CN111363709B - 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高生物法合成异戊二烯的产量，并减少中间产物对菌体的毒性，本发明提供了一种提高异戊二烯产量的基因工程菌；所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌。所述基因工程菌可用于发酵生产异戊二烯。

Description

一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
异戊二烯(isoprene)是一种重要的化工原料和平台化合物，主要用于合成橡胶。此外，它还在精细化工中被用于合成其它异戊二烯类化合物及其衍生物，用途覆盖医药、农药、香料、生物燃料等领域，每年全球的需求量达到上百万吨。目前异戊二烯的生产主要是通过化学法从石油基原料中获得。然而，随着化石资源的日益枯竭和价格的不断攀升，原料问题和环境问题已成为制备异戊二烯的重要瓶颈。因此，寻找异戊二烯新的生产途径是今后异戊二烯工业生产的重要发展趋势。
目前，利用工程微生物如大肠杆菌、酵母等来生产异戊二烯已成为可能。但是生物法合成异戊二烯仍有两方面问题有待解决：一是外源MVA途径较长，且MVA下游途径催化效率低，例如目前MVA途径中间产物甲羟戊酸的产量能达到84g/L，异戊二烯产量仅为理论转化率的28％，且通过筛选新来源的酶或对现有的酶进行定向改造对催化效率的提升也都不明显；二是某些中间产物如异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)等对菌体具有毒性，影响了菌体的正常生长。
发明内容
为了提高生物法合成异戊二烯的产量，并减少中间产物对菌体的毒性，本发明提供了一种提高异戊二烯产量的基因工程菌；所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌。
进一步地限定，所述D18包裹信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
更进一步地限定，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因，为源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶基因IspSpa，为源于银白杨(PopμLus alba)的异戊二烯合成酶基因IspSpa，GeneBank登录号为AB198180，所述含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒为pLysS-PduABJKNU。
本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)第一重组质粒构建：分别将D18包裹信号肽序列添加到甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1上游，获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12、含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，然后将上述各基因连接到质粒pETduet-1上，获得第一重组质粒pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12；
2)第二重组质粒构建：将含有D18包裹信号肽序列连接到质粒pYJM21中异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因的上游，获得第二重组质粒pYJM21-D18；
3)将步骤1)所得的第一重组质粒，步骤2)所得的第二重组质粒以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU导入到大肠杆菌感受态细胞中，获得基因工程菌。
进一步地限定，步骤1)所述甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1通过化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒获得。
进一步地限定，步骤1)所述第一重组质粒构建是指以pYJM14质粒为模板，分别通过PCR扩增获得甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1；
上述各基因的PCR产物经限制性酶切酶切后，分别***到质粒pET14b-D18-GFP-SsrP载体中D18序列下游，获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12的中间载体pET14b-D18-ERG12、含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的中间载体pET14b-D18-ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的中间载体pET14b-D18-ERG19和含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的中间载体pET14b-D18-IDI1；
然后，以pET14b-D18-ERG12为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12；
以pET14b-D18-ERG8为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8；
以pET14b-D18-ERG19为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19；
以pET14b-D18-IDI为模版，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，然后通过酶切连接或In-Fusion克隆方法依次将上述含有D18包裹信号肽序列的各基因连接到pETDuet-1质粒上，获得pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12。
更进一步地限定，步骤1)扩增甲羟戊酸激酶基因ERG12所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；扩增磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；扩增甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；扩增异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
扩增含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
扩增含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
扩增含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；
扩增含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示。
本发明还提供上述基因工程菌在发酵生产异戊二烯中的应用。
进一步地限定，是利用该基因工程菌，通过体外酶催化反应生产异戊二烯：将该基因工程菌经诱导表达制备蛋白小体，再将蛋白小体加入到体外酶催化反应体系中，孵育制备获得异戊二烯；所述体外酶催化反应体系，每2mL体系中含有如下组分：10mM pH值7.4的PBS缓冲液、4mM ATP、30mM KCl、8mM MgCl2、0.2mM MnCl2、0.01mM ZnSO4、4mMβ-巯基乙醇和1mL的0.25mM的甲羟戊酸，0.2g/L蛋白小体100μL。
更进一步地限定，所述蛋白小体的制备方法为：将该基因工程菌培养至OD600为0.6-1.0后，经IPTG诱导表达9h，然后将菌液离心，每100mL菌种培养液获得的菌体沉淀经15mL裂解液BPER-II、1mL溶菌酶、100乘细菌蛋白酶抑制剂、1μL DNase I和5.2μL终浓度4mM的β-巯基乙醇，室温下60rpm，30min，离心获得蛋白小体。
有益效果
BMCs是一类以蛋白为基础的复杂亚细胞器，BMCs壳外由蛋白质组成，具有选择性渗透，含有小的不带电的分子如乙醛、CO2、O2，大的分子如辅酶B12、NADPH、ATP，都可以自由的通过。本发明利用BMCs，将其本发明所述的MVA下游相关途径基因以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒整合到大肠杆菌中，构建基因工程菌，体外反应利用BPER-II破碎菌体，后超高速离心获得含有异戊二烯下游途径的“纳米生物反应器”，向反应器液中加入反应底物甲羟戊酸溶液后体外合成异戊二烯，本发明所提供的方法实现了利用反应器在体外利用甲羟戊酸合成异戊二烯，体外酶活检测实验证实了本发明构建的基因工程菌可通过体外反应生产异戊二烯，从而减少有毒代谢中间产物对菌体生长的影响，实现了在体外构建了异戊二烯蛋白合成机器。
通过摇瓶发酵实验检测到，凡是表达了融合的D18标签的代谢途径的菌株(不管是否表达了PDU壳蛋白)与对照表达融合的His标签代谢途径的菌株相比，异戊二烯产量提高了五到六倍。
附图说明
图1融合包裹蛋白N端的D18包裹信号肽的异戊二烯合成途径表达载体构建过程示意图。
图2表达PDU壳蛋白编码基因和加D18或His标签异戊二烯合成途径基因所用质粒图谱。
图3融合D18包裹信号肽的MVA下游途径基因单独表达或与PDU共表达纯化后样品SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质marker(kD)；PET-D18-low即为pETDuet-D18-lower质粒；Pdu即为pLysS-Pdu质粒。
图4电镜观察蛋白小体，其中A为对照组，含有pLysS质粒的大肠杆菌，B为对照组，含有pLysS-PduABJKNU质粒的大肠杆菌；C为实验组，本发明构建的基因工程菌，含有pYJM21-D18、pLOW8、pLysS-PduABJKNU三个重组质粒。
图5纯化得到的BMCs添加甲羟戊酸为底物的体外酶活实验，其中“+”代表质粒被转化到受体菌株中，“-”代表质粒未转化到对应的菌株中；pLysS-Pdu代表pLysS-PduABJKNU质粒；D18-low(pETduet-D18-IDI-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12)代表第一重组质粒；D18-IspSpa代表第二重组质粒；His-low(pETduet-His-IDI-His-ERG19-His-ERG8-His-ERG12)代表第一重组对照质粒，His-IspSpa(pYJM21)代表第二重组对照质粒；E.coliBL 03、E.coliBL02、E.coliBL 01分别代表转化不同质粒的菌株编号，纵坐标代表异戊二烯产量，单位ug/L。
图6含有不同质粒的E.coli菌株摇瓶发酵异戊二烯产量检测，其中“+”代表质粒被转化到受体菌株中，“-”代表质粒未转化到对应的菌株中；pLysS-Pdu代表pLysS-PduABJKNU质粒；D18-low(pETduet-D18-IDI-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12)代表第一重组质粒；His-low(pETduet-His-IDI-His-ERG19-His-ERG8-His-ERG12)代表第一重组对照质粒，D18-IspSpa代表第二重组质粒；His-IspSpa(pYJM21)代表第二重组对照质粒；横坐标分别代表转化不同质粒的菌株编号，纵坐标代表异戊二烯峰值面积。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用试剂、材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
本发明所述pLysS-PduABJKNU、pET14b-D18-GFP-SsrP、pLysS质粒均记载在Lee MJ,Brown I R,Juodeikis R,et al.Employing bacterial microcompartment technologyto engineer a shell-free enzyme-aggregate for enhanced 1,2-propanediolproduction in Escherichia coli[J].Metabolic Engineering,2016,36:48-56.
pYJM21和pYJM14记载在Yang J,Xian M,Su S,et al.Enhancing production ofbio-isoprene using hybrid MVA pathway and isoprene synthase in E.coli[J].PLoSOne,2012,7(4):e33509.
公众可从中国科学院青岛能源与过程研究所获得。
pETduet-1购买自Novagen。
本发明中提到的名词的释义如下：
纳米生物反应器：在本发明中指含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU，该质粒在大肠杆菌中表达可以形成纳米级别的蛋白小体。由于该蛋白小体为纳米级别，又具有空间结构，因此该蛋白小体可以用于纳米生物反应器。在本实验中，重组质粒pLysS-PduABJKNU与含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa各基因组合后在大肠杆菌中表达蛋白小体。
D18包裹信号肽：其氨基酸序列为MEINEKLLRQIIEDVLSEPMGSSHHHHHHS SGLVPRGSH，前18个氨基酸来自PduD，具有信号肽的作用，其后“PMGSS”氨基酸序列作为连接链，其后“HHHHHHSSGLVPRGSH”氨基酸序列作为His-tag。
酶切连接：是指通过限制性内切酶将基因片段或载体酶切后，再将目的基因片段与目标载体通过DNA连接酶连接，是载体构建技术中常用的实验方法。
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
下述实施例中pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12又称pLOW-8或pETDuet-D18-lower或简称D18-low。
pET-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG12-His-ERG8又称pLOW-4或pETDuet-His-lower，或简称His-low。
pYJM21-D18又称D18-IspSpa、或pACYC-mvaE-mvaS-D18-IspSpa。
pYJM21又称His-IspSpa或pACYC-mvaE-mvaS-His-IspSpa。
实施例1.提高异戊二烯产量的基因工程菌的构建方法。
本实施例制备的提高异戊二烯产量的基因工程菌，过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌。所述D18包裹信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶基因IspSpa，为源于银白杨(Populus alba)的异戊二烯合成酶基因IspSpa，GeneBank登录号为AB198180，所述含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒为pLysS-PduABJKNU。该基因工程菌的构建方法如下所述：
(1)第一重组质粒构建：分别将含有D18包裹信号肽序列添加到甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1上游，获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12、含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，然后连接到质粒pETduet-1上，获得第一重组质粒pETduet-D18-ID1I-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12。
以上基因都属于已知基因，获得方法采用基因组作为模板进行PCR的方法，或者直接基因化学法合成，其中D18包裹信号肽序列的核苷酸序列并不局限于下述实施例中使用的载体pET14b-D18-GFP-SsrP中核苷酸序列，编码“MEINEKLLRQIIEDVLSEPMGSSHHHHHHSSGLVPRGSH”的核苷酸序列作为信号肽序列也能够实现本发明，以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
下面举例描述含有D18标签的甲羟戊酸MVA下游途径相关基因的第一重组质粒(pLOW-8)的构建过程(构建流程如图1所示,图中IDI基因即为IDI1基因)。
a)目的基因扩增
以pYJM14为模板，分别通过下述引物F和引物R，进行聚合酶链式反应(PCR)，分别扩增基因ERG12、基因ERG8、基因ERG19和基因IDI1片段，扩增甲羟戊酸激酶基因ERG12所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；扩增磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；扩增甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；扩增异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1所用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
其PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0001922746050000071
PCR程序为：94℃ 3min；30×(94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1min/kb)；72℃5min；4℃∞
各引物序列如下所示：
表1引物序列表
Figure BDA0001922746050000081
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(碧云天，货号D0056)进行胶回收纯化。
b)中间载体制备
获得各目的基因后，利用限制性内切酶Nde I和Spe I以酶切酶连接的方式连接到pET14b质粒上(如图1所示)，方法如下：
利用限制性内切酶1(Nde I)和限制性内切酶2(Spe I)同时双酶切pET14b-D18-GFP-SsrP。
质粒和PCR产物，其酶切体系为：
Figure BDA0001922746050000082
酶切体系置于37℃孵育1h。进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：
Figure BDA0001922746050000091
连接体系置于22℃孵育30min。连接产物分别转化E.coli DH5α感受态，涂布到含有34mg/mL氨苄的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，分别从阳性克隆中提取重组质粒pET14b-D18-ERG12、pET14b-D18-ERG8、pET14b-D18-ERG19、pET14b-D18-IDI，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
c)pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12构建。
以pET14b-D18-ERG12为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12；所用引物为pET-D18-ERG12-F、pET-ERG12-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
以pET14b-D18-ERG8为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8；所用引物为pET-D18-ERG8-F、pET-ERG8-R核苷酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
以pET14b-D18-ERG19为模板，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19；所用引物为pET-D18-ERG19-F、pET-ERG19-R核苷酸序列如SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15所示；
以pET14b-D18-IDI为模版，PCR扩增获得含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，所用引物为pET-D18-IDI1-F、pET-IDI1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示。
表2引物序列如下所示：
Figure BDA0001922746050000092
Figure BDA0001922746050000101
通过酶切连接的方式依次将上述含有D18包裹信号肽序列的各基因连接到pETDuet-1质粒上(如图2所示)获得pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12。具体方法如下：
①含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的PCR产物经NcoI和SacI限制性内切酶酶切后连接到同样经NcoI和SacI限制性内切酶酶切的pETDuet-1片段上获得pETDuet-D18-IDI；
②含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的PCR产物经SacI和SalI限制性内切酶酶切后连接到同样经SacI和SalI限制性内切酶酶切的pETDuet-D18-IDI1载体上，获得pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19；
③含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的PCR产物经FseI和AvaI限制性内切酶酶切后连接到同样经FseI和AvaI限制性内切酶酶切的pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19载体上，获得pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8；
④含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12的PCR产物经AvaI和PacI限制性内切酶酶切后连接到同样经AvaI和PacI限制性内切酶酶切的pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8载体上，获得pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12，为第一重组质粒，简称pLOW-8。
上述PCR产物回收、质粒与PCR产物酶切、连接体系、转化大肠杆菌的方法及阳性克隆筛选方法同前所述，上述各步骤中筛选的获得的阳性克隆均通过限制性酶切和测序进行鉴定。
2)第二重组质粒构建：可参照步骤1中所述步骤构建含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa的重组质粒pET14b-D18-IspSpa，然后通过酶切连接或Infusion方法将带有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因构建到pYJM21载体中，本实施例采用的是将含有D18的信号肽序列化学合成到质粒pYJM21中异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因的上游，获得第二重组质粒pYJM21-D18，其载体图谱如图2中所示的pACYC-mvaE-mvaS-D18-IspSpa，该部分由华大公司完成。
3)将步骤1)所得的第一重组质粒，步骤2)所得的第二重组质粒以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU导入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得基因工程菌。
以上质粒构建方法涉及到PCR技术、核酸合成技术、质粒限制性酶切方法、酶切片段回收方法、酶切片段连接方法，大肠杆菌转化方法等如无特殊说明，均属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
对比例1：构建含有His标签的MVA下游途径相关基因的载体。
pET-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG12-His-ERG8(pLOW-4)。
与实施例1的不同在于，本对比例中所述的基因工程菌中各过表达的基因上游为组氨酸标签His-tag，所述组氨酸(His)标签其氨基酸序列为“HHHHHHSSGLVPRGSH”。
1)质粒pET-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG12-His-ERG8(pLOW-4)的构建
A)目的基因的制备：
由于D18标签中含有His标签，因此目的基因的获得方法采用
pET14b-D18-ERG12、pET14b-D18-ERG8、pET14b-D18-ERG19、pET14b-D18-IDI1各重组质粒作为模板，下述引物F和引物R，进行聚合酶链式反应(PCR)，分别扩增ERG12、ERG8、ERG19和IDI1片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0001922746050000111
PCR程序为：94℃ 3min；30×(94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1min/kb)；72℃ 5min；4℃∞
表3引物序列
Figure BDA0001922746050000112
Figure BDA0001922746050000121
B)中间载体的制备
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(碧云天，货号D0056)进行胶回收纯化。
质粒和PCR产物，其酶切体系为：
Figure BDA0001922746050000122
酶切体系置于37℃孵育1h。进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：
Figure BDA0001922746050000123
连接体系置于22℃孵育30min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到34mg/mL氨苄的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-His-IDI1、pET-His-IDI1-His-ERG19、pET-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG12、pET-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG12-His-ERG8(pLOW-4)(图2)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
C)pETduet-His-IDI-His-ERG19-His-ERG8-His-ERG12构建。
以pET14b-D18-ERG12为模板，PCR扩增获得含有His序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12；所用引物为pET-ERG12-F、pET-ERG12-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：11所示；
以pET14b-D18-ERG8为模板，PCR扩增获得含有His序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8；所用引物为pET-ERG8-F、pET-ERG8-R核苷酸序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：13所示；
以pET14b-D18-ERG19为模板，PCR扩增获得含有His序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19；所用引物为pET-ERG19-F、pET-ERG19-R核苷酸序列如SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：15所示；
以pET14b-D18-IDI1为模版，PCR扩增获得含有His序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，所用引物为pET-IDI-F、pET-IDI-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：17所示。
通过酶切连接的方式依次将上述含有His序列的各基因连接到pETDuet-1质粒上(如图2所示)获得pETduet-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG8-His-ERG12。具体方法如下：
①含有His序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI的PCR产物经NcoI和SacI限制性内切酶酶切后连接到同样经NcoI和SacI限制性内切酶酶切的pETDuet-1片段上获得pETDuet-His-IDI1；
②含有His序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的PCR产物经SacI和SalI限制性内切酶酶切后连接到同样经SacI和SalI限制性内切酶酶切的pETDuet-His-IDI1载体上，获得pETduet-His-IDI1-His-ERG19；
③含有His序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的PCR产物经FseI和AvaI限制性内切酶酶切后连接到同样经FseI和AvaI限制性内切酶酶切的pETduet-His-IDI-His-ERG19载体上，获得pETduet-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG8；
④含有His序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12的PCR产物经AvaI和PacI限制性内切酶酶切后连接到同样经AvaI和PacI限制性内切酶酶切的pETduet-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG8载体上，获得pETduet-His-IDI1-His-ERG19-His-ERG8-His-ERG12，简称pLOW-4。
上述PCR产物回收、质粒与PCR产物酶切、连接体系、转化大肠杆菌的方法及阳性克隆筛选方法同前所述，上述各步骤中筛选的获得的阳性克隆均通过限制性酶切和测序进行鉴定。
2)将步骤1)所得的pLOW-4重组质粒，pYJM21质粒以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU导入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得基因工程菌。
以上质粒构建方法涉及到PCR技术、核酸合成技术、质粒限制性酶切方法、酶切片段回收方法、酶切片段连接方法，大肠杆菌转化方法等如无特殊说明，均属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
实施例2.实施例1制备的基因工程菌在发酵生产异戊二烯中的应用。
本实施例举例说明利用实施例1制备获得该基因工程菌，通过体外酶催化反应生产异戊二烯，是将该基因工程菌经诱导表达制备蛋白小体，再将蛋白小体加入到体外酶催化反应体系中，室温孵育制备获得异戊二烯。具体方法如下：
1.蛋白小体的验证
(1)将实施例1构建的重组大肠杆菌接种于100mL LB培养基中，摇床37℃180rpm培养至OD600为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.4mM，30℃培养9小时。
(2)将菌液5000rpm离心10min，用Buffer A洗两次，加入10mL buffer A和15mLBPER-II(额外添加1mL溶菌酶、100乘细菌蛋白酶抑制剂、1μL DNase I和5.2μLβ-巯基乙醇(终浓度4mM))室温下60rpm，30min，冰浴12000rpm离心1min，20000rpm离心20min，将沉淀溶于Buffer B，4℃保存。
Buffer A：50mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM KCl、12.5mM MgCl2、1.5％1,2-PD(丙二醇)
Buffer B：50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、5mM MgCl2、1％1,2-PD(丙二醇)
(3)SDS-PAGE
在诱导表达9h后离心收集菌体，分别用超声波和裂解液BPER-II处理破碎菌体，并通过离心去细胞碎片和超高速离心得到纯化的BMCs或相应的对照样品。样品经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，通过分子量大小以及与文献中电泳结果做对比，证明PDU壳蛋白和MVA下游途径的ERG8、ERG12、ERG19、IDII都已表达，具体结果见图3。
(4)电镜的处理
收集大约1.5mL EP管0.05-0.1刻度的菌体，加入500mL的2.5％戊二醛，移液枪吹打均匀，4°冰箱过夜。1000g，2min离心收集菌体，弃上清，PBS清洗三次，每次半个小时，每次清洗的时候应将细胞吹打均匀。加入1％的锇酸，固定70min，然后用PBS清洗三次，每次半个小时。按照体积分数30％、50％、70％、80％、90％、95％的梯度进行丙酮脱水，再用纯的丙酮脱水三次，每次脱水为20min。按照7体积丙酮、3体积Spurr树脂的比例配置混合液，加入细胞中，渗透10h。按照3体积丙酮、7体积Spurr树脂的比例配置混合液，加入细胞中，渗透10h。纯Spurr树脂渗透过夜。将菌体置入包埋模具中，加入Spurr树脂，65°烘箱放置24h。树脂经修块后，使用超薄切片机进行切片，染色后电镜观察。通过TEM电镜观察，在实验组我们发现了与对照组菌株(pLysS-PduABJKNU)相类似的细菌微区室BMCs。具体结果见图4。
2.体外酶活的检测
(1)将实施例1构建的重组大肠杆菌接种于100mL LB培养基中，摇床37℃180rpm培养至OD600为0.6-1.0，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.4mM，30℃培养9小时。
(2)将菌液5000rpm离心10min，用Buffer A洗两次，加入10mL Buffer A和15mLBPER-II(额外添加1mL溶菌酶、100乘细菌蛋白酶抑制剂、1μL DNase I和5.2μLβ-巯基乙醇(终浓度4mM))室温下60rpm，30min，冰浴12000rpm离心1min，20000rpm离心20min，将沉淀溶于Buffer B，4℃保存。
(3)甲羟戊酸液的制备
0.5mM KOH溶液与0.5mM的甲羟戊酸内酯按照体积比为1.05：1的比例混匀，37℃，30min，然后30℃温浴4h，得到0.25mM的甲羟戊酸。
(4)体外酶反应
体外酶活反应在有塞玻璃瓶中进行，反应体系(2mL)：50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4),4mM ATP、30mM KCl、8mM MgCl2、0.2mM MnCl2、0.01mM ZnSO4、4mMβ-巯基乙醇,2.5mM甲羟戊酸，100μL重组的蛋白小体(0.2g/L)。室温反应三小时后，取1mL顶空气体进行气相色谱分析，以标准品做标准曲线进行定量，设置三组重复。
该异戊二烯纳米生物反应器(即本发明所构建的基因工程菌制备的蛋白小体)在体外反应中产生了500ug/L的异戊二烯，从而证实了该异戊二烯纳米生物反应器成功的构建。具体结果见图5。可见，本发明利用蛋白小体作为纳米反应器，通过D18包裹信号肽，成功的将甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1和异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因表达的蛋白聚集在纳米反应器中，浓缩了底物、酶、辅因子的浓度，从而提高了催化效率。本研究也证实了小的分子如异戊二烯、ATP、甲羟戊酸可以自由的通过该蛋白小体。此外异戊二烯代谢途径中的某些中间产物如异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)等对菌体具有毒性，会影响菌体的正常生长。倘若这个问题不能得到有效解决，将会影响异戊二烯产量的进一步提高和阻碍生物法合成异戊二烯的工业化进程。而该蛋白小体可以作为纳米反应器，通过包裹代谢途径，从而能够隔离有毒中间产物对宿主细胞的伤害。
实施例3.实施例1制备的基因工程菌在发酵生产异戊二烯中的应用。
本实施例举例说明利用制备获得的基因工程菌体内摇瓶发酵合成异戊二烯。
将活化后的工程大肠杆菌按1：100的比例接种到含有相应抗生素的LB液体培养液中，37℃，180rpm条件下振荡培养，当OD600为0.6-0.8时，在菌液中加入终浓度为0.4mM的IPTG，然后转入30℃，180rpm条件下继续培养。当工程菌株诱导培养24h后，取顶空气体1mL，利用气相GC进行定量检测，所述检测方法参照Yang J,Xian M,Su S,Zhao G,Nie Q,JiangX,et al.Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVA pathway andisoprene synthase in E.coli.PLoS one.2012；7:e33509.。
通过初步的摇瓶发酵实验检测到凡是表达了融合的D18标签的代谢途径的菌株(实施例1构建的菌株)(不管是否表达了PDU壳蛋白)与对照表达量融合的His标签代谢途径的菌株(对比例1构建的菌株)相比，异戊二烯产量提高了五到六倍，具体结果见图6。
可见，本发明通过利用D18包裹信号肽，使得甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1和异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因表达的蛋白聚集在一起，提高了底物、酶、辅因子的浓度，从而提高了催化效率。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
核苷酸序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
<130>
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> D18包裹信号肽
<400> 1
Met Glu Ile Asn Glu Lys Leu Leu Arg Gln Ile Ile Glu Asp Val Leu
1               5                   10                  15
Ser Glu Pro Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Leu Val Pro Arg Gly Ser His
        35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> ERG12-F
<400> 2
cgcgcggcag ccatatgtca ttaccgttct taact 35
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> ERG12-R
<400> 3
cggatccaaa actagtttat gaagtccatg gtaaattc 38
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> ERG8-F
<400> 4
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<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> ERG8-R
<400> 5
cggatccaaa actagtttat ttatcaagat aagtttccg 39
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> ERG19-F
<400> 6
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<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> ERG19-R
<400> 7
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<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> IDI-F
<400> 8
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<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> IDI-R
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> pET-D18-ERG12-F
<400> 10
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<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> pET-ERG12-R
<400> 11
ccttaattaa ttatgaagtc catggtaaat tcgtg 35
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<211> 52
<212> DNA
<213> pET-D18-ERG8-F
<400> 12
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<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> pET-ERG8-R
<400> 13
ccctcgagtt atttatcaag ataagtttcc ggatc 35
<210> 14
<211> 49
<212> DNA
<213> pET-D18-ERG19-F
<400> 14
cgagctcttt aagaaggaga tatataatgg aaatcaatga aaagctgct 49
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> pET-ERG19-R
<400> 15
gcgtcgactt attcctttgg tagaccagtc tttg 34
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> pET-D18-IDI1-F
<400> 16
aggagatata ccatggatgg aaatcaatga aaagctgct 39
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> pET-IDI1-R
<400> 17
cctgcaggcg cgccgagctc ttatagcatt ctatgaattt gc 42
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> pET-ERG12-F
<400> 18
ccctcgagtt taagaaggag atatataatg ggcagcagcc atcat 45
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> pET-ERG8-F
<400> 19
cgcggccggc cttaaggagg tatatattaa tgggcagcag ccatcat 47
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> pET-ERG19-F
<400> 20
cgagctcttt aagaaggaga tatataatgg gcagcagcca tcat 44
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> pET-IDI1-F
<400> 21
aggagatata ccatggatgg gcagcagcca tcat 34
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 组氨酸（His）标签
<400> 22
His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His
1               5                   10                  15

Claims (5)

1.一种提高异戊二烯产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSpa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，为来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，为源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，为源于酿酒酵母（Saccharomyces  cerevisiae）的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，为源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶基因IspSpa，为源于银白杨（Populus alba）的异戊二烯合成酶基因IspSpa， GeneBank登录号为AB198180；所述D18包裹信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒为pLysS-PduABJKNU。
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）第一重组质粒构建：分别将D18包裹信号肽序列添加到甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1上游，获得含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12、含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，然后将上述各基因连接到质粒pETduet-1上，获得第一重组质粒pETduet-D18-IDI1-D18-ERG19-D18-ERG8-D18-ERG12；
2）第二重组质粒构建：将含有D18包裹信号肽序列连接到质粒pYJM21中异戊二烯合成酶的基因IspSpa基因的上游，获得第二重组质粒pYJM21-D18；
3）将步骤1）所得的第一重组质粒，步骤2）所得的第二重组质粒以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒pLysS-PduABJKNU导入到大肠杆菌感受态细胞中，获得基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）所述甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1通过化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒获得。
4.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产异戊二烯中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用该基因工程菌，通过体外酶催化反应生产异戊二烯：该基因工程菌经诱导表达制备蛋白小体，再将蛋白小体加入到体外酶催化反应体系中，孵育制备获得异戊二烯；所述体外酶催化反应体系，每2mL体系中含有如下组分：10 mM pH值7.4的PBS缓冲液、4 mM ATP、30 mM KCl、8 mM MgCl2、0.2 mM MnCl2、0.01 mMZnSO4、4mM β-巯基乙醇和1 ml的0.25mM的甲羟戊酸，0.2g/L蛋白小体100uL。
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