CN107356744B - 一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种循环肿瘤细胞的分选和/或富集的方法，本发明提供的方法利用生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体和生物素标记的抗Trop2单克隆抗体与亲和素包被的磁珠之间极高且稳定的亲和力，提供了一种免疫磁珠方法来分选和/或富集循环肿瘤细胞。本发明还提供了一种用于肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒。本发明的方法可以灵敏地捕获肿瘤细胞，适用于肿瘤细胞的广谱性筛选，并且克服了普通磁珠筛选的位阻效应缺陷，达到高效捕获肿瘤细胞的效果。

Description

一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法，本发明还涉及一种用于循环肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是脱落进入血液循环的肿瘤细胞，大量实验已经证实CTC检测有助于肿瘤复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。但是CTC在外周血中的数量极少，通常在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅有数个肿瘤细胞。因此，为了提高循环肿瘤细胞的检出率，通常需要在检测前进行循环肿瘤细胞的富集。循环肿瘤细胞的富集可以通过使用肿瘤细胞的特异性标志物来分离(免疫分离)或利用细胞形态特征的差异(如细胞体积和密度等)来实现。
常用的细胞富集技术主要有免疫磁珠分选、密度梯度离心和细胞过滤等。免疫磁珠分选是以抗原抗体结合为基础的循环肿瘤细胞分离方法，是目前最常用的方法(如CN201110005376.8，一种从组织中分离富集靶细胞的方法；循环肿瘤细胞的检测及其在乳腺癌患者中的临床应用，马德亮等，临床肿瘤学杂志，2010年11月第15卷第11期；循环肿瘤细胞的检测，李帅等，医学综述，2010年3月第16卷第6期)等，其基本原理是利用肿瘤细胞和正常血液细胞表达的不同表面抗原标记，设计不同的抗体与之结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和灵敏性，达到区别和富集循环肿瘤细胞的目的(多是将抗体和磁珠结合，在磁场中达到分离的目的)。抗体免疫磁珠是将特异性单抗与磁珠相结合，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，没有相应表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞分离。
但是，当前抗体与磁珠的直接偶联通常采用NHS-活性酯法，即活化的羧基化磁珠与抗体的伯氨基基团反应。其中，氨基的电负性越强，偶联效率越高。然而带电氨基酸往往在抗体结构稳定和在抗体与抗原的结合过程中扮演重要的角色。这些关键氨基酸与磁珠的交联会严重影响抗体结构的稳定性和抗体的活性。另外，在磁珠-抗体直接偶联的方法中，磁珠与抗体上的氨基酸直接交联，由于磁珠的空间位阻会影响抗体的结构，容易造成抗体的疏水区外露，容易造成抗体的聚焦而失去活性，从而影响其产品的稳定性。而且，由于外周血中循环肿瘤细胞(CTC)数量稀少，且具有异质性和易聚集成团等特点。该方法在灵敏性、特异性和可重复性等方面也存在诸多问题。
申请号为CN201410497998.0的中国专利申请公开了一种抗体免疫磁珠方法，它公开了联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。但该方法采用不具有选择性的醛基偶联方法。醛基既可以和氨基反应，也可以和羧基反应。该方法经常用在蛋白和蛋白之间的偶联反应中。蛋白和蛋白之间的多聚交联可以通过超高速离心/分子筛和超滤等方法去除。由于该方法的反应过程不可控，且抗体自身的交联无法有效去除，抗体和磁珠偶联一般不会采用这种方法。其反应过程的不可控会造成抗体和磁珠的偶联效率低下，且批与批之间的差异会较大。因此，在实际的生产应用中，该方法很难生产出稳定的产品。另外，抗体和磁珠的直接偶联会导致磁珠对抗体有较强的位阻效应，交联后对抗体的活性影响较大，容易导致肿瘤细胞捕获效率受影响。其优化的三种抗体联用比例也不具有重复性。
基于此，当前对可以用于实际生产应用的重复性高、效率高的循环肿瘤细胞富集方法存在需求。
发明内容
因此，为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种循环肿瘤细胞的分选和/或富集的方法，本发明提供的方法利用生物素标记的抗Her2、EpCAM和Trop2抗体与亲和素包被的磁珠之间极高且稳定的亲和力，提供了一种免疫磁珠方法来分选和/或富集循环肿瘤细胞。本发明提供的方法极大地提高了循环肿瘤细胞的捕获效率。本发明的另一目的在于提供一种用于肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒。
一方面，本发明提供了一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法，所述方法包括以下步骤：
1)使用生物素标记抗Her2(人表皮生长因子受体2)单克隆抗体、抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)单克隆抗体和抗Trop2(人滋养层细胞表面抗原2)单克隆抗体，并将其混合；
其中，三种单克隆抗体混合后的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体20-40％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体10-25％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体40-60％；
2)将步骤1)得到的混合物加入到待分选的细胞液中；
其中，所述混合物与细胞液的体积比为1～5:1000；
3)加入链霉亲和素偶联的磁珠，在4℃孵育20分钟，收集磁珠，即得；
其中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比是1000:10～30。
优选地，在步骤1)中，三种单克隆抗体混合后的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体35％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体20％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体45％；
优选地，在步骤2)中，所述混合物与细胞液的体积比为2～3:1000；
优选地，在步骤3)中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比为1000:20。优选地，本发明所述的肿瘤选自乳腺癌、食道癌、非小细胞肺癌、子***、结肠癌、胃癌、子宫癌和/或鼻咽癌。
优选的，所述抗EpCAM单克隆抗体选自EBA-1(产品名称为Ep-CAM Antibody(EBA-1)，产品编号为sc-66020)、AUA1(产品名称为Ep-CAM Antibody(AUA1)，产品编号为sc-53277)或C-10(产品名称为Ep-CAM Antibody(C-10)，产品编号为sc-25308)，均来源于Santa Cruz Biotechnology公司)，所述抗Her2的单克隆抗体选自24D2(产品名称为NeuAntibody(24D2)，产品编号为sc-23864)、0.N.211(产品名称为Neu Antibody(0.N.211)，产品编号为sc-71667)或3B5(产品名称为Neu Antibody(3B5)，产品编号为sc-33684)，均来源于Santa Cruz Biotechnology公司)，所述抗Trop2的单克隆抗体选自162-46(产品名称为BV421Mouse Anti-Human Trop-2Clone 162-46，产品货号为563243)、B-9(产品名称为TROP-2Antibody(B-9)，产品编号为sc-376746)或F-5(产品名称为TROP-2Antibody(F-5)，产品编号为sc-376181)，其中162-46来源于BD Bioscience，B-9、F-5来源于Santa CruzBiotechnology公司)。
优选的，在步骤1)中，所述三种生物素标记的单克隆抗体通过包括以下步骤的方法制备：
a.使用超滤柱纯化抗体溶液；
b.加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应0.5～4h；
其中，NHS-PEG4-Biotin与抗体的摩尔浓度比例为10-50:1；
优选地在室温反应下0.5-3h；更优选地在室温下反应1h；
c.分离纯化以去除游离生物素，得到生物素标记的单克隆抗体溶液。
优选地，所述分离纯化使用葡聚糖凝胶进行。
优选地，所述步骤a通过包括以下步骤的方法完成：
①制备标记反应溶液；
所述标记溶液溶液包括以下组分：
NaCl：10-300mmol/L；KCl：1-5mmol/L；Na2HPO4：5-50mmol/L；KH2PO4：1-5mmol/L；
优选地，所述标记反应溶液包括以下组分：
NaCl：137mmol/L；KCl：2.7mmol/L；Na2HPO4：10mmol/L；KH2PO4：2mmol/L；
②于超滤柱中加入标记反应溶液，然后加入单克隆抗体，混匀，然后离心，弃滤液；
其中，所述标记溶液与所述单克隆抗体的体积质量比为1:1-50(μl/μg)；
优选地，重复步骤2～3次；
③混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置后，将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，离心收集滤液，取PBS于超滤柱中混匀，静置；倒置超滤柱，离心收集滤液；
在一个优选的实施方案中，所述生物素标记的单克隆抗体通过包括以下步骤的方法制备：
于超滤柱中加入200μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO410mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，加入500μg单克隆抗体，混匀；4℃条件下3500g离心2min，弃滤液；于超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下5000g离心2min；重复上述在超滤柱中加入100μl标记反应溶液，混匀，4℃条件下，5000g离心2min的步骤2次；
混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃条件下1000g离心2min，收集滤液；取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min；倒置超滤柱，4℃条件下3500g离心2min，收集滤液；将上述滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)调节抗体浓度到2mg/ml(0.25ml)。
超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液(0.1-0.5mmol/L)，室温反应1h。葡聚糖凝胶分离纯化，去除游离生物素；得到生物素标记的单克隆抗体溶液。
优选的，在步骤2)中，所述生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体在细胞液中使用的终浓度分别为300μg/ml-600μg/ml。
优选地，所述生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体在细胞液中使用的终浓度分别为500μg/ml。
优选地，所述生物素标记的抗Her2单克隆抗体为生物素标记的24D2、所述生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体为生物素标记的EBA-1、所述生物素标记的抗Trop2单克隆抗体为生物素标记的162-46(24D2、EBA-1、162-46均来源于Santa Cruz Biotechnology公司)。
另一方面，本发明提供了一种用于循环肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒，所述试剂盒包括生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体和生物素标记的抗Trop2单克隆抗体的混合物。
优选地，三种单克隆抗体的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体20-40％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体10-25％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体40-60％；
优选为，三种单克隆抗体的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体35％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体20％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体45％；
优选地，本发明的试剂盒还包括链霉亲和素标记磁珠(来源公司：BD Bioscience，货号：557812)。
再一方面，本发明还提供了本发明的方法和试剂盒在分选和/或富集循环肿瘤细胞中的用途。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
1)本发明涉及一种联用生物素偶联的三种单克隆抗体分选循环肿瘤细胞的方法，本发明采用抗EpCAM、抗Her2和抗Trop2单克隆抗体的混合物，它们可以灵敏地捕获肿瘤细胞，适用于肿瘤细胞的广谱性筛选，并且克服了普通磁珠筛选的位阻效应缺陷，达到高效捕获肿瘤细胞的效果。
2)本领域技术人员已知的是，由于各种抗体与肿瘤细胞抗原结合的效率不一致，联用三种抗体进行肿瘤细胞富集，会直接影响肿瘤细胞的捕获效果，三种抗体联用也会彼此影响结合效率。但是，本发明的发明人意外地发现，本发明的三种单克隆抗体在合适的质量百分比范围内和合理的终浓度下，能最大程度地扩大肿瘤细胞的覆盖率，从而极大地提高了效率，并节约了成本。
3)本发明采用生物素标记的单克隆抗体和亲和素化的磁珠组成的免疫磁珠复合物替代现有技术中采用的抗体-磁珠直接交联的方法，有效地保证了免疫磁珠的活性，提高对肿瘤细胞的捕获效率。本发明所采用的方法抗体与磁珠的加入比例在4:1至1:1之间，大大节省作为核心试剂的抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
本发明中抗EpCAM单克隆抗体为EBA-1、AUA1和C-10，均购自SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY；抗Her2单克隆抗体为24D2、0.N.211和3B5，均购自SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY；抗Trop2单克隆抗体为162-46、B-9和F-5，其中162-46购自BD Bioscience，B-9或F-5购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY。本发明中的磁珠购自BD Bioscience，货号：557812。
实施例1联用生物素偶联的三种单克隆抗体分选肿瘤细胞
1、生物素标记的单克隆抗体的制备
1.1生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体的制备
于超滤柱(Millipore，货号：UFC501096)中加入200μl标记反应溶液(NaCl137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，加入500μg抗EpCAM单克隆抗体(EBA-1)，混匀。4℃条件下3500g离心2min，弃滤液；于超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下5000g离心2min；重复上述在超滤柱中加入100μl标记反应溶液，混匀，4℃条件下，5000g离心2min的步骤2次；
混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃条件下1000g离心2min，收集滤液。取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃条件下3500g离心2min，收集滤液。将上述滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)调节抗体浓度到2mg/ml(0.25ml)。
超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液(0.1-0.5mmol/L)，室温反应1h。葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)，得到生物素标记的单克隆抗体溶液A。
1.2生物素标记的单克隆抗体抗Her2抗体的制备
于超滤柱(Millipore，货号：UFC501096)中加入200μl标记反应溶液(NaCl137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，加入500μg抗Her2单克隆抗体(24D2)，混匀。4℃条件下3500g离心2min，弃滤液；于超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下5000g离心2min；重复上述在超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下，5000g离心2min的步骤2次；
混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃条件下1000g离心2min，收集滤液。取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃条件下3500g离心2min，收集滤液。将上述滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)调节抗体浓度到2mg/ml(0.25ml)。
超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液(0.1-0.5mmol/L)，室温反应1h。葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)，得到生物素标记的单克隆抗体溶液B。
1.3生物素标记的单克隆抗体抗Trop2抗体的制备
于超滤柱(Millipore，货号：UFC501096)中加入200μl标记反应溶液(NaCl137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，加入500μg抗Trop2单克隆抗体(162-46)，混匀。4℃条件下3500g离心2min，弃滤液；于超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下5000g离心2min；重复上述在超滤柱中加入100μl标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)，混匀，4℃条件下，5000g离心2min的步骤2次；
混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃条件下1000g离心2min，收集滤液。取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃条件下3500g离心2min，收集滤液。将上述滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液(NaCl 137mmol/L；KCl2.7mmol/L；Na2HPO4 10mmol/L；KH2PO4 2mmol/L)调节抗体浓度到2mg/ml(0.25ml)。
超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液(0.1-0.5mmol/L)，室温反应1h。葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)，得到生物素标记的单克隆抗体溶液C。
2、流式细胞法检测抗体的活性
SKBR3细胞为Her2受体阳性细胞系，可以和Her2抗体特异性地结合；MCF-7细胞为Epcam受体阳性细胞系，可以和Epcam抗体特异性地结合；H1650细胞为Trop2受体阳性细胞系，可以和Trop2抗体特异性地结合；为了验证Her2抗体、Epcam抗体、Trop2抗体的活性，将生物素标记的单克隆抗体的制备过程中得到的单克隆抗体溶液A、B和C分别与SKBR3细胞、MCF-7细胞、H1650细胞孵育，利用流式细胞法检测结合信号。
2.1固定液配制：将细胞保存液A(250μl)和细胞保存液B(250μl)混合后于室温避光放置15min，待用。
2.2SKBR3细胞、MCF-7细胞、H1650细胞收集：用2ml 0.25％的胰酶消化细胞，加入5ml培养基终止，1000rpm离心5min，弃上清液，加入500ul的PBS重悬细胞。
2.3SKBR3细胞、MCF-7细胞、H1650细胞固定：将500μl细胞悬液和500ul固定液混匀，于室温避光放置1h。700g，5min离心，弃上清液，加入1ml结合缓冲液重悬细胞进行细胞计数，并用结合缓冲液将细胞稀释成2.8×105个/ml。
2.4抗体稀释：用结合缓冲液进行抗体梯度稀释。
2.5抗体孵育：将稀释好的抗体按100ul/管和100μl细胞悬液(约2.8万个)混合，于4℃震荡孵育30min。
2.6细胞清洗：每管加入800ul PBST，700g离心5min，吸弃900μl上清液，加入900μlPBST，700g离心5min，吸弃900μl上清液。
2.7二抗孵育：每管加入100ul二抗，于4℃避光震荡孵育30min。
2.8重复步骤2.6进行细胞清洗。
2.9上机检测：重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
2.9数据分析：数据用Softmax5.3软件进行处理。
Delta F％＝(实验组荧光值-阴性组荧光值)/阴性组荧光值*100％。表示绝对荧光值相对阴性值的百分比。
3、肿瘤细胞分选和/或富集
实验室培养来自中科院的乳腺癌细胞(MCF-7，购自中国科学院细胞库)、肺癌细胞(H1650，购自中国科学院细胞库)、结肠癌细胞(SW480，购自中国科学院细胞库)。将细胞稀释至50000个/ml，每8ml血液加入4.8μl，共240个/管。
在8ml血液样本中加入10ml固定液，固定24h以上。血液样品700g离心10min，后去上清。加45ml红细胞裂解液，室温旋转裂解15min。500g离心5min，去上清。加入结合缓冲液10ml重悬细胞，清洗细胞一次，300g离心5min。去上清，加适量的清洗结合缓冲液，定容至1ml。按比例加入A、B、C三种生物素标记的抗体混合物、FITC标记的抗CK抗体和APC标记的抗CD45抗体，其中生物素标记的抗Her2抗体、生物素标记的抗EpCAM抗体、生物素标记的抗Trop2抗体混合物在细胞液中使用的终浓度为500μg/ml，4℃旋转孵育30min，加清洗缓冲液10ml清洗细胞1次，300g离心后去上清。加入由链霉亲和素标记的磁珠和FITC增强剂组成的混合溶液1ml，待分选的细胞液与磁珠的体积比是1000：20，4℃旋转孵育20min。进行肿瘤细胞捕获。
3.1细胞染色结果分析
通过荧光抗体在显微镜下观察细胞的染色情况，对肿瘤细胞进行计数，计算回收率。
Figure BDA0001349032190000101
Leica DM6000M显微镜扫描结果的分析：以DAPI染细胞核呈现蓝色荧光来识别有核细胞，白细胞表达CD45、肿瘤细胞不表达CD45，可用标记的CD45抗体来识别白细胞，CK主要分布于上皮细胞，因此CK8+CD45-的细胞为肿瘤细胞，CK8-CD45+的细胞为白细胞。
实施例2三种抗体的选择
如实施例1所述生物素抗体制备方法和流式细胞法检测抗体的活性方法，其中生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体的Delta F％值由下表1-3所示：
表1 Her2抗体结合SKBR3细胞Delta F％统计
Figure BDA0001349032190000102
表2 Epcam抗体结合MCF-7细胞Delta F％统计
Figure BDA0001349032190000103
表3 Trop2抗体结合H1650细胞Delta F％统计
Figure BDA0001349032190000104
Figure BDA0001349032190000111
从表1、表2、表3中可以得知，对于Her2单克隆抗体，克隆号为24D2的Her2抗体效果最好。对于Epcam单克隆抗体，克隆号为EBA-1的Epcam抗体效果最好。对于Trop2单克隆抗体，克隆号为162-46的Trop2抗体效果最好。
实施例3三种不同的单克隆抗体混合比例的确定
如实施例1所述，其中生物素标记的抗Her2单克隆抗体(24D2)、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体(EBA-1)、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体(162-46)的混合比例如下表4所示：
表4:
Figure BDA0001349032190000112
结论：组1、组4、组5肿瘤细胞回收率达70％以上，其中组1效果最佳，组2、组3肿瘤细胞回收率低，不符合要求。
实施例4抗体混合物用量的确定
实验方案如实施例1所述，其中生物素标记的抗Her2单克隆抗体(24D2)、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体(EBA-1)、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体(162-46)混合后的质量百分比分别为35％、20％、45％。上述抗体混合物在细胞液中使用的终浓度如下表5所示
表5抗体混合物用量的确定
Figure BDA0001349032190000121
结论：组2、组3、组4肿瘤细胞回收率达到80％以上，其中组3效果最好，肿瘤细胞回收率达94％，组1、组5、组6肿瘤细胞回收率低不符合要求。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (13)

1.一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法，所述方法包括以下步骤：
1)使用生物素标记抗Her2(人表皮生长因子受体2)单克隆抗体、抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)单克隆抗体和抗Trop2(人滋养层细胞表面抗原2)单克隆抗体，并将其混合；
其中，三种单克隆抗体混合后的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体35％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体20％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体45％；
2)将步骤1)得到的混合物加入到待分选的细胞液中；
其中，所述混合物与细胞液的体积比为1～5:1000；
生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体的混合物在细胞液中使用的终浓度分别为500μg/ml；
3)加入链霉亲和素偶联的磁珠，在4℃孵育20分钟，收集磁珠，即得；
其中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比是1000:10～30；
其中，所述肿瘤选自乳腺癌、非小细胞肺癌和/或结肠癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述混合物与细胞液的体积比为2～3:1000。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比为1000:20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述三种生物素标记的单克隆抗体分别通过包括以下步骤的方法制备：
a.使用超滤柱纯化抗体溶液；
b.加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应0.5～4h；
其中，NHS-PEG4-Biotin与抗体的摩尔浓度比例为10-50:1；
c.分离纯化以去除游离生物素，得到生物素标记的单克隆抗体溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b.中，加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应0.5-3h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b.中，加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应1h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤c.中，所述分离纯化使用葡聚糖凝胶进行。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤a通过包括以下步骤的方法完成：
①制备标记反应溶液；
所述标记反应溶液包括以下组分：
NaCl：10-300mmol/L；KCl：1-5mmol/L；Na2HPO4：5-50mmol/L；KH2PO4：1-5mmol/L；
②于超滤柱中加入标记反应溶液，然后加入单克隆抗体，混匀，然后离心，弃滤液；
其中，所述标记溶液与所述单克隆抗体的体积质量比为1:1-50(μl/μg)；
③混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置后，将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，离心收集滤液，取PBS于超滤柱中混匀，静置；倒置超滤柱，离心收集滤液。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤①中，所述标记反应溶液包括以下组分：
NaCl：137mmol/L；KCl：2.7mmol/L；Na2HPO4：10mmol/L；KH2PO4：2mmol/L。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤②中，重复步骤2～3次。
11.一种用于循环肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒，所述试剂盒包括生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体和生物素标记的抗Trop2单克隆抗体的混合物；
其中，三种单克隆抗体的质量百分比范围为：
生物素标记的抗Her2单克隆抗体35％；
生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体20％；
生物素标记的抗Trop2单克隆抗体45％。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括链霉亲和素标记磁珠。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法或者根据权利要求11或12所述的试剂盒在分选和/或富集循环肿瘤细胞中的用途；
其中，所述肿瘤选自乳腺癌、非小细胞肺癌和/或结肠癌。
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