CN114703275A - 一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合，其选自Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因中的至少一个，并公开了上述标志物组合在制备用于评估卵巢原始卵泡储备量的产品中的应用，上述产品包括用于扩增标志物组合中的基因序列的引物组合物。本发明还公开一种评估卵巢原始卵泡储备量的方法，其采用qRT‑PCR的方法对标记物组合进行扩增，检测mRNA的相对表达量；通过对应的mRNA表达量评估原始卵泡数的拟合方程，进行卵巢原始卵泡储备量的评估。本发明首次确定适用于预测卵巢卵泡池储备的生物标记物，其建立的评估方程可快速实现卵巢组织中卵巢原始卵泡储备量的确切评估，其为临床及动物实验中评估卵巢储备功能提供新手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学的医药技术领域，尤其涉及一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合及其应用。
背景技术
卵巢储备功能(Ovarian Reserve，OR)是卵巢产生正常卵子的能力，用以评估卵巢内卵泡的数量和质量，尤以前者对卵巢的储备功能影响更大，卵巢储备随卵巢生理年龄变化如图1所示。卵巢实际上是由多个原始卵泡组成的，也被称为始基卵泡(primordialfollicle，PF)，原始卵泡越多提示卵巢的储备功能越好。如果与同年龄段正常女性相比，出现卵巢内卵泡数量减少、质量下降，则卵巢的储备能力低下(decreasing ovarianreserve，DOR)，并且随着当今社会生育年龄的推迟以及工作压力负荷的增加，给越来越多的女性带来***、“围绝经综合征”甚至***不育等一系列卵巢储备功能下降DOR造成的困扰。
临床上目前评估OR的手段主要通过血清学激素检测(FSH、E2、AMH)、B超影像学检查间接评估OR的质量和数量。随着诸如卵巢组织冻存(OTC)及移植技术(OTT)、体外激活(IVA)等辅助生殖技术(ART)的发展以及众多生殖领域相关的动物实验研究的展开，在临床中对患者卵巢组织直接评估卵巢原始卵泡储备的需求越来越多，而既往临床上评估卵巢储备的手段仍为上述间接手段，然而这些手段对于体外卵巢组织(如冻存卵巢组织)的原始卵泡储备的评估基本无法完成。另外，基础研究中对于原始卵泡的确切数量仍停留在组织连续切片HE/IHC染色肉眼识别计数卵泡数量，该方法费时、费力，并且显微镜下始基卵泡难以辨识、主观性强，不同技术人员计数差异巨大。而对于始基卵泡池的数量，目前尚无能够在卵巢组织层面直接独立评价卵巢原始卵泡储备(尤其是数量)的特异性标志物，因此，临床中及基础研究领域亟需一种对卵巢原始卵泡储备简便、特异且有效的评估手段。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)作为现阶段发展较为成熟的一门分子技术手段，具有简单便捷、准确性高、可重复性好等特点，在医学基础研究、临床应用中的作用日益突出。因此，为了替代耗时、耗力的传统组织学计数手段，更利于临床评估OR的开展，能否通过寻找评价卵巢储备功能(尤其是数量)的特异性标志物，并利用上述便捷、高效的qRT-PCR技术手段实现对卵巢原始卵泡储备评估，是目前亟待解决的。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明基于大数据生物信息学手段，鉴定筛选出一组可能具有潜在评估原始卵泡储备价值的生物标记物，并通过小鼠动物实验进一步验证、建立了采用这组生物标记物来评估卵巢储备功能(OR)原始卵泡数的有效手段，为临床以及动物实验研究评估OR提供新手段。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合，所述标志物组合选自Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因中的至少一个。
进一步地，所述标志物组合选自Sohlh1和Nobox基因中的至少一个，更优选Sohlh1基因。
进一步地，在上述标志组合物中，所述基因的序列如下所示：Lhx8基因的序列如SEQ ID NO.1所示；Sohlh1基因的序列如SEQ ID NO.2所示；Nobox基因的序列如SEQ IDNO.3所示；Stk31基因的序列如SEQ ID NO.4所示；Tbpl2基因的序列如SEQ ID NO.5所示；Padi6基因的序列如SEQ ID NO.6所示；Vrtn基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面中任一所述的用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合在制备用于评估卵巢原始卵泡储备量的产品中的应用。
进一步地，在上述应用中，其采用的样本为小鼠卵巢组织、人活检卵巢组织或卵巢组织片、或其他动物卵巢组织中的一种。其中，所述动物包括但不限于：大鼠等。更具体地，所述样本适用于但不限于小鼠卵巢组织。
进一步地，在上述应用中，所述产品包括单一的试剂或含有所述试剂及其他试剂的试剂盒；其中，所述试剂为用于扩增所述标志物组合中的基因序列的引物组合物；所述其他试剂包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂、对照试剂等。
本发明的第三个方面是提供一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的产品，其包括用于扩增如本发明第一个方面中任一所述的标志物组合中的基因序列的引物组合物。
进一步地，在上述产品中，所述引物组合物选自下述引物对中的至少一种：
用于扩增Lhx8基因的引物对：如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
用于扩增Sohlh1基因的引物对：如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
用于扩增Nobox基因的引物对：如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
用于扩增Stk31基因的引物对：如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
用于扩增Tbpl2基因的引物对：如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；
用于扩增Padi6基因的引物对：如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；
用于扩增Vrtn基因的引物对：如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。
进一步地，上述产品为试剂盒，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂、对照试剂中的至少一种。
进一步地，所述对照试剂包括在用于扩增Gapdh基因的引物对，其序列如SEQ IDNO.22和SEQ ID NO.23所示。
上述标志物组合中的基因序列及其引物序列具体如下表所示：
表1–序列信息表
本发明的第四个方面是提供一种如本发明第三个方面中任一所述的产品的使用方法，其包括如下步骤：
S1、采用RNA提取试剂从样本中提取总RNA；
S2、采用RNA逆转录试剂将步骤S1提取的RNA逆转录为cDNA；
S3、采用PCR扩增试剂和引物组合物对步骤S2获得逆转录产物cDNA进行实时定量PCR扩增。
进一步地，在上述使用方法中，所述步骤S1中采用的样本为小鼠卵巢组织、人活检卵巢组织或卵巢组织片、或其他动物卵巢组织中的一种。
进一步地，在上述使用方法中，所述步骤S3中PCR扩增程序为：在95℃下30秒进行cDNA变性，然后在95℃和60℃下进行40个循环，时间为15秒。
本发明的第五个方面是提供一种评估卵巢原始卵泡储备量的方法，其包括步骤：采用qRT-PCR的方法对标记物组合中的基因序列进行扩增，检测mRNA的相对表达量；通采用所述mRNA的相对表达量通过对应的拟合方程计算原始卵泡数，以进行卵巢原始卵泡储备量的评估；其中，所述标志物组合选自Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因中的至少一个。
进一步地，在上述评估卵巢原始卵泡储备量的方法中，所述拟合方程选自以下中的至少一种：
Lhx8基因：y＝1745.593447460678-0.8327115616008314/x；
Sohlh1基因：y＝exp(7.647209536675994-0.0001055515164060347/x)；
Nobox基因：y＝exp(7.71054-0.00174/x)；
Stk31基因：y＝4909.637655898115+480.747502950626*ln(x)；
Tbpl2基因：y＝5419.552518698913+518.0607869674149*ln(x)；
Padi6基因：y＝2925.125123415106+430.7662651255001*ln(x)；
Vrtn基因：y＝4594.831+457.468*ln(x)；
其中，上述拟合方程中，y代表原始卵泡数，x代表mRNA的相对表达量，以Gapdh内参的2^-ΔCt。
进一步地，在上述评估卵巢原始卵泡储备量的方法中，qRT-PCR的方法涉及的具体步骤包括：采用RNA提取试剂从样本中提取总RNA；采用RNA逆转录试剂将提取的RNA逆转录为cDNA；采用PCR扩增试剂和引物组合物对逆转录产物cDNA进行实时定量PCR扩增。其中，样本为小鼠卵巢组织、人活检卵巢组织或卵巢组织片、或其他动物卵巢组织中的一种具体地，以小鼠(Mus musculus)卵巢组织为例，扩增的基因序列信息和引物组合物的序列信息如上表1所示。
在一具体实施方案中，RNA提取试剂采用RNAiso Plus；RNA逆转录试剂采用PrimeScript RTMaster Mix；PCR扩增试剂采用SYBR Premix ExTaq，扩增平台采用QuantStudio Dx；其中PCR扩增程序为：在95℃下30秒进行cDNA变性，然后在95℃和60℃下进行40个循环，时间为15秒。
在一具体实施方式中，mRNA的相对表达量为：Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn中的至少一个基因的相对表达量(2^-ΔCt，相比于Gapdh)。可理解的是Gapdh内参可替换成其他内参从而获得对应的拟合方程。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明基于大数据生物信息学手段，通过对GEO公共数据库中筛选不同年龄对比的小鼠卵巢bulk-seq数据以及不同发育阶段***和颗粒细胞的single cell-seq数据分析筛选，首次鉴定出Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因这7个具有潜在评估卵巢卵泡储备池价值的生物标记物，上述7个特异基因显著关联卵巢原始卵泡池储备水平。本发明通过小鼠动物模型验证了上述7个基因的可行性，并通过小鼠自体对侧卵巢原始卵泡数(PFs)计数，统计建立各个标记物表达水平与PF数量具体数值的直接关联，证实了其在卵巢原始卵泡池储备评估价值的有效性，这为今后在临床及体外动物实验中的应用奠定了基础，后续可通过进一步扩大样本量，进一步验证各标记物评估效果的准确性。
本发明提供一组适用于预测人和小鼠的卵巢卵泡池储备的生物标记物，为临床及动物实验中评估卵巢储备功能(OR)提供新手段。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一实施例中卵巢储备随卵巢生理年龄变化示意图；
图2为本发明一实施例中筛选潜在标记物的流程图；
图3为本发明一实施例中卵巢储备变化DEGs逐级筛选示意图；
图4为本发明一实施例中潜在标记物在卵泡发育表达中的筛选示意图；
图5为本发明一实施例中小鼠不同储备组原始卵泡数量对比示意图；
图6为本发明一实施例中潜在标记物卵巢储备对比模型中的初步验证的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1-潜在标记物的筛选流程
本实施例对具有潜在评估卵巢卵泡储备池价值的生物标记物进行筛选，卵巢原始卵泡储备筛选流程如图2所示，步骤简述如下：
(1)通过对GEO公开数据库(Gene Expression Omnibus database)的检索筛选，得到GSE154890、GSE179888这两个包含不同生理年龄完整卵巢RNA转录组数据集，通过对这2个数据集中数据分组设定4组OR对比组，分别为'3m vs.9m'组、'6m vs.12m'组、'p14vs.p60'组和'p14 vs.y1'组，筛选出在相对高OR组中显著高表达的差异基因(DEGs)(如图3的a部分所示)，DEGs筛选参数设置为Log2|Fold Change|>1且显著性p值<0.05；
(2)将上述各组得到的上调的DEGs取交集，得到139个共同高表达DEGs(如图3的b部分所示)，进一步将这些小鼠基因筛选出与人同源的DEGs有74个(如图3的b部分所示)；
(3)进一步通过对GSE107746数据库中卵巢***(Oo)与颗粒细胞(GCs)的差异分析，筛选出两种细胞之间的差异基因(如图3的c部分所示)，筛选参数设置为FDR<0.05且log2|FC|>2；
(4)将上述步骤(2)和(3)筛选基因交集筛选出45个相交基因，其中43个是Oo特异基因(图3的d部分所示)。
(5)进一步分析这43个基因在卵泡发育表达逐级发育过程中(原始卵泡-初级卵泡-次级卵泡-窦卵泡-***前卵泡)表达模式，采用spearman相关分析以P值<0.05且相关系数r<0为标准，筛选出更能相对代表原始卵泡的基因，从而鉴定出Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因这7个具有潜在评估卵巢卵泡储备池价值的生物标记物(如图4所示)。
实施例2-潜在标记物评估原始卵泡数(PFs)体系的建立
本实施例通过13只小鼠动物模型验证了实施例1中筛选的Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因的可行性，并通过小鼠自体对侧卵巢原始卵泡数(PFs)计数，统计建立各个标记物表达水平与PF数量具体数值的直接关联，其相关步骤简述如下：
(1)经上海市第十人民医院动物伦理委员会批准，合计13只生理年龄为3周、8周、36周龄不等的c57BL小鼠处死后行双侧卵巢切除术，收取双侧卵巢。每只小鼠一侧卵巢行4％PFA(Servicebio，中国)固定供后续PFs评估，对侧新鲜卵巢行RNA提取，每只小鼠一一对应。依据其生理年龄差异所代表卵巢储备差异分为高卵巢储备组(3周和8周龄)和低卵巢储备组(36周龄)。
(2)小鼠原始卵泡数计数：采用卵巢组织石蜡包埋连续组织切片及H&E染色技术，步骤简述如下，组织石蜡包埋连续组织：a)取材后组织脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。b)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。c)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚5μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。HE染色实验步骤：a)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。b)苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。c)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。d)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。e)图像采集分析。
对每例小鼠卵巢在显微镜下计数原始卵泡数，镜下识别G1期原始卵泡并逐个计数，结果如下表2所示；并统计分析比较两组中PFs显著差异性，结果提示高低卵巢储备组中PFs差异显著(如图5所示)。
表2-G1期原始卵泡数
(3)潜在标记物在小鼠模型中表达情况：采用qRT-PCR技术对潜在标记物在小鼠模型中表达进行检测，提示各标记物在高卵巢储备组中均显著升高(如图6所示)。
qRT-PCR步骤如下：以小鼠完整卵巢组织作为检测样本，根据说明书采用RNAisoPlus(TaKaRa，日本)完成总RNA的提取操作；采用NanoDrop2000(Thermo Scientific，美国)测量RNA的质量和数量；采用PrimeScript RTMaster Mix试剂盒按照说明书(TaKaRa，日本)将RNA逆转录为cDNA；定量实时PCR(qRT-PCR)在QuantStudio Dx(ABI，美国)上使用SYBRPremix ExTaq试剂盒(Takara，Shiga，日本)进行，按照说明书配置10ul反应体系：TB GreenII(2x)5uL、Dye II 0.2uL、cDNA 2uL、ddH2O 2uL、primer 0.8uL。热循环器的条件如下：在95℃下30秒进行cDNA变性，然后在95℃和60℃下进行40个循环，时间为15秒。采用2^-ΔCt法计算mRNA的相对表达量，以Gapdh为内部对照。在PCR扩增中采用的引物序列见下表3。
表3-PCR引物序列(人工合成)
(4)生物标记物对卵巢储备水平评估的ROC分析：采用ROC曲线分析评估了这些基因中每个基因的表达水平对卵巢储备高低评估能力，如下表4所示，提示这些基因均具有较好的评估卵巢储备的能力。
表4-不同生物标记物对OR高低评估的ROC分析
(5)生物标记物对评估确切PFs的拟合分析：将各生物标记物表达量与各自对应的PFs行spearman相关性分析，结果显示这些基因与PFs具有显著高相关性(如下表5所示)。
表5-原始卵泡数(PFs)与各生物标记物相关性分析
(6)进一步采用SPSS软件对各标记物潜在的回归拟合曲线进行筛选，依据P值<0.05筛选出R2最高的拟合曲线模型(如下表6所示)；依据上述筛选结果，列出各标记物对应的最优拟合曲线，如下表7所示。由表6可知，Sohlh1和Nobox基因具有最高的拟合指数，可筛选作为评估OR最优标记物。
表6-各标记物回归拟合曲线筛选
表7-各生物标记物mRNA表达量评估原始卵泡数拟合方程
实施例3–应用验证实施例
随机挑选一雌性c57bl小鼠，处死后收集其两侧卵巢，一侧按照上述步骤行显微镜下原始卵泡数计数，对侧卵巢留取提取RNA，通过qRT-PCR技术检测Lhx8、Sohlh1、Nobox相对表达量(2^-ΔCt，相比于Gapdh)。通过上述计数流程镜下计数G1期原始卵泡数为1201个，通过检测对侧卵巢Lhx8、Sohlh1、Nobox相对表达量分别为0.001089、0.000209、0.003413，通过实施例2中的对应基因拟合函数，得到评估的G1期原始卵泡数分别为980.94、1264.18、1340.40，评估数较卵巢中G1期原始卵泡数大体相当，且Sohlh1基因计算所得结果最为接近，与上述筛选的最优标记物相一致。
由上述实施例可知，本发明可通过qRT-PCR技术对小鼠完整卵巢组织检测Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因的相对表达量(2^-ΔCt，相比于Gapdh)，基于本发明建立的评估方程可快速实现卵巢组织中卵巢原始卵泡储备量的确切评估，其评估步骤简述为：设计基因引物序列、qRT-PCR检测基因表达量、引入特定基因评估函数计算；且上述每种基因均可独立完成评估，也可联合完成评估。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1990
<212> DNA
<213> Lhx8基因(Artificial Sequence)
<400> 1
aggccttagt gtggctgaga gaggaagaac agtgggtcag agagtggtta cggtcactgt 60
ggcctttttg gaacaagaca cactggtggc atcgctgttc tgcctgttag ctttccttgg 120
cctttggggg cggaggaggg gacactgcgg acacccacag cctctgaccc tctggagctg 180
gtatgtgacg agcagcgcct gcggggccat gtattggaag agcgatcaga tgtttgtgtg 240
taagctggag ggaaaggaag tgccggagct ggcggttccc cgcgagaagt gccccgggct 300
catgtcggag gagtgcgggc ggcctgcagc cctggcggcc gggaggaccc gcaaaggcgc 360
tggggaagaa ggactggtga atcccgaggg agccggggac gaggactcct gctcctcctc 420
ggccccgctt tccccgtcgt cctcgcccca gtccatggcc tcgggctccg tgtgcccgcc 480
aggcaagtgt gtgtgcagca gctgcggcct ggagattgtg gacaaatacc tcctcaaggt 540
gaatgactta tgctggcatg tccgctgtct ctcctgcagt gtctgcagaa cgtccctggg 600
aaggcacacg agctgctaca ttaaggataa agacattttc tgtaaactcg attacttcag 660
acggtatggg acccgctgtt cccgctgtgg caggcacatc cactcgactg actgggtccg 720
cagggccaag ggcaacgtgt atcacctggc ctgctttgcc tgcttttctt gcaagaggca 780
gctgtccacg ggagaggagt tcgccttggt ggaggagaag gtcctctgta gagtgcactt 840
tgactgcatg ctggacaatc tgaagagaga agtggagaac ggtaatggga ttagtgtgga 900
aggagccctt ctcacagagc aagacgtcaa tcatccaaag ccagccaaaa gagctcggac 960
cagcttcaca gccgatcagc tccaggttat gcaagcacag ttcgctcagg acaacaaccc 1020
agatgcacag accctccaga aactggcaga aaggacaggc ttaagcagac gtgtcataca 1080
ggtgtggttt cagaactgca gggcccgcca taagaaacac gtcagtccca accattcttc 1140
ctcagccccc gtcacagctg tcccctcctc caggctgtcc ccacccatgt tggaagaaat 1200
ggcttattct gcctacgtac cccaggatgg gacgatgctg actgcgctgc actcatacat 1260
ggatgctcac caacaactcc tggactccag cccttgttac cccatccaat gacccagctg 1320
ccaataagtc atacctaatt ccttctttca gggatagaaa tgattgaggt tataaacttg 1380
tcatttatta tgtataaaat accattgaga agatattaat gttaattttt tatttaacac 1440
tcaaagcatt tcgaacatcc tctcgctgcc caggtatgta tctagagttg gcctgcaaga 1500
cacttttatt gattcttcat tttggttttt ttttgtaaaa cttatgttta caaagaagaa 1560
aacaagtcaa aacatttttt tttgtattgt ctggagatag ttggctcgag tgtgtgtcta 1620
ttaacttatt tgtcaccaaa agagcacttt gcctgaaagg caggactgat cgtgtgcaaa 1680
acgtttacaa tcctttgtga aactgtagtt tatcattagt ttgtacctgt aagttattgt 1740
tataaatatt atctgtattt tttgtcatat acaactttat accttgaagc ttgtatctgt 1800
gaatttgcaa ctgaaattta ttttgccagt gttttcggga caagctgaag gcacgtccgt 1860
tgtagcatgc cgcgcacacc cacggggtgc ctgcacttgg agttctagct gtaaataaca 1920
ctctagttta caaagcctac catcctaagt tcattaaaca ctttgcatcc ttgtgaaaaa 1980
aaaaaaaaaa 1990
<210> 2
<211> 1314
<212> DNA
<213> Sohlh1基因(Artificial Sequence)
<400> 2
gctaagggct atctgcggct tccggcttgt tgcttccctc caacttcgtg ccaatggcgt 60
ccggtggcca cgagcgggcc aatgaggatt acagagtctc tggcattacg ggatgcagca 120
agactcctca gcctgagact caggacagct tgcagacctc atcacaaagc tcagctctct 180
gcacagctcc tgtggctgct gcaaacttgg gccccagtct tcggagaaac gtggtcagcg 240
agagagaacg caggaggcgg atctcgttga gctgtgagca cttgcgggct ctactgcctc 300
agtttgatgg ccgacgggag gacatggcat ctgtcctgga gatgtctgtg tacttcctcc 360
agcttgccca cagcatggac cctagctggg agcaactctc tgttcctcag cctccccagg 420
agatgtggca catgtggcag ggtgatgttc tgcaggtaac cctggcgaat cagattgcag 480
acagcaagcc agactccggt atagccaaac catctgctgt gtctcgggta caggatcccc 540
catgctttgg gatgctggat acagaccaga gccaggctac tgagagagag tcagagctgc 600
tggagagacc ttcctcctgc cctggtcatc gccagagcgc gttgtcattc agtgagccag 660
agtcttccag cttgggtcct gggctcccac cctggatccc tcactcatgg cagccagcca 720
ctcccgaggc aagtgacatt gttcctggtg ggtcacacca ggtggcatcc ctggccgggg 780
accctgaatc ttccggcatg ctggctgagg aggccaactt ggtcttggca tctgtgcctg 840
atgccaggta caccacaggg gcagggtccg atgtggtgga tggagcaccc tttctgatga 900
ccaccaatcc tgactggtgg ttggggtcgg tggagggcag aggaggccca gcccttgcca 960
ggagcagccc agtggatggg gcagagccaa gcttcatcgg agaccctgag ctttgctccc 1020
aggagctcca ggctggtcct ggagagctgt ggggtttgga ttttggcagc cctggcctgg 1080
ccctgaagga tgaagcggac agcatcttcc ctgacttttt cccctgatag ctgagtcccc 1140
cagagtttag tttgctgggg agctgtcctg tgcctgggtg ttgtattttg ggcttggttt 1200
gcagctgagg cctaatttga gggagcctgg cagggctgtg agtggagttt gtattaaaga 1260
ggaaagtggt ttttctggca gaaacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1314
<210> 3
<211> 1893
<212> DNA
<213> Nobox基因(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgagctca ggagagggag cctgggccat ggaacctacg gagaagctct gcaagaaaat 60
gcagggccag gaagctggtg acaagcccag gactgctgca ctggagacag agggaccact 120
gcaggattct gccctgccca tccaggatga tcaagacaag cagtcctcac tccccagggc 180
tagcttgggg aagaggccac tgtcgaagac ctctgaggag ttaatggatg ctggcacgtg 240
cagagtgcac aaagccccca cagcagccgc atgtggtccc caatccgagg aagaaggttg 300
ttctccccca gagagaaagg cagaatcgct gaagccatcc atttctgcag tccctggcca 360
agccaccgcc ggttccctca actctcatga aggggacctg aagaaagaat ccctagaagt 420
gacctgtcaa tttcggaaaa agacccgaac cctgtaccgc tcagaccagc tggaagaact 480
ggagaggata tttcaggaag accactatcc tgacagtgac aaacgccatg agatttccca 540
gatggtgggg gtaacccccc aaagaatcat ggtgtggttt cagaaccgca gggcaaagtg 600
gagaaaagtg gagaaactga acgagaagga aactaagaat ggtcctgcag cccccagtgc 660
tgacagcagc cagcacagat ctgctcctga gctcctagac cctatgccta cagacctaga 720
acctggccct gttcctccag agaacatcct ggatgtcttt cctgagcccc ccatgctgct 780
gacttctgaa cagactctga ccccctttca gaataatgag ggtgctgaga gggtggcagt 840
gactccacca ctcctcagtc ccccacctat tcgaagggcc aaccttcctc ttcctctggg 900
tcctgttcaa actcctcaag tactgcctcc aatgagggac gttcctggca gtgacagcat 960
atacaaggac aaggcctatg tgtcctgggg cactagtatc gcctcaccac ccacctactc 1020
aaatttggaa gacctggggt ctcaggacta ccaagcaagc agccagttgg gttcattcca 1080
gctctcccag gctccacatt tacccctttt cccatccctt cagtcacagt ttccgtatct 1140
gccccccttc ccttacccca tcccaagctc aatgccattt ctaccaccag aagactctct 1200
gttttcattt ccttttggct tcagtggaga ctcatcacag gattattgcc caggaccccc 1260
accaggtcag atcttgctgc agccacctgc tgaaaacatg ggtacaggac cctggagtgg 1320
ccattgcttg ccagaacctc ccttccctcg tccacactac ccacaggctc tgggacaacc 1380
cctaggggca gagggttact ttcctaacct attgccaact ccatatgctc tgactatgag 1440
taagcagtct tcattaggcc tcaatgggct tctcgaaggc actagagtag agaccgggtc 1500
ctcactaagc aaaatgtcag atgagcagac ttcctcttcc ctcgagcagc ccgcactaga 1560
ggaggtcaga gacaaaaata agaatagcca tgccgctgga gctaaagagt aaagagaagg 1620
aagtccttat gggaggcctg ggaaggggga agaataaccc tgaagaatgt gagaggctat 1680
ggactggcct gctatgttgg tccaaggtct ttccagcctg ggcttagaga aggaagagag 1740
ctgccatctc atttccccct ttacccttta ggaattcaaa agaatagaag ggtcatgtta 1800
actctaaacg ttaaatgtgg tattactgcc atcctaggca gtgcatgcaa taaataaaac 1860
agtaactact gggtgtttgg ttttgtgaat gaa 1893
<210> 4
<211> 3238
<212> DNA
<213> Stk31基因(Artificial Sequence)
<400> 4
gggctggagg gctgagggtg gagcgcctgg tatgtggggc cagcggctct ttgctgggac 60
ggctgtggcg caaagtgtaa gttttccagg acttgtccaa atggatgaag atacacatta 120
caataaagtt gaagatgttg ttggaagtca tgtagaagat gcagtaacat tttgggccca 180
gaatgtcagt aaaaataagg atattatgaa gattggttgt tcactctcag aagtttgtcc 240
tcttgctaat tcagtttttg gcaatcttga tcctaagaag atttatggtg gattgttttc 300
tgaagataag tgctggtaca gatgcaaagt gctaaaaact atcagcgatg ataagtgcct 360
ggtgaggtac attgactatg gaaatactga aattctaaac cgatctgata tagtagaaat 420
tcctccggag ctacaatttt ctagtattgc caagaagtat agactttggg gactacagat 480
tccttctggc caagaagtta cccagtttga tcagggtaga acatttttgg ggagtttgat 540
ttttgaaaaa gaaattaaaa tgagaataaa agcaacatat caagatggaa cagttattgc 600
tcaggctgag tatggcactg tcgatatagg ggaagaagtg gcaaagaaag gatttgcaga 660
aaagtgcaga ctgacctcag gcattgatgc ctgtgaggca aagaaacctg atcctaatca 720
gcttgctctc aggagtctca agaaccctat ccccctgtgg gggcgcagat caaaccagtc 780
aaccttcagc aggccaaagg ggcattttaa cgggaggctg actcttgatg tgaagtatga 840
gaccagtgca ggcaatcacg tgacatttcc aaaggaaagt ttggctgctg gtgactttaa 900
tttagggtct aatgtcagct tggcaaaaat taaacaggac cagaaactta ttgaagagaa 960
tgaaaagctt aaaacagaga aagaggttct tctagaaaat tacaaagcat tagaattaaa 1020
agttgagcag actgcccagg agctgcagca agagaaaaca gctaccatgg atctgactaa 1080
gcatttagaa agcactctga agacgtgtgt aggaaccagg ctgaagaatt tggcagctaa 1140
agtagaacta ttgaaagaaa ttaggcatat taacatcagt attcgctttg gaaatgacct 1200
ttcagatgct atgcaagtgt tggatgaagg gtcctttact actctagcat ctttgaatga 1260
gttagagaaa atttgggctg aatataatgt tgctcaggag aagatccaaa cttgtcttaa 1320
tgagaatgaa ggtaatattt tgattgctga aagaaatgaa gtacaacaga agctgttcgt 1380
ggctgtagat gtttttattc tggaagtaga tgacttacca cttgataaac gcttaaaaac 1440
attgcaggac ttagcaactt ctttagaatc agtgtatgga aaggccaaag aaggaactaa 1500
taactctgaa gaaacactta gaaagtttta tgactggcag tgtaccaaaa gagaagagtt 1560
cgccagtatt aggagtgaaa cagaggcatc tctgcagcac cttgtggcat ggttccagag 1620
cagccagaag gtttttgatc tgtccttgga tgaaccattg acttcagaag acctgattgg 1680
taatattgat gaaattctag agaagactga gtcatgtgtc tgcaaagagc tagagctgtc 1740
tctcattgag caaggtgtca tagacaagga gattatttta agtacataca gtcaagtgct 1800
gcaaaagatc cattctgagg aaaagttcat tgccaccttg ctgtccaagt ataaggacag 1860
tgttgagttt aaaaagcaga tgattgactg tttaaataag aaccccaatg tggattactt 1920
gctttctatt aagaagacat tgaaaggctt aaaagcacaa ctgagatgga aattggttga 1980
gaagagtaat ttggaagaat ctgatgacca tgatggaact gaaattgaga aaataaagca 2040
agaaataact caattgcgaa atagtgtttt ccaggaaatt tatcatgaga gggaggaata 2100
tgagaagctg aatagcttga cccagaaatg gttccctgag ctgcctctgc tgtatcctga 2160
aataggattg cttaaatata tgaattctgg tggtcttctt actatgagct tagagcggga 2220
ccttcttgac actgagccca tgaaggaact tagcagcaag cgtcctctgg tgtgctccga 2280
ggttaatggg cagccagttc tcttaaaggg ctattccgtg gatgttgaca cagaaggcag 2340
ggtgattcag agagcagcct cttaccatag agcttgtgga tatgctaaag aagagtctgg 2400
gttactgcca ttaatattct tgtttttgtg taagtctgat cctgttgcct atctgatggt 2460
cccatattat cctaaggcaa acctgagtgc agttcaagcc agtatgcctt taacttcaga 2520
agaagcttta aaagtcatga aaggtgttgc ccgaggactg catacattgc atagtgctaa 2580
cataattcat ggatcacttc atcagaacaa tgtatttgcc ttaaatcgtg aacaagggat 2640
tgttggagat tatgacttca ccaaatctga gagccagcga gcttcagtca acgcgatggt 2700
tggtggattg agtttgctct cacctgaatt gaaaactgga aaacctcctt ctgcaagttc 2760
agacttatat gcttatggtt gccttttctt atggctttct gttcaaaatc aagagtttga 2820
gacaaatgaa gatggaattc caaaagtaga tcagtttcat ttggatgata atgtcaagtc 2880
cctcctttgt agcttgatat attttagaag ttcaatgact gctgagcagg ttttgaatgc 2940
tgaatgtttc ttgcttccaa aggggaaatc agttccaatc ccagaaaaag agattgaatg 3000
tactcagcat agcagagaag atgaatcaaa gatggagagt ctggatagat atagtgaaaa 3060
gacaagaaat ggtgaagcca acccttgact aacaaattaa tcctttattg ttgctgtata 3120
tgtccctttt aaaaactttg ttctgtttgc ttagtagaca aaaatgttct ggaactagtt 3180
ggattgcatc tttggatttg ggttgtaaaa aataaaagaa atgttttgat tacacctg 3238
<210> 5
<211> 1734
<212> DNA
<213> Tbpl2基因(Artificial Sequence)
<400> 5
actaacaaag cttcttccac ttgcctggac gctgattcct ttgcttgtcc tcagctctac 60
atggtgggct ctctcatcat ggaggaggac atatacctgg acctcttcct ggatccttat 120
accatccagg atgactttcc tccagctatg tctcaactgt tcagcccagg agtgccttta 180
gacatgcact cacttccatc taatccagag actgtgtttc atccacatct tggtggagtc 240
aaaaaggcat ccactgactt ttcatctgtg gatctaagct tcttaccaga tgaacttacc 300
caagaaaata gagaccaaac tgtcactgga aacaagctgg caagtgagga aagctgtagg 360
actcgagatc gacaaagtca gttgcagttg cccgatgaac atggcagtga gctgaacttg 420
aatagcaaca gttcaccaga tccccagtca tgcctgtgct ttgatgatgc tcactccaac 480
cagccctctc cagaaacacc aaactccaat gccttacctg tggcattgat agcatccatg 540
atgccaatga accctgttcc aggattttct ggaattgtgc ctcaattaca gaatgtagtt 600
tccactgcaa atctggcctg taaattggat ctgagaaaaa tagccctgaa tgccaaaaac 660
acagaatata acccaaagag gtttgctgca gtaataatga ggatccgaga gccaaggaca 720
acagctctca tctttagctc tgggaaagtg gtctgtacag gagccaaaag tgaagaggag 780
tctcggctgg cagcgagaaa gtatgctcgt gtggtgcaga agctcgggtt ccctgtcaga 840
ttcttcaatt ttaaaattca gaacatggtt ggaagctgtg atgtgaaatt tcccatcagg 900
ctggagattt tggcactaac ccatcggcag ttcagtagca gttatgaacc tgaacttttc 960
cccggcctta tttataagat ggtaaaacca caggttgtgt tgctaatctt tgcatctgga 1020
aaagttgtgt taacaggtgc caaagagcgt tctgagatct atgaagcatt tgaaaacatg 1080
tatcctattc tagaaagttt taagaaagtc tgagtgcatc tctgggcttc aagcaataat 1140
ttggatatgt gattaagcac agcagagaga gctgatttct tctacacatg gctctagaag 1200
catcctttgt tttctagcag ccatgggtct ctattattat gataattgat tatgcctttt 1260
tgtttgattt tgccttgttt tggaaacagg gtctgctacg taacctaaaa tgtagtttga 1320
tttattacaa aatgattctg tgtgaatagc catgattaag aaatgaaaat ttcttactca 1380
aaatgagtat tgtatgttat ttaattataa aaaataagaa caagtaaacc tatttcagaa 1440
tttgaaatat gtcaggcctt gctagtgtga ggcattaaga ccatgcttta tttttttaag 1500
tatgtaatat attagtacat agaaatttca agtgaatgca tatcttgata ttacctgtaa 1560
tgtaacagct atcaataaaa actcatgttt aatttctttt catttcaagt atagaagaga 1620
cagcatccag accttttggt aatggatact gggaaatcac tggggtgaac caatgaaata 1680
tcccaaacct taaaatccat tgtttgaaat aaaactgctt tccagcagcc acca 1734
<210> 6
<211> 2333
<212> DNA
<213> Padi6基因(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcctaggca attactctgg tgggtaagga ctgctgacag tggctagctt ggtaagccca 60
gccatgtctt ttcagaactc actcagcctg tctctggtca atcccaccca tgccctctgc 120
atggtaggca tggaaatcac cttggacatc agcaagtgtg caccagacaa gtgcaagtct 180
ttcaccatcc gtggttcccc caggatcttg atccacatct ctagctccgt catcgctggc 240
aaagaggaca ctgtggtctg gaggtcaatg aaccatccca cagtggcatt ggtgaggatg 300
gtggcgccca gccccactgt ggatgaagac aaggtgctgg tctcctactt ctgtcctgac 360
caagaagtcc ccacggccac agctgtgctg tttctcaccg gcatcgagat ctccctggag 420
gcagacatct atcgagatgg acaactggac atgccaagtg ataagcaagc taagaaaaaa 480
tggatgtggg gtatgaacgg ctggggagcc atcctgcttg tgaattgtag ccctaatgct 540
gtgggccagc ctgatgaaca gtcctttcag gagggcccca gagaaataca gaacctgtct 600
cagatgaatg taactgtgga gggccccacc agcatcctac agaattacca gttgatccta 660
catacctccg aagaagaggc gaagaagaca agagtctact ggtctcagag aggctcctct 720
gcgtatgaac tggtggtggg acccaacaag cctgtctatc tcctgcctac ctttgagaac 780
cgtaggaaag aggctttcta cgtagaagcc acggaattcc catctcccag cttctcgggc 840
ctgatctcct tgtcactctc cctagtagaa aaggctcacg acgagtgcat cccagagatt 900
ccgctctata aggatacagt gatgttccgg gtggcacctt atatcttcat gcccagcacc 960
cagatgcctc tagaggttta cctgtgcagg gagctacagc tgcaaggctt tgtggactca 1020
gtgaccaagc tgagcgagaa gagcaaagtg caggtggtaa aggtctatga ggaccccaac 1080
cgccagagca agtggctcca ggacgagatg gctttctgct atactcaggc tcctcacaag 1140
acggtgtcat tgatccttga caccccaagg gtttccaagc tggaagactt ccccatgaaa 1200
tacacactga cccctggctc tggctacctg atccgacaaa ctgaggacca ccgggtggct 1260
agcctggatt ccatcgggaa cctgatggta tctccgcctg tcaaggctca gggcaaagac 1320
taccctctag ggagggtcct cattggtggc agcttttacc ccagctctga gggccgggac 1380
atgaacaagg gcctgcgaga attcgtgtat gcccagcagg tgcaggcccc tgtggaactc 1440
ttctcggact ggctgatgac cggtcacatg gatcaattca tgtgctttgt ccctaccaat 1500
gataaaaaca acgaccagaa ggacttccgc ctgctgctgg ccagccccag tgcctgcttt 1560
gagctgttcg aacagaagca gaaggaaggc tatgggaacg tgaccctgtt tgaagacatt 1620
ggagcagaac agctcctttc taatgggagg gagagcaaaa ctatttccca aatcctggct 1680
gacaagagtt ttcgagagca gaacacctat gttgagaagt gtatcagcct gaaccgcacc 1740
ctcctgaaga cagaactggg attggaggac aaggacatca tcctgatccc gcagctcttc 1800
tgcctggagc agctgacgaa tgtcccctcc aaccagcaga gcaccaaact cttcgcgagg 1860
ccgtacttcc ccgacatgct gcagataatc gtgttgggca agaaccttgg aatccccaag 1920
ccctttgggc ccaaaatcaa tggcacctgc tgcctagaag agaaagtgtg tggattactg 1980
gagcccctgg gtctcaagtg caccttcatt gatgattttg actgctacct ggccaacata 2040
ggggacgtct gtgccagtgc catcataaac agggtgccat ttgcattcaa gtggtggaag 2100
atgaccccat aaacccctgg ccctggcacg gccagtccgc gccagtacgg atggcctttg 2160
ccatagatag tagtgggtgc gagcgttgtt gttgcactgg gttgaaggga cggagagctg 2220
ggagttaggg tctctcacat ctaccagctt gacacttctg gaggggaaaa gggaaaagag 2280
cgcctatgta aacaaattgc catagagcca ataaagcatg gtattctgaa tgt 2333
<210> 7
<211> 3028
<212> DNA
<213> Vrtn基因(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggaagtgt gttgcatccg acgctgtgtt ggacactgga ggaattcagg atgacgtctc 60
gggatcagct ggtgcagcag gtgctgcgcg acctgcagga ggcagtggag tccgagggct 120
tagagggtct catcggtgct gccctggagg ccaagcaggt cctatcttcc ttcacccttc 180
ccatctgcca gaagggcggc cctggcgctc aggtgctgga ggtggactca gtggccttga 240
gtctgtaccc ggaggatgct cctcggaaca tgctgccctt ggtgtgcaag ggtgagggga 300
gcctgttgtt tgaagcgacc agcctgttgt tgtgggggca cacgggtctc agcctggagc 360
tgcgagcccg cactgtggtg gagatgctgc tgcacaggca ctattatctg cagggcatga 420
tcgactccaa ggtgatgctg caggctgtgc gctactcctt gtgctctgag gagtcccctg 480
agatgaccaa cttatctttt gccacactgg aggccatctt tgatgctgat gtaaaggcta 540
cgtgcttccc aacgagcttc tccaatgtgt ggcacttgta tgccctcgcc tccatccttg 600
aatgcaacat ctactccatc taccccatgc gcaacatcaa gatccgaccc tattttaacc 660
gtgttatcat gcctcgctgc tccacccacg tgacctccat gctgcacatc atgtgggctg 720
gtcagcccct cactagccac ctcttccgtc accagtattt tgcccctgtt gttgggctgg 780
aggaggtgga ggctgactgt actgctagcc tgaaccccgt tcctccaaac ctgggtcctc 840
tgctaccacc cgctaaaacc ctggagctgc tcaaccgtga acctggcctc agctactccc 900
acctctgtga ccgcatcagc atcaccaaga gcaccttcta ccgctggcgg cggcagaccc 960
aagagcaccg tcaaaaggta gccacccgct tctctgccaa gcacttcctg caggacagtt 1020
tccaccgtgg gggctttgtg ccattgcagc agttcctgca gagattccct gagatctccc 1080
gttctaccta ctatgcttgg aagcatgagt tgctgggctc tggtgccaac tcggccctgg 1140
gcccggccac tccatccagg gaggcactgg ctgtgccgga ggtggagagg ccaccgggga 1200
aaaaggctgc tgaggaggtg gggtgctcct cactggcagc agcgatgttg agccctccta 1260
gtatgatctt aatgcagcgt gccaagtctt tcttggagta ttgcatctct ctgaacaaac 1320
tggtaccata tcgctgcttc aaatgcaggt tccctggcat ctcgaggtct acctactaca 1380
actggaggcg gaaagccctc agaaggaccc ccagtttcaa gttgtcccaa gcagcttttg 1440
aaactgctga gtctctccag ccaacagatg ttgggaaaga gacccccttc tctttgaaga 1500
gagaagcggg agaggaggag acaggaaaag caggaagtgg ggctcctctg acttcccggg 1560
ggctcatatc cccaaagatg cccttatctc gttggcagag acgactacgc agggctgccc 1620
gcaagcaggt gctaaatggg cacctaccct tctgtcgctt ccgcctccgc tatcctagtc 1680
tgttaccttc cactttttgg gtatggaaaa gtctttcccg gagatcgccc gggatgcaga 1740
ttccctcttt gagccagagg aggcagaagc ctcagggacg gcagaagccc gagggacggc 1800
agaagcccga ggaacagcag aagcccgagg gacggcagaa gcccgaggga cggcagaagc 1860
cagttgaacc acaggctatg gaagctgatc agaatgtacc ggctatggtg gttcctccag 1920
cggagacact gccagtggct acttctccag aagatgtccc aggagggcct tccagagagg 1980
gaaacatcat tcaagaggca gctatgaccc agagccaacc ccatagtgga tcgttgccaa 2040
gccagactct ggcggaggca cccgggggca gtgatgggca ggtgctggtg atggacatgc 2100
ttaccaccac gaggttcaag gcccaggcca agctgttcct gcagaagcgg ttccagtcta 2160
agactttccc ctcctacaag gagttccagg cgctcttccc cctcactgcc cgctccacct 2220
actacatgtg gaagcgggcg ctctatgaag gtctcacact gattgatggc tgatgggagg 2280
ggaagaaggg gagccgagct gcctcctgac taggatgtcc tttgctctgc cttttgtaac 2340
gtcttgatgg aggggtggga atcagccgct cgctctgaca aaagctacag gagggccagt 2400
tgtctctttg gttgttggct gggtcatagg tttttgttgt gtttcatttt gctttttcca 2460
ttaatttggg ttggcaggac cccctccgcc cctcgtcagt gttaaagctc tgtcatgatt 2520
gtgacatggc tgctttcagc ttttcctggg cccacaagga aagtatcaca gcgtgaccat 2580
tatttcctgt cagaataaat atatgtgcct tttcttttta agggttgtat cttttttttc 2640
cccccctcaa agatgtcttc caaaggaata tggggactga gcctgaggca gctgtgtggc 2700
tgcttcctca aaccctcggt ggagaaggac tgagcttcac agaacacacg acagtgatct 2760
ctaagccagg gaaggcccct aggcactgga gaccccaaag agagcttcct gcttcctctg 2820
ctgggggctg ggggggatct cttcaggtca ggcgtctgcc agcctggctg ctcttgggga 2880
cctgctgagc cgcctcagac gccaaggcac attttgggca aggagctaca aggttacaag 2940
gctggtgggg aattgatttt tttttttcat tgtctagcca cacagttgga aacccaaaga 3000
aaataaagtg aaattttgtc ctcacaca 3028
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Lhx8-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 8
agcacagttc gctcaggaca ac 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Lhx8-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 9
gctgaggaag aatggttggg ac 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Sohlh1-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 10
gccaaaccat ctgctgtgtc tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Sohlh1-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 11
aaggtctctc cagcagctct ga 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Nobox-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 12
cgttcctggc agtgacagca ta 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Nobox-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaatgaacc caactggctg ct 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Stk31-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtgtgtagg aaccaggctg aa 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Stk31-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 15
ggacccttca tccaacactt gc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Tbpl2-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 16
actccaatgc cttacctgtg gc 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Tbpl2-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 17
gccagatttg cagtggaaac tac 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Padi6-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgagcgaga agagcaaagt gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Padi6-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 19
atgacaccgt cttgtgagga gc 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Vrtn-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 20
accaagagca ccttctaccg ct 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Vrtn-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 21
gaactgctgc aatggcacaa agc 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Gapdh-正向引物(Artificial Sequence)
<400> 22
catcactgcc acccagaaga ctg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Gapdh-反向引物(Artificial Sequence)
<400> 23
atgccagtga gcttcccgtt cag 23
Claims (10)
1.一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合选自Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合，其特征在于，所述基因的序列如下所示：Lhx8基因的序列如SEQ ID NO.1所示；Sohlh1基因的序列如SEQ ID NO.2所示；Nobox基因的序列如SEQ ID NO.3所示；Stk31基因的序列如SEQ ID NO.4所示；Tbpl2基因的序列如SEQ ID NO.5所示；Padi6基因的序列如SEQ ID NO.6所示；Vrtn基因的序列如SEQ ID NO.7所示。
3.如权利要求1或2所述的用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合在制备用于评估卵巢原始卵泡储备量的产品中的应用。
4.一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的产品，其特征在于，包括用于扩增如权利要求1或2所述的标志物组合中的基因序列的引物组合物。
5.根据权利要求4所述的一种评估卵巢原始卵泡储备量的产品，其特征在于，所述引物组合物选自下述引物对中的至少一种：
用于扩增Lhx8基因的引物对：如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
用于扩增Sohlh1基因的引物对：如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
用于扩增Nobox基因的引物对：如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
用于扩增Stk31基因的引物对：如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
用于扩增Tbpl2基因的引物对：如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；
用于扩增Padi6基因的引物对：如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；
用于扩增Vrtn基因的引物对：如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。
6.根据权利要求4或5所述的一种评估卵巢原始卵泡储备量的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂、对照试剂中的至少一种。
7.一种如权利要求4或5所述的产品的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用RNA提取试剂从样本中提取总RNA；
S2、采用RNA逆转录试剂将步骤S1提取的RNA逆转录为cDNA；
S3、采用PCR扩增试剂和引物组合物对步骤S2获得的逆转录产物cDNA进行实时定量PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述步骤S1中采用的样本为小鼠卵巢组织、人活检卵巢组织或卵巢组织片、或其他动物卵巢组织中的一种；和/或，所述步骤S3中PCR扩增程序为：在95.0℃下30秒进行cDNA变性，然后在95℃和60℃下进行40个循环，时间为15秒。
9.一种评估卵巢原始卵泡储备量的方法，其特征在于，包括步骤：采用qRT-PCR的方法对标记物组合中的基因序列进行扩增，检测mRNA的相对表达量；采用所述mRNA的相对表达量通过对应的拟合方程计算原始卵泡数，以进行卵巢原始卵泡储备量的评估；其中，所述标志物组合选自Lhx8、Sohlh1、Nobox、Stk31、Tbpl2、Padi6和Vrtn基因中的至少一个。
10.根据权利要求9所述的一种评估卵巢原始卵泡储备量的方法，其特征在于，所述拟合方程选自以下中的至少一种：
Lhx8基因：y＝1745.593447460678-0.8327115616008314/x；
Sohlh1基因：y＝exp(7.647209536675994-0.0001055515164060347/x)；
Nobox基因：y＝exp(7.71054-0.00174/x)；
Stk31基因：y＝4909.637655898115+480.747502950626*ln(x)；
Tbpl2基因：y＝5419.552518698913+518.0607869674149*ln(x)；
Padi6基因：y＝2925.125123415106+430.7662651255001*ln(x)；
Vrtn基因：y＝4594.831+457.468*ln(x)；
其中，上述拟合方程中，y代表原始卵泡数；x代表mRNA的相对表达量，以Gapdh内参的2^-ΔCt。
Priority Applications (1)
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| CN202210365516.0A CN114703275B (zh) | 2022-04-07 | 一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202210365516.0A CN114703275B (zh) | 2022-04-07 | 一种用于评估卵巢原始卵泡储备量的标志物组合及其应用 |
Publications (2)
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