CN113046280B - 一株抑制病原菌的耐盐耐低温植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抑制病原菌的耐盐耐低温植物乳杆菌及其应用。本发明提供了乳酸菌(Lactobacillus plantarum)QZW5，其保藏号为CCTCC NO：M 2021323，该菌株具有如下功能：1)低温条件下抑制病原菌；2)反复冻融条件下抑制病原菌；3)延长冷冻产品在冷藏、微冻或冷冻条件下的保藏期；4)延长冷冻产品反复冻融条件下的保藏期。本发明寻找出一种乳酸菌，该菌株耐低温且耐高盐，其可以用于抑制多种耐低温或耐高盐的病原菌，且可用于冷藏保藏、微冻保藏或冷冻保藏制品反复冻融下的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株抑制病原菌的耐盐耐低温植物乳杆菌及其应用。
背景技术
低温是保证食品原料、加工和成品质量最重要的手段之一。我国低温预制品、微冻水产品、冷冻食品的生产和销售居世界前列，但这一类食品在生产销售过程中无法避免出现反复冻融状态，由于耐低温微生物在长期进化的过程中形成抗多种胁迫的能力，能够在低温条件下缓慢生长，甚至在冷冻条件下仍以亚致死状态长时间内保持代谢活性，在反复的冻融下甚至能恢复致病能力，而且耐冷的微生物还可能分泌出耐低温的酶类，在低温和冷冻条件下分解食品中的蛋白或脂类，造成食品品质慢慢下降，为冷藏和冷冻食品带来严重安全隐患，因此耐低温病原菌的控制一直是冷藏和冷冻食品原料及成品安全的难题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株乳酸菌。
本发明提供的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)QZW5，其保藏号为CCTCC NO： M2021323。
上述乳酸菌或其菌悬液或其培养液或其培养液的上清液在如下1)-4)中至少一种或具有如下1)-4)中至少一种功能产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)抑制病原菌；
2)低温或反复冻融条件下抑制病原菌；
3)延长冷冻产品在冷藏、微冻或冷冻条件下的保藏期；
4)延长冷冻产品在反复冻融条件下的保藏期。
上述应用中，所述冷冻产品为食品冷冻产品。
上述应用中，所述病原菌为耐低温菌；
或，所述低温为小于等于4℃；
或，所述反复冻融条件为-7℃和7℃条件下反复冻融；
或，所述冷藏条件为-4℃至0℃；
或，所述微冻条件为-2℃至-4℃；
或，所述冷冻条件为低于-4℃。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其包括上述乳酸菌或其菌悬液或其培养液或其培养液的上清液。
上述产品中，所述乳酸菌培养液的上清液按照如下方法制备：培养上述的乳酸菌，得到培养液，收集所述培养液的上清液。
上述产品具有如下1)-4)中至少一种功能：
1)抑制病原菌；
2)低温或反复冻融条件下抑制病原菌；
3)延长冷冻产品在冷藏、微冻或冷冻条件下的保藏期；
4)延长冷冻产品在反复冻融条件下的保藏期。
本发明还有一个目的是提供如下方法：
本发明提供一种延长冷冻产品保藏期的方法，包括如下步骤：先将冷冻产品在上述的乳酸菌的培养液的上清液中浸泡，再进行冷藏或冷冻，实现延长冷冻产品保藏期。
或，本发明提供了一种延长冷冻产品反复冻融条件下保藏期的方法，包括如下步骤：先将冷冻产品在上述乳酸菌的培养液的上清液中浸泡，再进行反复冻融，实现延长冷冻产品反复冻融条件下的保藏期。
上述方法中，所述冷藏条件为-4℃至0℃；
或，所述冷冻条件为低于-4℃；
或，所述反复冻融条件为-7℃和7℃条件下反复冻融。
本发明寻找出一种乳酸菌，该菌株耐低温且耐高盐，其可以用于抑制多种耐低温或耐高盐的病原菌，且可用于冷冻制品的冷藏保藏、微冻保藏或反复冻融保藏。
保藏说明
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：QZW5
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国武汉的 武汉大学
保藏日期：2021年4月2日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2021323
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的病原菌指示菌株如下：
藤黄微球菌(Micrococcus luteus)28001(购自河南省生物研究所)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)12600(购自河南省生物研究所)、金黄色葡萄球菌 26003(购自河南省生物研究所)，金黄色葡萄球菌29213(购自河南省生物研究所)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)63501(购自河南省生物研究所)和李斯特氏菌 BAA(购自河南省生物研究所)，大肠杆菌(Escherichia coli)30105(购自河南省生物研究所)和沙门氏菌(Salmonella enterica)ATCC14028，沙门氏菌ATTC13076，铜绿假单胞杆菌10104(购自河南省生物研究所)，沙门氏菌50094(购自河南省生物研究所)。
下述实施例中的培养基为如下：
用于乳酸菌菌株培养的培养基(MRS固体培养基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80lmL，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH值为6.5。
MRS液体培养基与上述MRS固体培养基的区别在于不加入琼脂。
NA培养基(用于藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢杆菌、沙门氏菌的培养)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1.0L， pH7.0-7.2。
LB培养基(用于大肠杆菌的培养)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水l.0L，pH7.0。
实施例1、乳酸菌菌株Lactobacillus plantarum QZW5的分离鉴定
一、分离纯化
来自青海新鲜小麦材料，分离得到菌株QZW5，具体方法如下：
称取新鲜样品5g加入灭菌的45ml蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，按10倍梯度依次稀释5次，然后分别取10、1000和100000倍稀释样品液各20μl涂布于MRS 培养基上放置于厌氧培养箱培养24小时分离并进一步纯化得到QZW5，该菌为革兰氏阳性杆菌、接触酶阴性、不产芽孢。
二、生理生化和分子鉴定
1、生理生化鉴定
将上述菌株QZW5采用不同条件下生长以及API50检测不同碳源下生长特性，结果如表1所示。
表1为QZW5的生理生化特性
上表中，+生长，w弱生长，-不生长。
3、分子鉴定
提取菌株QZW5的单菌落进行菌落PCR，引物选用的是细菌的16S rRNA基因扩增的通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)引物进行扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物送去测序，得到16S rRNA基因序列，核苷酸序列为序列1。
将测序结果进行BLAST比对，结合形态学分析比对，可以确定所分离的菌株为Lactobacillus plantarum。
菌株QZW5于于2021年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉的 武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021323，分类命名为 Lactobacillusplantarum。
4、Lactobacillus plantarum QZW5的抑菌实验
牛津杯双层平板法：含1.5％琼脂的指示菌培养基冷却至50℃左右，按每平皿15mL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却；制备含0.8％琼脂的指示菌培养基，冷却至 50℃左右，按1％的接种量加入指示菌菌悬液作为上层培养基，倾倒5mL上层培养基于含1.5％琼脂培养基的平板中冷却，然后用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上，将无细胞发酵上清液加入牛津杯中于超净工作台上扩散5h，置于适宜的培养条件下培养 24h后观察抑菌圈的出现。
上述指示菌为表2中第1列和第3列的菌株，指示菌培养基为菌株对应培养基，指示菌菌悬液为指示菌在其对应的培养基培养得到的培养液。
结果如表2所示。
表2为抑菌实验结果(抑菌圈单位为mm)
从上述可以看出，QZW5可以抑制表2所示指示菌的生长，大于7.8mm均为抑菌。
实施例2、Lactobacillus plantarum QZW5在食品冷链反复冻融保藏中的应用
一、Lactobacillus plantarum QZW5的耐高盐实验
将实施例1中的QZW5在30℃条件下MRS液体培养基培养至活菌数为108CFU/mL 以上离心，去除上清液，加入1mL表3所示浓度的无菌NaCl溶液(溶剂为水)3小时，然后在MRS固体平板28℃厌氧培养24小时。
结果如表3所示，Lactobacillus plantarum QZW5在10％到20％的NaCl溶液3小时处理后存活率达到90％以上，表明其耐高盐。
表3为不同盐浓度下菌株的活性
二、Lactobacillus plantarum QZW5的药敏性实验
将实施例1中的QZW5在30℃条件下在MRS液体培养基(不含有琼脂)中培养24h 备用，得到QZW5活化菌液。
在9cm培养皿中倒入15mL含1.0％琼脂MRS为底层培养基，取200μL上述QZW5活化菌液加入到5mL 50℃含0.8％琼脂的MRS培养基中混匀，QZW5活细胞浓度控制在1.5 ×107CFU/mL，将含QZW5的培养基均匀地铺在底层培养基上，于室温下放置大约15min，待上层琼脂冷却凝固并适当干燥，然后将抗生素药敏试纸条(购自OXOID)用无菌操作贴放在琼脂表面，于37℃培养24h，用游标卡尺测抑菌圈直径，读数至毫米，取 3次测量的平均值作为结果。
结果如表4所示，可以看出，Lactobacillus plantarum QZW5对大多数抗生素敏感，适用于食品安全保鲜，这是由于抗生素敏感的菌株不容易将抗性基因转移给病原微生物。
表4为Lactobacillus plantarum QZW5的药敏性实验结果
上表中，-表示不敏感。
三、Lactobacillus plantarum QZW5在低温条件下抑菌检测
1、4℃冷藏下抑菌检测
Lactobacillus plantarum QZW5在MRS液体培养基28℃培养24小时，5000转离心，取上清液，在每毫升上清液中加入106CFU下表5中的病原菌，4℃下抑菌培养，得到培养液，分别在如下表5中不同抑菌培养时间：4，8，12，24，72小时下检测培养液中病原菌数量。以来源相同的分离的菌株QZ50为对照。
将上述不同抑菌培养时间得到的培养液在NA固体平板28℃培养24小时，计数检测病原菌数量，104CFU/mL以上为++，102-104CFU/mL之间+，0-102CFU/mL为±，不生长为-。
QZW5在4℃冷藏下不同时间对病原菌的抑制结果如表5所示，可以看出，QZW5在 4℃条件下可以抑制多种病原菌。
表5为4℃冷藏下QZW5对不同病原菌的抑菌时间
2、Lactobacillus plantarum QZW5在-2℃到-4℃微冻条件下对病原菌的抑制
Lactobacillus plantarum QZW5在MRS液体培养基28℃培养24小时，5000转离心，取上清液，在上清液中加入106CFU/mL的下表6中病原菌，-4℃下抑菌培养，得到培养液，分别在如下不同抑菌培养时间(加入病原菌后的培养时间)：4，8，12，24，72小时下检测混合菌液中病原菌数量。以来源相同的分离的菌株QZ50为对照。
将上述不同培养液在NA固体平板28℃培养24小时，检测病原菌数量，104CFU/mL以上为++，102-104CFU/mL之间+，0-102CFU/mL为±，不生长为-。
QZW5在-4℃微冻下不同时间对病原菌的抑制结果如表6所示，可以看出，QZW5 在-4℃微冻条件下可以抑制多种病原菌。
表6为-4℃冷藏下QZW5对不同病原菌的抑菌时间
上表中，+生长，-不生长。
3、Lactobacillus plantarum QZW5在-7℃到7℃反复冻融条件下72小时对病原菌的抑制结果
Lactobacillus plantarum QZW5在MRS液体培养基28℃培养24小时，5000转离心，取上清液，在上清液中加入106CFU/mL的下表7中病原菌，-7℃放置12小时，再 7℃放置12小时，反复5个轮次(-7℃/7℃)。以来源相同的分离菌株QZ50为对照。
将上述冻融次数的混合菌液在NA固体平板28℃培养，计数，检测不同培养时间下病原菌数量，104CFU/mL以上为++，102-104CFU/mL之间+，0-102CFU/mL为±，不生长为-。
QZW5在-7℃/7℃反复冻融不同次数对病原菌的抑制结果如表7所示，可以看出，QZW5在-7℃/7℃反复冻融条件下可以抑制多种病原菌。
表7为QZW5在-7℃/7℃反复冻融对病原菌的抑制结果果
从上述可以看出，Lactobacillus plantarum QZW5在低温和反复冻融状态均可以抑制多种病原菌，因此，可以将其应用到冷冻食品保鲜上。
实施例3、Lactobacillus plantarum QZW5在反复冻融下对冷冻食品制品的保鲜
Lactobacillus plantarum QZW5在MRS液体培养基28℃培养24小时，5000转离心，取上清液。
将表8所示的各种冷冻食品制品用上述上清液浸泡10分钟后拿出，分别在如下条件下保藏15天：25℃，4℃,-4℃，-7℃和7℃反复冻融5个轮次，以不进行浸泡处理为对照。
观察冷冻食品状态，称取5g加入灭菌的45ml蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，按10倍梯度依次稀释5次，然后分别取10、1000和100000倍稀释样品液各20μl，伊红美蓝固体培养基28℃，培养24小时检测大肠杆菌；在NA固体平板28℃，好氧培养24小时检测好氧菌，厌氧培养24小时检测厌氧菌的含量(上述微生物检测参考文献：Pang H,Tan Z,Qin G,Wang Y,Li Z,Jin Q,Cai Y(2012)Phenotypic and phylogenetic analysis of lacticacid bacteria isolated from forage crops and grasses in the Tibetan Plateau.JMicrobiol 50(1):63–71)，结果如表8所示：
表8为冷冻食品状态
上述结果表明，Lactobacillus plantarum QZW5可在反复冻融条件下延长冷冻食品制品的保藏期。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> 一株抑制病原菌的耐盐耐低温植物乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1531
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
cagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa 60
cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag tggcgaactg 120
gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa acagatgcta 180
ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa agatggcttc ggctatcact 240
tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtgaggta acggctcacc atggcaatga 300
tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg gcccaaactc 360
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc 420
gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga 480
gagtaactgt tcaggtatta gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 540
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 600
gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa gtgcatcgga 660
aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtaaggctcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 720
tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag 780
gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac cgtaaacgat 840
gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcattc 900
cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 960
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatac 1020
tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt ggtgcatggt 1080
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt 1140
atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa accggaggaa 1200
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1260
ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccattctcag 1320
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1380
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt 1440
ttgtaacacc caaagtcggt ggggtaacct tttaggaacc agccgcctaa ggtgggacag 1500
atgattaggg tgaagtcgta acaaggtaac c 1531
Claims (8)
1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）QZW5，其保藏号为CCTCC NO：M 2021323。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌或其菌悬液或其培养液或其培养液的上清液在如下1）-2）中至少一种或制备具有如下1）-2）中至少一种功能产品中的应用：
1）抑制病原菌；所述应用为非疾病诊断治疗目的；
2）延长冷冻产品在冷藏、微冻或冷冻条件下的保藏期；
所述病原菌为藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、沙门氏菌、李斯特氏菌或大肠杆菌；
所述冷藏条件为-4℃至0℃；
或，所述微冻条件为-2℃至-4℃；
或，所述冷冻条件为低于-4℃。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌或其菌悬液或其培养液或其培养液的上清液在如下1）-2）中至少一种或制备具有如下1）-2）中至少一种功能产品中的应用：
1）低温或反复冻融条件下抑制病原菌；所述应用为非疾病诊断治疗目的；
2）延长冷冻产品在反复冻融条件下的保藏期；
所述病原菌为藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、沙门氏菌、李斯特氏菌或大肠杆菌；
所述低温为小于等于4℃；
或，所述反复冻融条件为-7℃和7℃条件下反复冻融。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述冷冻产品为食品冷冻产品。
5.一种产品，其包括权利要求1所述的植物乳杆菌或其菌悬液或其培养液或其培养液的上清液。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述植物乳杆菌培养液的上清液按照如下方法制备：培养权利要求1所述的植物乳杆菌，得到培养液，收集所述培养液的上清液。
7.一种延长冷冻产品保藏期的方法，包括如下步骤：先将冷冻产品在权利要求1所述的植物乳杆菌的培养液的上清液中浸泡，再进行冷藏或冷冻，实现延长冷冻产品保藏期；
所述冷藏条件为-4℃至0℃；
或，所述冷冻条件为低于-4℃。
8.一种延长冷冻产品反复冻融条件下保藏期的方法，包括如下步骤：先将冷冻产品在权利要求1所述的植物乳杆菌的培养液的上清液中浸泡，再进行反复冻融，实现延长冷冻产品反复冻融条件下的保藏期； 所述反复冻融条件为-7℃和7℃条件下反复冻融。
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