CN111983217A - 一种样本处理液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种样本处理液及其应用。本发明通过在样本处理液中添加盐类并联用两性表面活性剂、非离子表面活性剂，能够有效提高免疫检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明公开了一种样本处理液及其应用。
背景技术
RNA包膜病毒是RNA病毒中的一大家族，其RNA病毒粒子外有脂质包膜，病毒可以通过包膜进出靶细胞，从而具有较强的侵染能力。常见的流感病毒、冠状病毒均属于RNA包膜病毒。2019新型冠状病毒(2019-nCoV，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。
免疫检测基于抗原抗体特异性结合的免疫学原理，常用的方法主要有免疫层析检测、ELISA检测或化学发光法检测。不同样本因为成分复杂并且变化较大，如果不进行相应处理易发生抗原抗体结合之外的非特异性反应，导致产生不良的交叉反应、降低检测的灵敏度等等。
以检测新冠病毒为例，目前市售的免疫学检测产品普遍灵敏度较低，有漏检的风险。为进一步提高检测灵敏度，提出本发明。
发明内容
为提高现有免疫检测产品的灵敏度，本发明公开一种在与待检成分发生抗原抗体反应的免疫检测中，使待检样本与含有可溶性镁盐的样本处理液接触，以提高检测的灵敏度。
本发明包括以下一些实施方式：
一种在免疫检测中的样本处理方法，使待检样本与含有可溶性镁盐的样本处理液接触。
在一些实施方式中，所述样本可以是任何怀疑存在待检成分的样本，没有特别限定，例如咽拭子采集样本、口咽拭子采集样本、鼻咽拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、外周血样本、血浆样本或血清样本；在一些实施方式中，样本例如咽拭子采集样本、或例如鼻咽拭子采集样本，但不限于此。
在一些实施方式中，所述样本为含有待检成分的样本；在一些实施方式中，所述待检成分为RNA病毒；在一些实施方式中，所述RNA病毒为RNA包膜病毒；在一些实施方式中，所述RNA包膜病毒为冠状病毒或流感病毒中的至少任意一种；在一些实施方式中，所述RNA包膜病毒为例如2019-nCoV、例如SARS、或例如流感病毒，但不限于此。
本发明中，使待检样本与样本处理液接触包括例如将待检样本加入到样本处理液中混匀再加入至免疫检测工具(例如免疫层析中的样品垫)中，例如将待检样本和样本处理液分别加入至免疫检测工具(例如免疫层析中的样品垫)中，例如将样本处理液先行固定于免疫检测工具(例如免疫层析中的样品垫)中再加入待检样本，或以上形式的组合。
在一些实施方式中，可溶性镁盐在样本处理液中的终浓度为10-400mM；在一些实施方式中，可溶性镁盐在样本处理液中的终浓度为40-160mM；在一些实施方式中，可溶性镁盐在样本处理液中的终浓度为80-160mM；在一些实施方式中，可溶性镁盐在样本处理液中的终浓度包括例如10mM、例如40mM、例如80mM、例如160mM、例如200mM、例如260mM、例如320mM、例如380mM、例如400mM，但不限于此。
在一些实施方式中，两性表面活性剂S9在样本处理液中的终浓度为0.1-1.5(w/v)％；在一些实施方式中，S9在样本处理液中的终浓度为0.25-1(w/v)％；在一些实施方式中，S9在样本处理液中的终浓度为0.5-1(w/v)％；在一些实施方式中，S9在样本处理液中的终浓度包括例如0.1(w/v)％、例如0.25(w/v)％、例如0.5(w/v)％、例如1(w/v)％、例如1.2(w/v)％、例如1.5(w/v)％，但不限于此。
在一些实施方式中，样本处理液进一步包含缓冲液；在一些实施方式中，所述缓冲液包括例如Tris-HCl、例如PB(磷酸缓冲液)、例如BB(硼酸缓冲液)，但不限于此。在一些实施方式中，缓冲成分使用浓度为10-50mM；在一些实施方式中，所述缓冲成分使用浓度包括例如10mM、例如15mM、例如25mM、例如30mM、例如35mM、例如40mM、例如50mM，但不限于此。在一些实施方式中，缓冲液的pH为8.0-9.5；在一些实施方式中，所述缓冲液的pH包括例如8.0、例如8.2、例如8.5、例如8.8、例如9.0、例如9.2、例如9.5，但不限于此。
在一些实施方式中，样本处理液进一步包含惰性蛋白；在一些实施方式中，所述惰性蛋白包括例如酪蛋白、例如BSA，但不限于此。在一些实施方式中，惰性蛋白在样本处理液中的终浓度为0.3-1(w/v)％；在一些实施方式中，所述惰性蛋白在样本处理液中的终浓度包括例如0.3(w/v)％、例如0.5(w/v)％、例如0.8(w/v)％、例如1(w/v)％，但不限于此。
在一些实施方式中，样本处理液进一步包含氯化钠；在一些实施方式中，氯化钠在样本处理液中的终浓度为50-200mM；在一些实施方式中，氯化钠在样本处理液中的终浓度包括例如50mM、例如100mM、例如150mM、例如200mM，但不限于此。
在一些实施方式中，样本处理液进一步包含非离子表面活性剂；非离子表面活性剂可以提高亲水性和润湿性降低液体的表面张力，有利于提高对待检成分的检测信号，具体效果需要取决于表面活性剂与其它基质间的配伍性；在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂包括例如tween 20(吐温20)、例如tween 40(吐温40)、例如Pluronic F-127(普兰尼克F127)、例如Triton X-405(曲拉通405)、例如Triton X-100(曲拉通100)，但不限于此。
在一些实施方式中，非离子表面活性剂在样本处理液中的终浓度为0.1-1.5(w/v)％；在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂在样本处理液中的终浓度为0.25-1(w/v)％；在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂在样本处理液中的终浓度为0.5-1(w/v)％；在一些实施方式中，所述非离子表面活性剂在样本处理液中的终浓度包括例如0.1(w/v)％、例如0.25(w/v)％、例如0.5(w/v)％、例如1(w/v)％、例如1.2(w/v)％、例如1.5(w/v)％，但不限于此。
在一些实施方式中，本发明的样本处理液在免疫检测中的应用。本发明所述免疫检测应做广义理解，其指通过抗原抗体特异性结合而进行的检测方法，包括例如免疫层析检测、例如ELISA检测、例如化学发光法检测，但不限于此。本领域技术人员应该理解，本发明的样本处理液可用于抗原或抗体的免疫检测反应。在一些实施方式中，例如含新冠病毒的样本经本发明样本处理液接触作用后，与标记、包被端蛋白发生抗原抗体反应，实现检测新冠病毒的作用。
在一些实施方式中，本发明方案包括前述任一种实施方式的样本处理液。
在一些实施方式中，本发明的检测试剂盒或检测试纸条，包括前述任一种实施方式的样本处理液。本发明所述检测试剂盒应做广义理解，其主要指承载免疫检测相关试剂的工具。在一些实施方式中，检测试剂盒还可以包括一些配套试剂。本发明所述检测试纸条包括吸水纸、标记物结合垫、包被膜、样品垫和底板。
具体实施方式
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。提供以下实施例以说明本发明的实施方案，并非意在限制本发明。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。
具体实施方式中未详细描述的方法可参考本领域常规方法或厂家说明书；具体实施方式中未描述出处的试剂均可通过商业化渠道获得。
本发明中，可溶性镁盐的定义是指对于1g(ml)镁盐，其溶解所需要的溶剂体积<100ml，即为可溶性镁盐。
本发明中，浓度单位mM是指mmol/L，M是指mol/L。
标记
将可与待检成分发生抗原抗体反应的蛋白稀释后标记于30-80nm粒径的胶体金颗粒上，标记后加入BSA，经离心弃上清后用保护液再溶解胶体金沉淀，将再溶解得到的胶体金滴加至玻璃纤维素膜并干燥，得到标记物结合垫。
包被
将可与待检成分发生抗原抗体反应的蛋白稀释后包被于硝酸纤维素膜，划膜参数1.0μl/cm。包被完成后置于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度37℃，干燥时间2h，得到包被膜。
组装
将标记物结合垫、包被膜与其它材料(底板、吸水纸、样品垫)组装，裁切成2.5mm，制成相应的免疫检测试纸条。
实施例1
(基础液1)基础液1的配方：0.5(w/v)％酪蛋白，150mM NaCl，25mM Tris-HCl，pH9.0；
(基础液1-1)基础液1-1的配方：向基础液1中添加1.0(w/v)％无水硫酸钠；
(基础液1-2)基础液1-2的配方：向基础液1中添加1.0(w/v)％柠檬酸三钠；
(基础液1-3)基础液1-3的配方：向基础液1中添加1.0(w/v)％氯化锂；
(基础液1-4)基础液1-4的配方：向基础液1中添加1.0(w/v)％氯化镁；
(基础液1-5)基础液1-5的配方：向基础液1中添加1.0(w/v)％硫酸镁；
为探究样本处理液中的最佳盐成分，对几种盐类的性能进行了比较。
将上述成分作为样本处理液滴加至空白样品垫，待干燥后组装至免疫层析装置，检测时将经梯度稀释的新冠病毒质控品滴加至处理后的样品垫上。
结果记录为胶体金色卡读值，数值越小，即显色越强，说明灵敏度越高。
结果如表1表明，向基础液1中添加可溶性镁盐时，灵敏度得到提高。
表1、实施例1的检测结果
| 质控品 | 1μg/ml | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 0.5ng/ml |
| 基础液1 | C3 | C5 | C8 | B |
| 基础液1-1 | C2 | C4+ | C7 | C9 |
| 基础液1-2 | C3+ | C4 | C7 | C9 |
| 基础液1-3 | C3+ | C4- | C7+ | B |
| 基础液1-4 | C2+ | C3- | C7+ | C9 |
| 基础液1-5 | C2+ | C3 | C6 | C9 |
实施例2
(基础液2)基础液2的配方：0.5(w/v)％酪蛋白，150mM NaCl，80mM硫酸镁，25mMTris-HCl，pH 9.0；
(基础液2-1)基础液2-1的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％tween20；
(基础液2-2)基础液2-2的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％tween40；
(基础液2-3)基础液2-3的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％Pluronic F-127；
(基础液2-4)基础液2-4的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％Triton X-405；
(基础液2-5)基础液2-5的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％Triton X-100；
(基础液2-6)基础液2-6的配方：向基础液2中添加0.5(w/v)％S9；
为进一步探究处理液中的最佳表面活性剂组分，对几种表面活性剂的性能进行了比较。将上述基础液作为样本处理液，使用方法同实施例1。
结果如表2表明，向基础液2中添加S9时，灵敏度较其它表面活性剂更高。
表2、实施例2的检测结果
| 质控品 | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| 基础液2 | C3 | C6 | C8 | C9 | B |
| 基础液2-1 | C3 | C6+ | C8+ | C9+ | C9- |
| 基础液2-2 | C3 | C6+ | C8+ | C9+ | C9- |
| 基础液2-3 | C3+ | C5 | C8 | C9+ | C9- |
| 基础液2-4 | C3+ | C5 | C8 | C9+ | C9- |
| 基础液2-5 | C3+ | C5 | C8 | C9+ | C9- |
| 基础液2-6 | C2 | C4 | C7 | C8 | C9 |
实施例3
(基础液3)基础液3的配方：0.5(w/v)％酪蛋白，150mM NaCl，80mM硫酸镁，0.5(w/v)％S9，25mM Tris-HCl，pH 9.0；
(基础液3-1)基础液3-1的配方：向基础液3中添加0.5(w/v)％tween20；
(基础液3-2)基础液3-2的配方：向基础液3中添加0.5(w/v)％tween40；
(基础液3-3)基础液3-3的配方：向基础液3中添加0.5(w/v)％Pluronic F-127；
(基础液3-4)基础液3-4的配方：向基础液3中添加0.5(w/v)％Triton X-405；
(基础液3-5)基础液3-5的配方：向基础液3中添加0.5(w/v)％Triton X-100；
为进一步提高灵敏度，将实施例2中得到的优势表面活性剂S9同其它表面活性剂联用。将上述基础液作为样本处理液，使用方法同实施例1。
结果如表3表明，当联用S9及Triton X-100时灵敏度得到进一步提高，故将引入硫酸镁、并且联用S9及Triton X-100的样本处理液命名为COV-SP并进行后续的优化。
表3、实施例3的检测结果
| 质控品 | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| 基础液3 | C2 | C4 | C7 | C8 | C9 |
| 基础液3-1 | C2 | C4 | C7 | C8 | C9 |
| 基础液3-2 | C2 | C4 | C7 | C8 | C9 |
| 基础液3-3 | C2 | C4 | C7 | C8 | C9 |
| 基础液3-4 | C2 | C4+ | C7 | C8 | C9 |
| 基础液3-5 | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
实施例4
(S1)S1样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了其中不加入硫酸镁；
(S2)S2样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中硫酸镁浓度改为40mM；
(S3)S3样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中硫酸镁浓度改为160mM；
将COV-SP与本实施例S1-S3配方进行对比。样本处理液使用方法同实施例1。
结果如表4表明，引入硫酸镁的组(COV-SP)较未引入(S1)灵敏度高1C左右；将硫酸镁用量降至40mM或提高至160mM，灵敏度均与COV-SP一致；取100份健康人咽拭子样本做特异性验证，均未检出假阳。
表4、实施例4的检测结果
| 质控品 | 1μg/ml | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| S1 | C1 | C3 | C4 | C7 | C9 | B+ |
| S2 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| S3 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| COV-SP | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
实施例5
(S4)S4样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中0.5(w/v)％S9+0.5(w/v)％Triton X-100联用组替换为1(w/v)％S9；
(S5)S5样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中0.5(w/v)％S9+0.5(w/v)％Triton X-100联用组替换为1(w/v)％Triton X-100；
(S6)S6样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中S9浓度改为0.25(w/v)％；
(S7)S7样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中S9浓度改为1(w/v)％；
(S8)S8样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中Triton X-100浓度改为0.25(w/v)％；
(S9)S9样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中Triton X-100浓度改为1(w/v)％；
将COV-SP与本实施例S4-S9配方进行对比。样本处理液使用方法同实施例1。
结果如表5，可以得到，单独用S9(S4)或单独用Triton X-100(S5)，灵敏度都不如二者联用。取100份健康人咽拭子样本做特异性验证，均未检出假阳。
表5、实施例5的检测结果
| 质控品 | 1μg/ml | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| S4 | C1 | C3+ | C4 | C7 | C8- | B+ |
| S5 | C1 | C2 | C4+ | C7+ | C8 | C9 |
| S6 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| S7 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| S8 | C1 | C2 | C4+ | C7+ | C8- | C9- |
| S9 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| COV-SP | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
实施例6
(COV-SP-B)COV-SP-B样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中25mM Tris-HCl，pH 9.0改为25mM PB，pH 8.0；
(COV-SP-C)COV-SP-C样本处理液的配方：与COV-SP一致，除了将其中25mM Tris-HCl，pH 9.0改为25mM BB，pH 9.0；
将COV-SP与本实施例COV-SP-B、COV-SP-C配方进行对比。样本处理液使用方法同实施例1。
将COV-SP-B、COV-SP-C同COV-SP对比，结果如表6，可以得到，用其它缓冲体系如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液作为替代，灵敏度能达到Tris-HCl一样的水平。
表6、实施例6的检测结果
| 质控品 | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| COV-SP-B | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| COV-SP-C | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| COV-SP | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
实施例7
方式1：将COV-SP作为样本稀释液与新冠病毒质控品充分混匀后滴加至空白样品垫；
方式2：将COV-SP同时作为样本稀释液(同方式1)与样品垫处理液(同实施例1)；
结果如表7表明，使用COV-SP与样本混匀后加入至免疫检测工具中，灵敏度也能得到极大提高；两种处理方式叠加使用，灵敏度相当。
取100份健康人咽拭子样本做特异性验证，未检出假阳。
表7、实施例7的检测结果
| 质控品 | 1μg/ml | 0.1μg/ml | 25ng/ml | 5ng/ml | 0.5ng/ml | 0.1ng/ml |
| 方式1 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
| 方式2 | C1+ | C2+ | C3 | C6 | C8 | C9 |
实施例8
将COV-SP作为检测流感病毒的样本处理液，与基础液1进行对比。样本处理液使用方法同实施例1。
结果如表8表明，将COV-SP应用于流感项目同样能极大提高检测的灵敏度。
表8、实施例8的检测结果
| 质控品 | 流感B病毒/1K | 流感B病毒/5K | 流感B病毒/10K |
| 基础液1 | C4 | C9 | B |
| COV-SP | C2+ | C7 | C8 |
实施例9
将COV-SP作为检测SARS病毒的样本处理液，与基础液1进行对比。样本处理液使用方法同实施例1。
结果如表9表明，将COV-SP应用于SARS项目同样能极大提高检测的灵敏度。
表9、实施例9的检测结果
| 质控品 | 5μg/ml | 1μg/ml | 0.5μg/ml | 50ng/ml | 10ng/ml | 5ng/ml |
| 基础液1 | C2 | C3 | C4 | C8 | C9- | B |
| COV-SP | C1+ | C1 | C2- | C6 | C8 | C9 |
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种在免疫检测中的样本处理方法，其特征在于，使待检样本与含有可溶性镁盐的样本处理液接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本处理液中的可溶性镁盐包含硫酸镁、氯化镁中的至少任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本处理液中的可溶性镁盐的终浓度为10-400mM；
可选的，所述可溶性镁盐在所述样本处理液中的终浓度为40-160mM；
可选的，所述可溶性镁盐在所述样本处理液中的终浓度为80-160mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本处理液进一步含有S9。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本处理液中的S9的终浓度为0.1-1.5(w/v)％；
可选的，S9在所述样本处理液中的终浓度为0.25-1(w/v)％；
可选的，S9在所述样本处理液中的终浓度为0.5-1(w/v)％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述样本处理液还包含缓冲液、惰性蛋白、氯化钠、非离子表面活性剂至少任意一种；例如非离子表面活性剂为tween20、tween 40、Pluronic F-127、Triton X-405或Triton X-100；例如非离子表面活性剂在样本处理液中的终浓度为0.1-1.5(w/v)％；进一步为0.25-1(w/v)％；更进一步为0.5-1(w/v)％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为含有待检成分的样本；
可选的，所述待检成分为RNA病毒；
可选的，所述RNA病毒为RNA包膜病毒；
可选的，所述RNA包膜病毒为冠状病毒或流感病毒中的至少任意一种，例如2019-nCoV，例如SARS。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫检测为免疫层析检测、ELISA检测或化学发光法检测。
9.权利要求1-8中任一项所述的样本处理液。
10.一种检测试剂盒或检测试纸条，其特征在于，包含权利要求9所述的样本处理液。
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