CN113136269A - 一种用于化学发光免疫检测的清洗液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于化学发光免疫检测的清洗液,它包括10~200mMol/L缓冲液;0.01~1wt%表面活性剂;100~300mMol/L无机盐;0.5~0.1g/L防腐剂;所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的任一一类或多类混合。本发明提供一种适用于血清、血浆和全血等多种样本的清洗液,其优点是对内源性干扰物清洗效果极佳,一定程度上保证了临床样本检测的准确性,可在POCT平台上得以应用。
Description
技术领域
本发明涉及化学发光免疫分析技术领域,更具体地说,涉及一种用于化学发光免疫检测的清洗液。
背景技术
化学发光免疫分析CLIA是继放免RIA、酶免ELISA、荧光免疫FFIA后的一种新型免疫技术,它联合应用了高灵敏度的化学发光技术和具有高度特异性的免疫反应,可用于检测微量抗体或抗原。其原理为:将发光物或酶标记在抗原/抗体上,在孵育过程中抗原抗体形成免疫复合物,随后借助清洗液洗去多余的抗原/抗体,最后加入氧化剂或底物,测定发光信号。信号的强弱与待测物的浓度成相关性。
目前很多技术人员对清洗液进行了研究。CN106226539A公开了一种电化学发光清洗液,其主要组分包括Tris缓冲液、多聚葡萄糖、Tween 20、3-巯基吲哚等,主要应用于贝克曼全自动免疫分析仪。CN105754733A公开了一种化学发光清洗液,主要成分包括磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂等,是针对雅培化学发光免疫分析仪开发的一款洗液。CN107118865A公开了一种清洗液,主要成分有磷酸盐缓冲液、无机盐、表面活性剂等,可以适应酶促化学发光、直接化学发光***。然而以上清洗液都只适用于样本类型为血清或血浆的化学发光免疫分析平台,无法满足针对全血样本的清洗要求,即无法应用于即时检测(point-of-care test,POCT)平台。
众所周知,血液样本中成分复杂,很多内源性干扰如胆红素、甘油三酯、血红蛋白、纤维蛋白原等都会对免疫反应产生干扰。如果免疫反应结束后清洗效果不佳,则多余的反应物将残留,继而通过化学发光的逐级放大造成测定结果偏离。为此,有必要研制出一种适用于POCT的清洗缓冲液,不仅要满足不同类型样本(如全血、血浆)的清洗要求,同时保证结果的准确度与精密度。
发明内容
本发明旨在提供一种适用于血清、血浆和全血等多种样本的清洗液,其优点是对内源性干扰物清洗效果极佳,一定程度上保证了临床样本检测的准确性,可在POCT平台上得以应用。
本发明所采取的技术方案是:提供一种用于化学发光免疫检测的清洗液,包括10~200 mMol/L缓冲液;0.01~1wt%表面活性剂;100~300mMol/L无机盐;0.5~0.1g/L防腐剂;
所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的任一一类或多类混合。
作为优选,所述阴离子表面活性剂包括硫酸酯盐型,所述阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐,所述两性表面活性剂包括甜菜碱型,所述非离子表面活性剂包括多元醇类表面活性剂和聚氧乙烯型表面活性剂。
作为优选,所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
所述无机盐为氯化钠或氯化钾;
所述防腐剂为Proclin系列或叠氮钠,所述Proclin系列包括Proclin 300、Proclin 950。
作为优选,所述缓冲液PH值为7.0~8.5;其中优选PH值为7.5和8.0。
作为优选,包括10~200mMol/L三羟甲基氨基甲烷;0.01~1wt%非离子表面活性剂与两性表面活性剂的混合液;100~300mMol/L氯化钠;0.5~0.1g/LProclin300;其中,所述非离子表面活性剂采用聚氧乙烯十二烷基醚,所述两性表面活性剂采用3-磺丙基十四烷基甜菜碱,所述聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱按照重量比为4:1进行配比,当上述两种表面活性剂按所述比例混合形成复配型表面活性剂,其HLB值和CMC值发生有利于蛋白分散,液体表面张力变小,脂溶性变强,以达到更佳的清洗效果。
作为优选,包括10~200mMol/L三羟甲基氨基甲烷;0.01~1wt%阴离子表面活性剂; 100~300mMol/L氯化钠;0.5~0.1g/LProclin300;其中,所述阴离子表面活性剂采用脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠;。
作为优选,0~200mMol/L三羟甲基氨基甲烷;0.01~1wt%非离子表面活性剂;100~300 mMol/L氯化钠;0.5~0.1g/LProclin300;其中,所述非离子表面活性剂采用NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚,所述NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚按照重量比为1:4:5 进行配比;当上述两种表面活性剂按所述比例混合形成复配型表面活性剂,其HLB值和 CMC值发生有利于蛋白分散,液体表面张力变小,脂溶性变强,以达到更佳的清洗效果。
作为优选,所述清洗液应用于即时检测平台。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1、本发明涉及一种用于化学发光免疫检测的清洗液,适用于化学发光免疫分析,尤其是POCT化学发光。该清洗液由缓冲液、表面活性剂、无机盐和防腐剂组成。该清洗液主要是通过改变样本中蛋白质表面亲水性,去除蛋白粘附及聚集,同时对甘油三酯,胆红素等脂溶性物质具有增溶分散效果,在清洗过程中使其均匀分撒在洗液中,减少异相颗粒 (磁珠)表面的非特异性吸附导致的检测结果偏差,以提高实际检测的准确度和精密度。
具体实施方式
下面将结合本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
清洗液的配制
10~200mMol/L缓冲液;
0.01~1wt%表面活性剂;
100~300mMol/L无机盐;
0.5~0.1g/L防腐剂;
其中,表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的任一一类或多类混合;所述阴离子表面活性剂包括硫酸酯盐型,所述阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐,所述两性表面活性剂包括甜菜碱型,所述非离子表面活性剂包括多元醇类表面活性剂和聚氧乙烯型表面活性剂;
具体地,所述阴离子表面活性剂主要为硫酸酯盐型,分子通式为ROSO3-X+,烃基R碳原子个数在12~15之间,X多为Na+,K+,NH4+。包括脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐(AES)、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐。作为AES的市售品,包括脂肪醇聚氧乙烯硫酸钠(上海源叶生物科技有限公司)。作为聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐的市售品,包括Newcol 1020-SN(日本乳化剂株式会社)。作为聚氧乙烯多环苯基醚硫酸酯盐的市售品包括Newcol 707 SF、Newcol 707 SN(以上为日本乳化剂株式会社)等。
阳离子表面活性剂主要有烷基季铵盐,分子通式为R4N+X-,其中烃基R碳原子总数在10~16之间,4个烃基R可相同,也可不同,X多为卤素负离子如Br-,Cl-。作为烷基季铵盐的市售品,包括十烷基三甲基溴化铵(阿拉丁)、十二烷基三甲基溴化铵(Sigma)、十四烷基三甲基氯化铵(Sigma)等。
两性表面活性剂主要为甜菜碱型,一种为磺基甜菜碱,分子通式为RN+(CH3)2CH2COO-,烃基R的碳原子个数在12~18之间,另一种为氧化胺甜菜碱,分子通式为 R4N+X→O,烃基R的碳原子个数在10~16之间。作为磺基甜菜碱的市售品,包括十二烷基羟丙基磺基甜菜碱(上海圣轩生物化学有限公司),3-磺丙基十四烷基甜菜碱(阿拉丁)。作为氧化胺甜菜碱的市售品,包括椰油酰胺丙基甜菜碱(上海源叶生物科技有限公司)等。
非离子表面活性剂包括两种,一种为多元醇类表面活性剂如司盘类和吐温类,另一种为聚氧乙烯型表面活性剂,如脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、烷基酚聚氧乙烯醚,其中AEO的分子通式为RO(CH2CH2O)nH,R为碳原子个数12~18的烃基,n(即聚合度)为6~10 之间。烷基酚聚氧乙烯醚主要有TX或OP系列,聚合度在8~12之间。以上所有非离子表活亲水亲油平衡(Hydrophile Lipophilic Balance,HLB)值在8~18之间。作为司盘类市售品,包括司盘20(生工生物工程(上海)股份有限公司)。作为吐温类市售品,包括吐温20 (索莱宝),吐温40,吐温60,吐温80(以上为生工生物工程(上海)股份有限公司)。作为脂肪醇聚氧乙烯醚的市售品,包括脂肪醇聚氧乙烯醚7(HLB值12),脂肪醇聚氧乙烯醚9(HLB值13),脂肪醇聚氧乙烯醚10(13.5),脂肪醇聚氧乙烯醚15(14.5)(以上为临沂绿森)等。作为烷基酚聚氧乙烯醚的市售品,包括EMULGEN 105(HLB值9.7), EMULGEN 106(HLB值10.5),EMULGEN 108(HLB值12.1),EMULGEN 109P(HLB 值13.6),二苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚(HLB值10.5)(以上为日本花王),曲拉通X 100 (西宝生物科技(上海)股份有限公司),NP 40(Amresco)等。
缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸盐缓冲液中的一种或多种;
无机盐为氯化钠或氯化钾,防腐剂为Proclin系列或叠氮钠,所述Proclin系列包括 Proclin 300、Proclin 950。
在本说明书中采用的清洗液配方如下
将上述组分混合后,调节pH值至7.4~7.8,按照不同表活组合及用量见表1。
表1清洗液中不同表活组合及用量
本说明书中采用宁波紫园生产的FC-8小型化学发光免疫分析仪,其检测步骤如下:
检测准备程序:将本发明所述磁珠试剂、酶标抗体试剂、清洗液及底物试剂、待测样本分别加注于测定试剂卡的相应孔位;
启动检测程序:分别取定量样本,酶标抗体加入本发明所述磁珠试剂孔位混匀,37℃孵育5至10min,收集反应后的免疫磁珠颗粒;分别加入定量清洗液混匀,收集免疫磁珠颗粒(重复2~3次),将清洗好的免疫磁珠颗粒用底物试剂悬浮,测定其发光信号值。
数据处理:根据测定获得的发光信号值与样本浓度关系,计算待测样本浓度值。
实施例1
本实施例中清洗液的配方如下:
0~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 非离子表面活性剂与两性表面活性剂的混合液;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述非离子表面活性剂采用聚氧乙烯十二烷基醚,所述两性表面活性剂采用3- 磺丙基十四烷基甜菜碱,所述聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱按照重量比为4:1进行配比。即本实施例中采用表1中组别4进行配置清洗液。
(1)本实施例在清洗液清洗效果的验证
按表1组别4配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本,一份采用全血和本实施例中的清洗液进行清洗,另一份采用全血和对照液进行清洗,对照液采用贝克曼化学发光免疫清洗缓冲液。项目选择肌钙蛋白I,观察发光强度,与对照试剂进行比较。
(2)本实施例在清洗液准确性的评价
按表1组别4配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试,项目选择肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶,与对照试剂进行相关性比对。
表2实施例1清洗液准确性结果
项目名称 | 线性回归方程 | 相关系数 |
肌钙蛋白I | y=1.218x+0.225 | 0.991 |
肌酸激酶同工酶 | y=1.451x+1.473 | 0.993 |
从实验结果来看,相关系数达0.975以上,说明清洗效果极佳。
(3)本实施例在清洗液精密性的评价
按表1组别4配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶的低中高浓度样本,重复测定20次,与对照试剂比较变异系数。
表3实施例1清洗液精密度结果
从实验结果来看,从实验结果看,按本实施例配制清洗液,低中高浓度样本重复测定20次后,变异系数皆小于5%。说明本实施例清洗液清洗效果良好。
(4)本实施例在清洗液稳定性的评价
按表1组别4配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测。项目选择肌钙蛋白I,用浓度为2ng/mL 的样本重复测定10次,观察其变异系数,结果如表4所示。
表4实施例1稳定性检验结果
实施例2
本实施例中清洗液的配方如下:
10~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 阴离子表面活性剂;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述阴离子表面活性剂采用脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠。即本实施例中采用表1 中组别6进行配置清洗液。
(1)本实施例在清洗液清洗效果的验证
按表1中组别6配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本,一份采用全血和本实施例中的清洗液进行清洗,另一份采用全血和对照液进行清洗,对照液采用贝克曼化学发光免疫清洗缓冲液。项目选择肌钙蛋白I,观察发光强度,与对照试剂进行比较。
样本号 | 对照 | 实施例2 |
1 | 662 | 760 |
2 | 581 | 633 |
3 | 1066 | 857 |
4 | 814 | 648 |
5 | 705 | 538 |
6 | 621 | 602 |
7 | 887 | 652 |
8 | 552 | 484 |
9 | 617 | 585 |
10 | 863 | 826 |
(2)本实施例在清洗液准确性的评价
按实施例1中表1组6配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试,项目选择肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶,与对照试剂进行相关性比对。
表6实施例2清洗液准确性结果
项目名称 | 线性回归方程 | 相关系数 |
肌钙蛋白I | y=1.136x+0.127 | 0.988 |
肌酸激酶同工酶 | y=1.312x+0.946 | 0.995 |
从实验结果来看,相关系数达0.975以上,说明清洗效果极佳。
(3)本实施例在清洗液精密性的评价
按表1中组别6配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶的低中高浓度样本,重复测定20次,与对照试剂比较变异系数。
表7实施例2清洗液精密度结果
从实验结果看,本实施例配制清洗液,低中高浓度样本重复测定20次后,变异系数皆小于5%。说明本实施例洗液清洗效果良好。
(4)本实施例在清洗液稳定性的评价
按表1组别6配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测。项目选择肌钙蛋白I,用浓度为2ng/mL 的样本重复测定10次,观察其变异系数,结果如表8所示。
表8实施例2稳定性检验结果
实施例3
本实施例中清洗液的配方如下:
0~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 非离子表面活性剂;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述非离子表面活性剂采用NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚,所述NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚按照重量比为1:4:5进行配比。即本实施例中采用表1 中组别10进行配置清洗液。
(1)本实施例在清洗液清洗效果的验证
按表1组别10配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取10位健康人群的全血样本,一份采用全血和本实施例中的清洗液进行清洗,另一份采用全血和对照液进行清洗,对照液采用贝克曼化学发光免疫清洗缓冲液。项目选择肌钙蛋白I,观察发光强度,与对照试剂进行比较。
(2)本实施例在清洗液准确性的评价
按表1组别10配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取50位患者的全血样本进行测试,项目选择肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶,与对照试剂进行相关性比对。另取肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶的低中高浓度样本,重复测定20次,与对照试剂比较变异系数。
表9实施例3清洗液准确性结果
项目名称 | 线性回归方程 | 相关系数 |
肌钙蛋白I | y=1.537x+0.241 | 0.987 |
肌酸激酶同工酶 | y=1.271x+1.625 | 0.990 |
从实验结果来看,相关系数达0.975以上,说明清洗效果极佳。
(3)本实施例在清洗液精密性的评价
按表1组别10配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。取肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶的低中高浓度样本,重复测定20次,与对照试剂比较变异系数。
表10实施例3清洗液精密度结果
从实验结果看,按本实施例配制清洗液,低中高浓度样本重复测定20次后,变异系数皆小于5%。说明本实施例配制的清洗液清洗效果良好。
(4)本实施例在清洗液稳定性的评价
按表1组别10配制清洗液,对清洗液进行分装及样本测试。2-8℃条件下放置0天、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月后进行检测。项目选择肌钙蛋白I,用浓度为2ng/mL 的样本重复测定10次,观察其变异系数,结果如表11所示。
表11实施例1稳定性检验结果
总结:
实验数据看,以实施例1-3配制的清洗液在2-8℃条件下保存时间14个月以内时,样本CV值都在5%以内。从试剂状态来看,3种清洗液澄清透明,未出现白色絮状沉淀,说明此3种洗液稳定性好,且精密度高。
以上就本发明较佳的实施例作了说明,但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例,其具体结构允许有变化,凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:包括
10~200mMol/L缓冲液;
0.01~1wt%表面活性剂;
100~300mMol/L无机盐;
0.5~0.1g/L防腐剂;
所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂中的任一一类或多类混合。
2.根据权利要求1所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:所述阴离子表面活性剂包括硫酸酯盐型,所述阳离子表面活性剂包括烷基季铵盐,所述两性表面活性剂包括甜菜碱型,所述非离子表面活性剂包括多元醇类表面活性剂和聚氧乙烯型表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:
所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、哌嗪-1,4-二乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸盐缓冲液中的一种或多种;
所述无机盐为氯化钠或氯化钾;
所述防腐剂为Proclin系列或叠氮钠,所述Proclin系列包括Proclin 300、Proclin950。
4.根据权利要求3所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:所述缓冲液PH值为7.0~8.5。
5.根据权利要求3所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:包括
10~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 非离子表面活性剂与两性表面活性剂的混合液;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述非离子表面活性剂采用聚氧乙烯十二烷基醚,所述两性表面活性剂采用3-磺丙基十四烷基甜菜碱,所述聚氧乙烯十二烷基醚与3-磺丙基十四烷基甜菜碱按照重量比为4:1进行配比。
6.根据权利要求3所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:包括
10~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 阴离子表面活性剂;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述阴离子表面活性剂采用脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠。
7.根据权利要求1所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:包括
0~200mMol/L 三羟甲基氨基甲烷;
0.01~1wt% 非离子表面活性剂;
100~300mMol/L 氯化钠;
0.5~0.1g/L Proclin300;
其中,所述非离子表面活性剂采用NP 40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚,所述NP40、Tween 20和聚氧乙烯十二烷基醚按照重量比为1:4:5进行配比。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种用于化学发光免疫检测的清洗液,其特征在于:所述清洗液应用于即时检测平台。
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