 인하여 매년 환자수가 증가 추세에 있다. 이에 현재 여성 요실금은 전 세계적으로 발생하는 심각한 사회적 문제의 하나로 대두되고 있다. 요실금 환자를 치료하기 위해 주사요법이나 요도 및 방광을 지지하기 위한 수술요법과 주사요법이 사용되고 있다. 현재 수술요법은 침습적인 방법으로 합병증이 발생할 수 있다는 문제점이 있고, 주사요법은 고가 물질이어서 환자에게 용이하게 쓰일 수 없을 뿐만이 아니라, 성공률이 50~60% 밖에 되지 않아 재주사 및 재수술이 요구되는 문제점이 있다.
줄기세포 주사치료는 마취가 필요하지 않고 손쉽게 요도괄약근에 주사할 수 있어, 줄기세포 주사요법이 요도괄약근의 수축력을 향상시키고 요누출압을 증가시킬 수 있다면 요실금은 줄기세포치료의 좋은 적응증이 될 수 있을 것이다.
이러한 줄기세포를 이용한 요도괄약근 재생 세포치료는 최근 요실금 치료 연구에 활발하게 응용되고 있다. 대한민국 공개특허 제10-2009-0056925호에서는 지방 유래 줄기세포를 이용한 요실금의 치료에 대하여, 대한민국 공개특허 제10-2010-0018655호에서는 분화된 미성숙 지방세포를 포함하는 괄약근 장애 치료에 대하여 개시하고 있지만 만족할 만한 정도의 치료효과를 보이고 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 요실금 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 양수 유래 줄기세포가 요실금의 치료에 효과적이라는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 양수 유래 줄기세포를 함유하는 괄약근 장애를 치료하기 위한 조성물 및 치료방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 양수 유래 줄기세포를 괄약근 장애 부위에 직접 주사하여 상기 줄기세포의 근육세포로의 in situ 분화가 일어나 괄약근의 재생을 촉진시킬 수 있는 주사형 제제를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 양수 유래 줄기세포를 포함하는 괄약근 장애를 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 상기 조성물은 요실금을 치료하기 위한 용도로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 양수 유래 줄기세포는 하이드로젤 복합체 혼합되어 주입되어 환부에서의 in situ 분화 효과가 더 증대될 수 있다. 본 발명의 세포주사형 하이드로겔은 상기 줄기 세포를 합입하여 외과적인 수술없이 간단하게 세포를 체내로 주입할 수 있고, 세포가 체내의 한 장소에 머물 수 있도록 도와줌으로써 체내에서 세포가 분화되거나 조직화되는 것을 촉진시키게 된다. 바람직하게는, 본 발명의 하이드로겔은 알지네이트/PF-127/히알루논산 (alginate/PF-127/hyaluronic acid) 복합체를 포함한다. 또한, 상기 복합체에서 각 고분자들의 혼합비율은 6/6/1이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 주입되는 줄기세포의 양은 105 내지 106 cell/sphincter 이 바람직하며, 더 바람직하게는 약 106 cell/sphincter 이 주입될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 양수 유래 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 발명자는 양수줄기 세포를 요실금 동물모델에 직접 주사하여 줄기세포가 체내에서 근육으로 분화되어 요실금을 제어할 수 있는 근육 기능을 회복하는 지에 대한 실험을 수행하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 실시한 줄기세포의 주사형 도입과 제자리 (in situ) 분화능 평가는 임상적으로 중요한 의미를 지니고 있는데, 이는 주입된 양수줄기세포가 유전자 조작이나 분화처리 등의 과정 없이 체외증식의 최소 과정만 실시하였고, 수술 등의 침습적 과정 없이 주사형으로 간편히 시술하였으며, 주입된 줄기세포가 목표 조직인 요도괄약근으로 제자리 분화가 가능함을 입증하였기 때문이다.
또한, 본 발명에서 양수 줄기세포를 근육으로 분화시키기 위한 세포배양액으로 여러 가지를 사용하였고, 그 가운데 조건 배지 (conditioned medium) (사람 골결근 배양 배지에서 얻어짐)이 가장 좋았고, 세포만을 넣은 경우도 요기능이 회복되었지만, alginate/pluronic acid/hyaluronic acid 복합체 hydrogel 에 세포를 넣어 손상된 부위에 주사하였을 때 더 나은 기능회복이 확인되었다.
또한, 본 발명에서 생체외 실험으로 양수 줄기세포의 근세포 분화유도는 세 가지 분화배지를 사용하였으며 분화능은 형태학적, 유전적, 면역화학적인 방법으로 평가하였다. 최적 분화 조건을 찾기 위해 기본 근분화배지에 5-azaC 또는 TGF-ß를 첨가한 배지와 사람골격근 상층액으로 이루어진 배지를 사용하였다. 세포 증식율, 근세포 분화에 관련된 유전자와 단백질 발현에 기초한 결과에서 상층액 배지가 양수 줄기세포 분화에 가장 적합한 배지로 평가되었다.
본 발명에서는 요실금 모델 쥐를 이용한 생체 내 실험으로, 미분화상태 양수 줄기세포를 하이드로젤과 접목시켜 근기능이 약화된 요도괄약근에 주입하였다. 양성대조군은 가성 수술군, 음성대조군은 비세포처리군과 하이드로젤을 접목하지 않은 세포단독군으로 하였다. 각 군의 동물은 술후 1, 2, 4주에 요역동학적 실험 요소인 요도폐쇄압과 요누출압을 측정하였고, 조직학적인 분석을 통해 요도괄약근 재건을 평가하였다. 실험군은 대조군에 비해 유의적인 요도폐쇄압과 요누출압 회복을 보였으며, 조직학적인 검사에서도 양수 줄기세포의 생착, 주변 근세포로의 분화를 관찰하였다. 따라서 양수 줄기세포는 근세포로의 분화능을 가지고 있으며, 사람골격근 상층액으로 분화시 효율이 높고, 하이드로젤과 접목하면 유의적인 생체 내 제자리 분화능을 확인하였다.
본 발명의 양수 줄기세포를 포함하는 조성물은 요실금 개체에 직접 주사하여 줄기세포가 체내에서 근육으로 분화되어 요실금을 효과적으로 제어하여 근육 기능을 회복할 수 있다. 본 발명의 양수 줄기세포는 생체 내에서 제자리 (in situ) 근육으로 분화되고, 세포만으로도 근육으로 분화되어 기능이 회복될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체적합한 세포 주사형 하이드로겔 (hydrogel)에 세포를 같이 주입하였을 경우 기능회복이 더 향상될 수 있다.
도 1은 FACS에 의한 hAFSCs의 특성에 관한 것이다. A는 사람 양수로부터 유래한 세포들에 의해 발현된 항원 마커들, B는 제2분류 c-kit(+) cells들이 90% 이상의 c-kit 양성을 보임.
도 2는 생체 외에서 hAFSCs의 근육세포 잠재성을 보임. A는 다른 근원성 조건에서 형태학적 변화, B는 CCK8 분석을 통한 세포 생존율, C는 배양 후 줄기세포 및 초기 근원성 마커발현 양성을, D는 배양세포에 제1 항체 및 핵산 염색 DAPI의 이중 염색을, E는 근아세포 (myoblast)로의 분화 조절에 관한 것임.
도 3A는 주입된 hAFSCs의 잔존, 이동 및 유지를 시각화한 것이며, B는 주입된 세포가 나타내는 요도 괄약근 재생효과에 대하여, C는 요도 괄약근 재생에 대한 조직학적 분석결과를, D는 Nestin, MyoD, α-SM actin 및 α-actinin에 대한 면역조직화학적 분석결과를, E는 Real-time PCR 분석결과 및 F는 마우스 프라이머를 이용한 근원성 유전자 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 hAFSCs의 기능적 면역분석결과를 나타낸 것으로, A는 표면 표현형 분석결과를, B는 CD8 활성 림프구에 대한 요도 괄약근 섹션의 면역조직화학 염색결과임.
도5는 MNPs@SiO2(RITC)로 표지된 hAFSCs의 Confocal laser scanning microscopic image에 관한 것으로, A는 다른 농도의 MNPs@SiO2(RITC)에 따른 이미지 결과를, B는 전체 세포들의 표지된 hAFSCs의 비율을 나타낸 것이고, C는 MNPs@SiO2(RITC)의 세포독성 결과를, D는 나노입자-표지 hAFSCs의 광학이미지를 나타낸 것임.
도6은 이종의 hAFSCs가 LLP 및 CP를 현저히 향상시킨 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 alginate, pluronic acid 및 hyaluronic acid을 포함하는 하이드로겔과 혼합된 hAFSCs가 LLP 및 CP를 현저히 향상시킨 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 사람 양수 세포의 특성 및 AFSCs의 분리
경북대학교 의과대학의 윤리위원회는 본 연구와 사람 양수의 사용을 승인하였다.
임신 15~19주의 통상적인 양막천자를 수행한 여성으로부터 동의를 얻고 제공받았다. 세포들을 포함하는 양수를 커버 글라스에서 적어도 2주 이상 Amino MAXTMII (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY)로 배양하였다. typsin/EDTA 용액으로 세포를 떼어낸 후, 세포들을 5% CO2 분위기, 37℃에서 Chang Medium (a-MEM, 15% ES-FBS, 1% glutamine 및 1% penicillin/streptomycin, Gibco), 18% Chang B 및 2% Chang C (Irvine Scientific, Irvine, CA)로 페트리 디쉬 상에서 배양하였다. 세포들은 피더 층 없이 70~80% 컨플런시로 유지되었다.
배양된 양수 세포들 (3계대)을 다양한 표면항원과 세포 내 마커를 사용하는Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, BD Biosciences, San Jose, CA) 시스템으로 분석하였다. 세포들의 특성 파악을 위해 배아 줄기세포 (c-kit, SSEA-4, Oct-3/4), 중간엽 줄기세포 (CD44, CD45, CD73, CD90, CD105) 및 면역원성 마커 (HLA-ABC, -DR)들이 사용되었다 (모두 BD). 각 항체들의 아이소타입 면역글로불린은 내재 대조군으로 사용되었다. 줄기세포 군은 c-kit 항체로 분리하였다. c-kit(+) 세포들을 Chang Medium에서 페트리 디쉬 상에서 배양한 후, 4계대까지 유지하였다. 이들 세포들을 c-kit로 다시 분류하고, 이를 사람 양수 줄기세포 (hAFSCs)라 하였다.
실시예2: hAFSCs의 생체 내에서 근 세포로의 분화
hAFSCS를 근육세포-유사 세포로 분화시키기 위해, 3개의 다른 근 유도 배지를 사용하였다; (i) 3 의 5-aza-20-deoxycytidine (5-azaC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 처리된 근 유도 배지 (0.5% chick embryo extract, 10% horse serum, 1% penicillin/streptomycin, DMEM low glucose, all from Gibco-Invitrogen), (ii) TGF-ß (5ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ)로 처리된 근 유도배지 및 (iii) 조건 배지 (CM) (사람 골격근육 세포 배양 배지로부터 수득된).
hAFSCS를 배양 배지에 3,000 cells/cm2의 밀도로 시딩하고, Chang medium으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지는 근 유도배지로 교체하였다. 배양 24시간 후 근 유도 배지는 근세포 배양배지로 교체하였다. 세포들은 분석을 위해 14일까지 성장시켰다. 5-azaC 조건의 경우, Matrigel pre-coated dishs (BD Biosciences) 가 사용되었다.
세포의 생존율이 14일 동안 CCK-8 assay (Dojindo, Japan)로 측정하였다. hAFSC의 근세포 계열로의 유전자형 및 형태학적 변형을 real-time PCR 및 immunocytochemical (ICC) staining로 분석하였다. 유전자 발현분석을 위해, TRI Reagent(Invitrogen)을 사용하여 배양 세포들로부터 Total RNA를 추출하였다. 프라이머들은 Primer Express (Applied Biosystems, Warrington, UK)로 디자인하였다. 줄기세포 및 근세포 계열-특이적 마커 (Pax7, Myf-5, MyoD, Desmin, Dystrophin, Myogenin, α-actinin 및 α-SM actin)에 대한 서열은 표1에 나타내었다.
표 1
Gene Sequences
hOct4 5’-GGAGAATTTGTTCCTGCAGTGC5’-AGAACCACACTCGGACCACATC
hSox2 5’-TCACGCAAAAACCGCGAT5’-TATACAAGGTCCATTCCCCCG
hNanog 5’- GCATCCGACTGTAAAGAATCTTCA5’- CATCTCAGCAGAAGACATTTGCA
hSmad2 5’- GACACCAGTTTTGCCTCCAGTAT5’- TCCAGAGGCGGAAGTTCTGT
hALP 5’-ACGAGCTGAACAGGAACAACGT5’-CACCAGCAAGAAGAAGCCTTTG
hPax7 5’-GCAAATTGCTGTCCTGCTCA 5’-TGAAAACTGGTCACATCTGCCT
hMyf5 5’-ACCGATTCACAGCCTCGAACT5’-TGTGTATTAGGCCCTCCTGGAA
hMyoD 5’-ACAGCGCGGTTTTTTCCAC5’-AACCTAGCCCCTCAAGGTTCAG
hDesmin 5’- GGAGAGGAGAGCCGGATCA5’- GGGCTGGTTTCTCGGAAGTT
hDystrophin 5’- CATCACATCACTCTTCCAAGTTTTG5’- CCTTGGCAACATTTCCACTTC
hMyogenin 5’-TGGCAGGAACAAGCCTTTTC5’-ACAGGCAGGTAGTTTTCCCCA
hMEF2 5’-ATTCCACCAGGCAGCAAGAA5’-GGAGTTGCTACGGAAACCACTG
hMLP 5’-AAGGCTCTTGACAGCACGACAG5’-TGTCCATACCCGATCCCTTTG
hMHC 5’-CCAGCACCTGGGCAAGTC5’-CCACAACACCAGCATAGTGAATC
h α-SM actin 5’- CAAGTGATCACCATCGGAAATG5’- GACTCCATCCCGATGAAGGA
h β-actin 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCT5’-AAGCCATGCCAATCTCATCTTG
mPAX7-F 5’-ACCAAGCTTTCAAGTCCGCA5’-GCCTTACATTCTGGAGGATGGA
mMyf-F 5’-CTCTGAAGGATGGACATGACGG5’-ACTGGTCCCCAAACTCATCCTC
mMyoD-F 5’-TTCCGGAGTGGCAGAAAGTTAA5’-TCAAGTCTATGTCCCGGAGTGG
mMyogenin-F 5’-TATCCGGTTCCAAAGCCTCTG5’-GCGGCAGCTTTACAAACAACA
mMEF2 5’-AACCCCAATCTTCTGCCACTG5’-ATCAGACCGCCTGTGTTACCTG
mMLP 5’-GCTGAACAAGTTACTGAGCGGC5’-ATTTTGCACCTCCACCCCA
mMHC 5’-CCCCGCCCCACATCTT 5’-GATTGACTGATTCTCCCTGTCTGTT
m GAPDH 5’-TGT GTCCGTCGTGGATCTGA5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA
분석은 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 구비한 ABI Prism Sequence Detection System 7500 (PE Biosystems)로 수행하였다. 온도 사이클링 조건은 inset condition에 따랐고, 상대량은 Ct method를 사용하여 수행하였다. 결과들은 베타-액틴에 대한 비율로 정상화하였다.
ICC를 위하여, 배양된 세포들을 5분간 4% 파라포름알데히드에서 고정시켰다. PBS로 3회 세척 후, 세포들을 비-특이적 항체 결합을 막기 위해 1시간 동안 5% BSA로 배양하고, 제1차 항체로 4oC에서 밤새 배양하고, PBS로 3회 세척하고 상온에서 2차 항체로 1시간 동안 배양하였다. 항체들은 Nestin, MyoD, α-SM actin, α-actinin (모두 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 Desmin (BD Biosciences)이었다. Alexa Fluro594 immunofluorescence에 결합된 제2차 항체들은 30분간 적용한 후 PBS로 세척하였다. 샘플들을 핵 염색을 위해 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 ProLongGold antifade reagent (Invitrogen)에 마운팅하였다. C2C12 cell line을 양성 대조군으로, 사람 섬유아세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예3: 요도 괄약근의 무력화 야기 빛 hAFSCs의 주입
마우스들을 National Institutes of Health Animal Care Guidelines에 따라 처리하였고, 상기 가이드라인은 경북대학교 의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 실험들은 4-주령 (2025 mg) 암컷 ICR mice를 사용하여 수행하였다. 요도 괄약근 (urethral sphincter)의 외과적 손상에 앞서, abdominal leak point pressure (LPP) 및 closing pressure (CP)를 측정하였다. 곧바로, 30 의 Zoletil (30 mg/kg, virbac animal health, France) 및 Rumpun (10mg/kg, Bayer, Korea)을 근육 내 주사하여 마취를 유도하였다. 정중선 복부 수직절개 (lower midline abdominal incision)를 수행하고, 양쪽에 있는 음부신경을 확인하였다. 양측 음부신경을 현미경 하에서 수술용 가위를 이용하여 절단 (transection)하였다.
마이크로스코픽 가이던스 (microscopic guidance)가 부착된 26G Hamilton microsyringe (Hamilton Company, Reno, NV)를 사용하여 제조된 hAFSCs (1x106)를 주입하였다. 3개의 실험 그룹으로 나누었다: 신경절단 없는 모조실험 및 세포 주입된 대조 그룹, Ctrl; 음부신경을 절단하고 샐라인 (saline)을 주입한 그룹, Cell(-) 및 신경절단 후 hAFSC 주입한 그룹, Cell(+).
실시예4: hAFSCs의 세포주입을 위한 하이드로겔의 제조
10 ml 의 PBS (pH 7.4)에서 300 mg의 알긴산나트륨 (alginic acid sodium salt)을 분산시켜 알지네이트 용액 (3%)을 제조한 후, 균질기를 사용하여 완전히 혼합하였다. Pluronic F-127 (PF-127) (25%) 용액을 제조하기 위해, 20 ml 의 PBS에 5 g의 폴리머를 분산시키면서 저었다 (stir). 부분적으로 용해된 PF-127 용액은 전체 폴리머가 완전히 용해될 때까지 0~4℃ 냉장고 또는 ice-bath를 이용하여 저장하였다. 20μg의 히아루론산 (hyaluronic acid)을 1000 μl의 증류수에 용해하였다. alginate/PF-127/hyaluronic acid의 혼합비율은 6/6/1로 하였으며, 이 혼합물은 5분간 균질로 혼합하고 냉장고 내에서 6시간 방치하였다. 동일한 과정으로, 10 ml의 PBS의 내에서 100 mg을 분산하여 히아루론산나트륨 (sodium hyaluronate)을 제조하였다. 최종적으로, 50ml의 PBS에서 100mg을 분산시켜 Ca2+(CaCl2, 0.2%)를 제조하였다. 세포-포함 폴리머 용액을 제조하기 위해, 1×106 의 양수 줄기세포를 천천히 혼합하면서 alginate/PF-127/hyaluronic acid 에 첨가하였다.
실시예5: 요역동학 검사
주사 후 1, 2 및 4주에 vertical tilt/intravesical pressure clamp model를 사용하여 leak point pressure (LPP) 및 closing pressure (CP)를 측정하였다. 마취된 동물들을 T9 수준에서 척수 절단을 수행하였다. fire-flared tip (PE-90)를 구비한 카테터를 방광 돔 (bladder dome) 내로 삽입하고, 복벽을 봉합하였다. 마우스들은 기울어진 테이블에 두정위 (vertical position)로 올려놓고 방광에 샐라인 (saline)을 마운팅하였다. Intravesical pressure가 0 에서부터 leak point를 시각적으로 알 수 있을 때까지 13cm H2O steps 증가되었다. 4개의 연속적인 LPP 및 LP 평균을 취하였다.
실시예6: 조직학적, 면역조직화학, 분자적 및 면역반응 분석
요역동학 검사 후에, 각 시간별로 요도를 수득하였다. 주입된 사람 세포들은 항-사람 핵 항체 (HuNu, Chemicon)를 사용하여 확인하였고, 요도 괄약근 내 존재하는 줄기/근육세포 계열 세포 (stem/myogenic lineage cells)을 분석하였다. 주입을 위한 적절한 세포 수를 확인하기 위해, 104, 105 및 106 cells/sphincter을 사용하였다. 줄기세포 및 근세포 (myogenic) 관련 항체 (Nestin, MyoD, α-SMA) 분석을 통하여, 최적의 세포 수를 선택하였다. 조직학적 분석을 통하여, 생체 내 종양 형성을 또한 관찰하였다. 주입된 hAFSCs의 근세포로의 분화는 사람 프라이머를 사용한 real-time PCR을 통해 확인하였고, 세포 세포치료에 필요한 숙주 반응을 마우스 근원성 (myogenic) 프라이머를 사용하여 측정하였다. 단백질 발현은 2주 및 4주에 Nestin, MyoD, α-SM, α-actinin antibody를 사용하여 면역조직화학 (IHC)으로 확인하였다. 주입된 hAFSCs의 면역학적 양태를 평가하기 위해, 주입 후 1주일에 FACS 및 T 림프구 활성 마커 (CD8) IHC를 사용하여 세포 표면의 HLA-DR 발현을 확인하였다.
실시예7: AFSCs를 MNPs@SiO2로 표지 및 광학 이미지를 통한 생체 내 추적
주입된 hAFSCs를 추적하기 위해 자성 나노입자를 사용하였다. RITC [MNPs@SiO2(RITC)]를 포함하는 cobalt ferrite silica coreshell nanoparticles는 배재성 박사 (경북대학교, 대구, 한국)로부터 제공받았다. 표지를 위해, hAFSCs (104)을 24웰에 배양하여 약 70% 컨플런시에 도달하도록 한 후 24시간 동안 MNPs@SiO2(RITC)를 첨가하였다. 나노입자의 최적 흡수 농도를 확립하기 위해, 농도의 범위를 0.01, 0.05, 0.1 또는 0.2mg/mL로 하였다. 시간-의존적 표지 효율 평가, ICC는 매 6시간 마다 수행하였고, MNPs@SiO2(RITC)의 생포 내 위치를 측정하였다. 생체 외 hAFSCs SO 표지된 나노입자의 유지를 분석하기 위해 5×104cells을 증식용 배지를 구빈한 35-mm 조직 배양 디쉬로 시딩하였다. 세포들이 70% 컨플런시에 도달하였을 때, MNPs@SiO2(RITC)(0.1mg/mL)를 첨가하고, 3시간 배양 후, 세포들을 FACS buffer (n=3)에서 현탁하였다. 다음 계대로 가는 경우에 유지되는 비율을 측정하기 위해 표지된 세포들을 7계대까지 계대 배양하였다. 광학 이미징을 위해, 세포들을 37°C에서 MNPs@SiO2(RITC) (0.2 mg/mL)로 3시간 동안 표지하였다. 마취 후, 마우스 (n=3)의 요도 괄약근 부위로 1×106 나노입자-표지 세포들을 주입하였다. 주입 후, 광학 이미징은 Pro imaging system (Princeton Instrument, Trenton, NJ)로 얻었으며, RITC를 위해 filters (Omega Optical, Brattleboro, VT)를 세팅하였다. 이미지는 Princeton Instrument software (winview/32 Metavue)를 사용하여 분석하였고, 비특이적 자기형광 (autofluorescence)을 제거하기 위해 spectral unmixing algorithms 을 사용하였다. 세포 생존율에 미치는 나노입자의 농도 (0.010.2 mg/mL) 효과는 MTS assay를 사용하여 측정하였다.
<결과>
1. 사람 양수 세포의 특성 및 c-kit(+) cell의 분리
세포들은 4개의 다른 양수천자로부터 분리하였으며, FACS 시스템으로 분석하였다 (도 1A). 사람 양수 세포들은 Oct-4, c-kit 및 SSEA-4와 같은 배아줄기세포 마커를 발현하였는데, 이는 이 세포들이 전분화 (pluripotential) 능력을 가진 것으로 해석된다. 이들은 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포 및/또는 내피 전구세포 마커 (CD44, CD73, CD90 and CD105)에 대하여 양성을 보인 반면, hematopoietic lineage marker (CD45)에 대해서는 음성을 나타내었다. 면역반응 관련 마커의 경우, 세포들은 Class II major histocompatibility antigen (HLA-DR)에 대해서는 음성을 보였다. 제1 분류된 c-kit(+) cell population은 전체 세포군의 0.65.0%이었다. 제2 분류된 c-kit(+) cells는 c-kit에 90% 이상 양성을 보였다 (도 1B).
2. hAFSCs의 생체 외에서의 근원성 특성
5계대의 hAFSCs를 7일 동안 일반적인 근세포 배지 (regular myogenic medium) (5-azaC condition)에서 배양했을 때, 세포들이 근세포 특이적 마커 (myogenic specific markers)를 발현하는 것을 확인하였다. hAFSCs가 근육 세포로 변화하는 적절한 자극을 확인하기 위해, 2가지의 추가 조건을 평가하였다; TGF-ß 및 조건 배지. 배양된 세포들을 길어진 세포 형태 등과 같이 형태학적으로 유사하였다 (도 2A-a, b, c). MTS assay를 통한 세포생존율 분석에서, 5-azaC and TGF-ß로 배양한 hAFSCs는 CM과 비교하여 현저한 세포 사멸을 나타내었다 (도2B). 이러한 결과는 CM에서의 hAFSCs 배양이 mild myogenic conversion을 보였음을 시사하는 것이다. real-time PCR analysis 에서 (도 2C), 3개의 다른 배지에서의 줄기세포 및 근육 세포 계통 마커 (myogenic lineage markers)는 다양한 유전자 발현강도를 나타내었다. 배양 후 3일에, 증가된 줄기세포 및 초기 근세포 마커 발현을 확인할 수 있었고, 7일에는 중간 또는 늦게 (후기) 발현되는 마커들이 현저하게 확인되었다. 이러한 결과들은 hAFSCs가 제안된 배지로 myogenic lineage에 따라 분화될 수 있었음을 의미한다. 5-azaC 및 TGF-ß로 처리된 그룹은 상대적으로 증가된 유전자 발현을 보였음에도 불구하고 세포의 생존율을 고려할 때 CM 배지가 hAFSCs를 위한 적절한 myogenic condition으로 여겨진다. 유전자 발현 결과를 확인하기 위해, 면역조직화학 염색 (immunohistochemical, IHC)을 수행하였다 (도 2D).
배양된 hAFSCs의 90% 이상이 근육세포 마커 (myogenic markers)에 양성적으로 염색되었다. 줄기세포 마커로 Nestin는 전 배양기간에 걸쳐 발현되었다. 3일 째 배양된 세포들은 myogenic markers들을 동시에 발현하였다. 7일 째, 초기 마커인 MyoD 및 Desmin가 점차적으로 약해진 반면, 후기 발현 마커인 α-SM actin 및 α-actinin가 전보다 더 많이 발현되었다. 특징적으로, 세포들은 세포질에서 현저한 α-actinin labelled thick filaments를 발현하였고, CM으로 처리된 그룹에서 스핀들 (spindle) 모양의 세포들이 발견되었다. 근아세포 (myoblast)로의 분화에 대한 양성 대조군으로 C2C12 cell line을 사용하였고, 음성 대조군으로 human fibroblast를 사용하였다 (도 2E).
3. 사람 세포 확인 및 생체 내 최적 세포 수
주입된 사람 세포의 잔존, 이동 및 유지를 확인하기 위해 사람 핵 (HuNu)에 특이적인 항체를 사용하였다. anti-HuNu로 염색된 사람 핵은 생체 외 DAPI 로 매칭시켰다 (도 3A-a). 요도 괄약근에서 주입된 사람 핵의 생체 내 존재는 발견되지 않았다 (도 3A-b). 3일에 주사 부위에서 양성 염색이 국부적으로 발견되었고, 강도는 점차적으로 감소되고 14일까지 영속적으로 지속되었다. PBS-주입 요도 괄약근은 세포벽에서 HuNu-positive cells이 발견되지 않았다.
3개의 다른 세포 수 처리 중에서, 106 세포가 주입된 그룹이 muscle bundle 을 형성하면서 효과적인 요도 괄약근 재생을 보였다 (도 3B). 많은 양의 양성 Nestin, MyoD and α-SM가 존재하는 것은 손상된 요도 괄약근 조직에서 세포 수에 따라 재생이 증가되었음을 제시하는 것이다. 시딩되지 않은 그룹과 작은 수가 시딩된 그룹에서는 근육조직을 거의 포함하지 않은 불충분한 재생, 부족한 평활근 번들 (bundle) 형성 및 이행상피의 외부에 몇몇의 불규칙한 형성판을 보였다. 기술적인 한계로 인해, 107 cell 주입은 불가능하였다. 따라서, 마우스 모델에서 최적의 세포 수는 106으로 결정하였다.
4. 조직학적, 면역조직화학 및 분자적 생체 내 분석
합리적인 세포 수를 이용하여 추가 연구를 수행하였다. 마우스 요도 괄약근은 평활근 및 골격근을 포함하였다 (Fig. 3C-a). 신경절제술을 통해 손상시킨 요도 괄약근 영역은 수축된 근육과 같은 위축성 조직으로 확인하였고, 2주 및 4주에 평활근 및 straight muscle 층 구조를 거의 가지고 있지 않았다 (도 3C-b, c). 세포가 주입된 그룹은 환상근 (circular muscle) 부피 (mass) 및 thick packed layers의 회복을 나타내었다 (도3C-d, e). 세포가 이식된 기관은 정상적인 요도 괄약근 모양의 패편과 효과가 4주 동안 유지되었다. 모든 실험 그룹의 증가된 요도 괄약근은 완전한 근육 재생의 증거로 여겨졌다. 이러한 결과들은 요도 괄약근 마우스 모델에서 주입된 hAFSCs의 세포 치료효과에 대한 조직학적 증거들이다. Cell(+) group에서 종양은 발견되지 않았다; 이는 이식된 hAFSC가 생체 내 조건에서 세포 성장을 조절하고, 정상적인 형질형을 유지할 수 있음을 시사하는 것이다.
IHC를 사용하여, 줄기세포 및 근원성 마커들을 확인하였다. 2주에, 세포가 주입된 세포들은 Nestin, MyoD 및 α-SM가 증가되었고, α-actinin positive cells는 정상적인 요도 괄약근 구조를 보이는 층 layered muscle structures를 형성하였다 (도 3D). 4주에, cell(+) group은 smooth and striated muscle layer 상에 초기 마커들 (Nestin 및 MyoD) 발현이 감소되었고, 후기 마커 (late makers) (α-SM 및 α-actinin) 양성세포들이 계속하여 유지되었다. 반면, cell(-) group은 이들 단백질들이 약하게 발현되었다. real-time PCR analysis에서 주입된 사람 줄기세포는 근원성 계통 (myogenic lineage)과 관련된 유전자를 연속하여 발현하였다 (도 3E). 사람 프라이머를 이용한 유전자 발현은 초기에는 상대적으로 증가하였지만, 시간이 지날수록 점차 감소되었다. 주입된 세포들이 줄기성이 있음에도 불구하고, 생체 내 조건에 근원성 계통으로 분화되었다. 근원성 유전자 발현은 마우스 프라이머로 분석하였고, 세포가 처리된 그룹은 Cell(-) group과 비교하여 마우스 유전자 발현이 증가되었다 (도 3F). 4주에, 초기에서부터 후기 마커들까지 대부분의 특이적 유전자들은 높게 발현되었다; 이러한 결과들은 명확하지 않은 기작으로 hAFSCs가 숙주 세포 분화에 영향을 미치는 것으로 여겨진다.
5. 면역 내성
기능적 면역을 분석하기 위해, hAFSCs의 표면 표현형을 HLA-DR에 대한 phycoerythrin-conjugated antibody를 사용하여 분석하였다. hAFSCs는 HLA-DR을 약하게 (0.26 2.29 %) 발현하였고, 작은 변화가 있지만 샘플과의 비교하여 표면 표현형에 큰 차이가 없었다 (도 4A). 양성세포들의 평균 비율은 isotype Ab control보다 낮았다. hAFSCs를 마우스 요도 괄약근으로 주입하였고, 주입 후 1주일에 활성 CD8 림프구를 염색하였다 (도 4B). 세포가 주입된 그룹에서, CD8 림프구 (붉은색)는 주입 부위에서 현저하게 약한 반응을 보임이 관찰되었는데, 이는 hAFSC가 면역반응을 야기하지 않음을 시사하는 것이다. 반면, 신경이 제거되고 사람 섬유아세포가 주입된 요도 괄약근은 현저한 CD8 림프구 반응을 나타내었다.
6. 주입된 세포의 생체 내 추적을 위한 광학 이미징
형광 현미경 (fluorescence microscope)을 사용하여 생체 외에서 충분한 이미지를 제공하는, hAFSC를 위한 MNPs@SiO2(RITC)의 최적농도를 0.2 mg/ml에서 결정하였다 (도 5A). 신호강도는 시간에 따라 증가하였고, 24시간에 최고치에 도달하였고, 그 이후 72시간까지 강도에서 현저한 변화가 없었다. 24시간에서 효율 표지를 보면, 전체 군에서 세포의 94.31%가 RITC 시그널을 나타내었다 (도 5B). 나노입자는 세포질에 위치하였고, merged image로 명확히 구분되었다. MTS cell proliferation assay를 이용한 hAFSCs 생존율을 살펴보면, 24, 48 및 72시간 동안 0.01, 0.05, 0.1 and 0.2 mg/mL MNPs@SiO2(RITC)로 처리된 세포들은 저네 기간에 걸쳐 유사한 생존율을 보였는데, 이는 MNPs@SiO2(RITC)가 hAFSCs에서 세포 독성을 유발하지 않음을 의미한다 (도 5C). hAFSCs에서 나오입자가 세포 주기 진행에 미친 영향을 살펴보면, 나노입자-유도 세포 주기 정지가 관찰되지 않았다. MNPs@SiO2(RITC)-labeled cells를 요도 괄약근 내로 주입하였다 (1×106cells). 광학 이미지는 표지된 세포들인 주입된 지역 오른쪽에서 신호를 발현하였고, 반면 대조군 및 표지되지 않은 세포들을 발현하지 않았다. 시간 경과에 따라, 신호 강도는 서서히 감소되었고 10일까지 검출되었다 (도 5D).
7. 뇨역동학 검사
1주에서, Ctrl, Cell(-) 및 Cell(+)groups의 LLP는 30.25±2.56 cmH2O, 16.55±2.10 cmH2O 및 17.90±0.49 cmH2O 이었고, CP는 19.45±2.67, 9.13±0.87 및 9.88±1.34 이었다. 2주에는, LLP가 28.67±0.72, 11.59±1.18 및 18.06±2.78 cmH2O 이었고, CP는 16.99±2.20, 6.85±1.09 및 12.42±1.71 이었다. 4주에는, LLP가 27.59±3.64, 15.24±2.10 및 20.24±3.25 cmH2O 이었고, CP가 15.38±1.64, 8.35±1.10 및 14.4±3.40 이었다. 처치 후 1주일에, Cell(-) 및 Cell(+) 그룹에서의 LLP 및 CP는 차이가 없었다. 반면, 2주 및 4주에, Cell(+)의 LLP 및 CP가 Cell(-) group에 비하여 현저히 높았다 (P=0.05) (도 6).
또한, 알기산 (alginate), Pluronic acid 및 hyaluronic acid 으로 구성된 하이드로겔 (hydrogel) 복합체와 혼합된 세포들이 세포만을 넣은 그룹과 비교하여 LLP 및 LP에서 현저한 회복을 나타내었다 (도 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 양수 유래 줄기세포를 포함하는 괄약근 장애를 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 괄약근은 요도 괄약근인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 요실금을 치료하기 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 105 내지 106 cell/sphincter 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 양수 유래 줄기세포가 함입된 하이드로젤을 포함하는 괄약근 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하이드로젤은 알지네이트/PF-127/히알루논산 복합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 알지네이트, PF-127 및 히알루논산의 비율은 6:6:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 생체 내에 직접 주사되어 상기 줄기세포가 생체 내에서 근육세포로의 in situ 분화가 일어나는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 사람 골격근육세포 배지 상층액을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 근육 세포로의 분화유도용 배지.
  11. 제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 양수 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지.
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