CN113045638B

CN113045638B - 一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113045638B
Application number: CN202110357115.6A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 刘洁; 刘家炉; 凡玉芳; 孔国庆; 周炜; 何志远
Original assignee: Anhui Prouting Biotechnology Co ltd; Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Current assignee: Anhui Prouting Biotechnology Co ltd; Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-04-01
Also published as: CN113045638A

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白及其应用，该长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，该长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。长效重组人丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列，丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白核苷酸序列重复单元C端的一个单体结构所对应的氨基酸序列。本发明提供的长效重组人丝聚蛋白能够促进角蛋白中间丝聚集并促进中间丝之间的二硫键形成、防止表皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵以及降低紫外线诱导的表皮细胞凋亡的敏感性。融合HAS有效的提高了重组蛋白的稳定性。

Description

一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及新兴生物医学领域，尤其涉及一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白，一种酿酒酵母信号肽重组质粒，一种酿酒酵母分泌表达载体，一种酿酒酵母营养缺陷型菌株，以及一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白在保湿化妆品中的应用。

背景技术

丝聚蛋白(filaggrin，FLG)又称中间丝聚合蛋白，相对分子质量约35000，主要存在于表皮颗粒层和透明层。它的前体丝聚蛋白原是一个高度磷酸化、富含组氨酸、不溶于水且无活性的多肽，相对分子质量约435000。丝聚蛋白原的编码基因FLG位于表皮分化复合体内，分子起始端是一个N端区域，该区域有一个钙结合结构和核定位元件，N端区域之后是10～12个几乎相同的FLG单体结构，此重复结构具有角蛋白绑定属性，其末端是C端(结合图2所示)。丝聚蛋白及其降解产物和衍生物是皮肤的天然保湿因子，对维持皮肤正常pH值、调节蛋白酶活性、表皮屏障的通透性及皮肤对微生物的防御功能起关键作用，对维持角质层水合作用非常重要。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HAS)是人体血液中的主要蛋白，由585个氨基酸构成，是人体循环***内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/L。HSA由肝脏合成，血清半衰期长，可达19天。HSA在调节血液渗透压、营养和促进伤口愈合等方面发挥重要作用，广泛用于肝硬化腹水、烧伤、休克等临床治疗。此外，HSA具有无免疫原性、人体相容性好、组织分布广和无酶活等特性，使其成为非常理想的重组蛋白融合载体。通过构建融合蛋白技术能够增加重组蛋白的分子量从而延长半衰期，有效的提高重组蛋白的稳定性。

目前FLG的基因工程的表达主要是选取FLG单体结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组FLG。根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达。原核表达***虽成本低廉，但该***存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷，而利用真核表达***进行外源表达能够获得较高活性的目的蛋白。

而现有技术中经大肠杆菌表达的人丝聚蛋白，表达产物需要经纯化才能利用，生产成本较高，且原核表达***存在容易形成包涵体、获得的重组人丝聚蛋白生物学活性较低等缺陷。经毕赤酵母表达的人丝聚蛋白，因表达的上清液中含有有害甲醇成分，并且去除甲醇成本较高，推广使用较难。

发明内容

为了克服天然提纯人丝聚蛋白工艺复杂、成本高、推广应用受到限制的缺点；现有技术中现有原核表达***存在容易形成包涵体、获得的人丝聚蛋白生物学活性较低等缺陷的技术问题，本发明提供了一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白，一种酿酒酵母信号肽重组质粒，一种酿酒酵母分泌表达载体，一种酿酒酵母营养缺陷型菌株，以及一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白在保湿化妆品中的应用。

本发明采用以下技术方案实现：一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白，该长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

作为上一步技术方案的改进，长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

进一步地，长效重组人丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列；丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白核苷酸序列重复单元C端的一个单体结构所对应的氨基酸序列。

本发明还提供一种酿酒酵母信号肽重组质粒，该酿酒酵母信号肽重组质粒采用如上任意一项所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。

作为上一步技术方案的改进，酿酒酵母信号肽重组质粒的构建包括以下操作步骤：

首先，根据酿酒酵母Mfα基因的序列设计合成引物，合成引物包括正向引物Mfα-F及反向引物Mfα-R；

其次，通过RT-PCR扩增酵母中信号肽Mfα基因，获得RT-PCR扩增产物后，胶回收RT-PCR扩增产物，获得胶回收产物；

然后，对胶回收产物及空质粒pYES2/CT进行双酶切，再进行胶回收，获得分泌信号肽片段Mfα及载体片段pYES2/CT；

之后，连接分泌信号肽片段Mfα及载体片段pYES2/CT。

进一步地，正向引物Mfα-F如Seq ID NO.3所示，反向引物Mfα-R如Seq ID NO.4所示。

本发明还提供了一种酿酒酵母分泌表达载体，该酿酒酵母分泌表达载体含有如上任意一项所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。

本发明还提供了一种酿酒酵母营养缺陷型菌株，该酿酒酵母营养缺陷型菌株含有如上任意一项所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。

作为上一步技术方案的改进，酿酒酵母营养缺陷型菌株的制备及转化包括以下步骤：

步骤一：酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

步骤二：含酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白基因的重组质粒转化酿酒酵母。

本发明还提供了一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白在保湿化妆品中的应用，其采用如上任意一项所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白。

本发明的有益效果：

1、本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白(即hFLG-HSA蛋白)为天然人FLG重复单元C端的一个单体结构与HSA融合而成的重组蛋白，该重组人丝聚蛋白能够促进角蛋白中间丝聚集并促进中间丝之间的二硫键形成、防止表皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵以及降低紫外线诱导的表皮细胞凋亡的敏感性。融合HAS有效的提高了重组蛋白的稳定性。

2、本发明制备的长效重组蛋白将人丝聚蛋白与人血清白蛋白进行融合表达，具有更好的均一性、稳定性和更好的回收率，可显著降低生产成本。且利用酿酒酵母分泌表达***对人丝聚蛋白进行外源表达，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

附图说明

图1为长效重组人丝聚蛋白的获得方法的流程图。

图2为丝聚蛋白结构域的示意图。

图3为使用长效重组人丝聚蛋白后表皮水分含量测定的结果示意图。

图4为SDS-PAGE鉴定纯化后长效重组人丝聚蛋白的结果示意图，图中分为三组，分别为组M、组1及组2。其中，组M为Markers的SDS-PAGE鉴定结果，组1为酿酒酵母信号肽重组质粒(pYES2/CT-MFα载体)作为对照的SDS-PAGE鉴定结果，组2为纯化后hFLG-HSA蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。

图5为Westernblot鉴定纯化后重组hFLG-HSA蛋白的结果示意图，图中分为两组，分别为组M及组1。组M为Markers的Westernblot鉴定结果，组1为纯化后hFLG-HSA蛋白的Westernblot鉴定结果。

序列表说明(序列表内容单独提供)

Seq ID NO.1所示为本发明实施例中酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列。

Seq ID NO.2所示为本发明实施例中酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的氨基酸序列。

Seq ID NO.3所示为本发明实施例中正向引物Mfα-F的核苷酸序列。

Seq ID NO.4所示为本发明实施例中反向引物Mfα-R的核苷酸序列。

Seq ID NO.5所示为本发明实施例中反向引物hFLG-HSA-R的核苷酸序列。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例公开一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白。该长效重组人丝聚蛋白为天然人FLG重复单元C端的一个单体结构与HSA融合而成的重组蛋白，该重组蛋白能够防止表皮水分的丢失。且重组蛋白该将hFLG截短蛋白融合HSA蛋白，有效的提高了重组蛋白的稳定性，生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

该长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，该长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

长效重组人丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列；丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白核苷酸序列重复单元C端的一个单体结构所对应的氨基酸序列。

在本实施例中，长效重组人丝聚蛋白是通过人丝聚蛋白和人血清白蛋白进行人工优化获得的。根据丝聚蛋白和人血清白蛋白的氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型hFLG-HSA基因(即长效重组人丝聚蛋白的基因)，其核苷酸序列如下：

注：GGATCC为BamHI酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点；ATG为起始密码子，

为终止密码子；GCAGAGGCGGCGGCTAAGGAAGCTGCAGCCAAAGCC为连接FLG和HSA序列的Linker所对应的碱基序列；CATCACCATCACCATCAC为6×His标签序列。

酿酒酵母偏爱型hFLG-HSA基因的核苷酸序列所对应的氨基酸序列为：

MDSSRHSQSGQGESAGSRRSRRQGSSVSQDSDSEAYPEDSERRSESASRNHHGSSREQSRDGSRHPGSAEAAAKEAAAKAMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH。

将以上两段序列以hFLG-HSA顺序***pMD19-T Simple Vector的BamHⅠ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端接BamHⅠ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-hFLG-HSA，pMD19-T-hFLG-HSA的合成由通用生物***(安徽)有限公司负责合成。

该重组人丝聚蛋白能够促进角蛋白中间丝聚集并促进中间丝之间的二硫键形成、防止表皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵、降低紫外线诱导的表皮细胞凋亡的敏感性。融合HAS有效的提高了重组蛋白的稳定性。

实施例2

本实施例公开一种酿酒酵母信号肽重组质粒。该酿酒酵母信号肽重组质粒采用如实施例1所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。

酿酒酵母信号肽重组质粒的构建包括以下操作步骤：

首先根据酿酒酵母Mfα基因的序列设计合成引物，合成引物包括正向引物Mfα-F及反向引物Mfα-R。本实施例中，正向引物Mfα-F如Seq ID NO.3所示，反向引物Mfα-R如Seq IDNO.4所示。

其次通过RT-PCR扩增酵母中信号肽Mfα基因，获得RT-PCR扩增产物后，胶回收RT-PCR扩增产物，获得胶回收产物。

然后对胶回收产物及空质粒pYES2/CT进行双酶切，再进行胶回收，获得分泌信号肽片段Mfα及载体片段pYES2/CT。之后连接分泌信号肽片段Mfα及载体片段pYES2/CT。

在本实施例中酿酒酵母信号肽重组质粒pYES2/CT-Mfα的构建具体包括以下操作步骤：

根据酿酒酵母Mfα基因的序列(Z73543)设计合成正向引物Mfα-F及反向引物Mfα-R。

正向引物Mfα-F：GGGGTACCAAAAAAATGAGATTTCCTTCT(其中GGTACC为酶切位点KpnⅠ)，

反向引物Mfα-R：CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT(其中GGATCC为酶切位点BamHⅠ)，引物由通用生物***(安徽)有限公司合成。通过RT-PCR扩增INVSc1酵母中信号肽Mfα基因，其中RT-PCR扩增反应的反应体系以2×PCR Master Mix:Mfα-F:Mfα-R:酿酒酵母模板:ddH₂O:Total Volume按照以下比例混合：12.5μl:1μl:1μl:2μl:8.5μl:25μl。反应体系具体为为：

RT-PCR反应程序：94℃预变性5rain；94℃50s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。RT-PCR扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

取以上胶回收产物与空质粒pYES2/CT分别用QuickCut Kpn I和QuickCut BamH I进行双酶切，其中，酶切反应体系以QuickCut Kpn I:QuickCut BamH I:10×QuickCutGreen Buffer:pYES2/CT(或PCR产物):ddH₂O:Total Volume按照以下比例混合：2.0μl:2.0μl:5μl:15μl:26μl:50μl。在本实施例中，酶切反应体系具体为：

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物分别经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收255bp的分泌信号肽片段Mfα和5.8Kb的载体片段pYES2/CT，然后用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系为：

反应条件为16℃、14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5α)，在含卡那霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切(QuickCut Kpn I和QuickCut BamH I)鉴定，得到阳性克隆pYES2/CT-Mfα，该阳性克隆将分泌信号肽片段***了质粒pYES2/CT的Kpn I酶切位点和BamH I酶切位点之间。

实施例3

本实施例提供了一种酿酒酵母分泌表达载体，该酿酒酵母分泌表达载体含有如实施例1所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。该酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA的构建具体包括以下步骤：

用内切酶BamH I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-Mfα及质粒pMD19-T-hFLG-HSA进行双酶切，酶切反应体系为：

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收hFLG-HSA基因片段和pYES2/CT-Mfα载体，然后用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系为：

反应条件为16℃下反应14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5α)，在含卡那霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：Mfα-F；反向引物：hFLG-HSA-R：GCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTAACCCTAA)及双酶切(BamHⅠ和XbaⅠ)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA送至通用生物***(安徽)有限公司进行测序。

本实施例利用酿酒酵母分泌表达***对人丝聚蛋白进行外源表达，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

实施例4

本实施例提供了一种酿酒酵母营养缺陷型菌株，该酿酒酵母营养缺陷型菌株含有如实施例1所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白的基因。本实施例利用酿酒酵母营养缺陷型菌株对人丝聚蛋白进行外源表达，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

本实施例中的酿酒酵母营养缺陷型菌株即为人工hFLG-HSA融合蛋白的工程菌，其制备及转化包括以下步骤：

步骤一：酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，其具体包括YPD培养基、SC-U培养基及SC-U诱导培养基的配制。其中，YPD培养基、SC-U培养基及SC-U诱导培养基的配制分别包括以下操作：

YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，高压灭菌20min。

SC-U培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，(若制SC-U选择性平板培养基，另加20g琼脂粉)加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用。

SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％棉籽糖溶液，混匀，4℃保存备用。

步骤二：含酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白基因的重组质粒(pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA)转化酿酒酵母，该步骤具体包括以下操作：

第一步：采用电转化法将pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA以及pYES2/CT-Mfα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞。将10μlpYES2/CT-MFα-hFLG-HSA质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。

第二步：将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。

第三步：在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA及pYES2/CT-Mfα质粒的酿酒酵母转化子，菌液PCR(正向引物：Mfα-F如Seq ID NO.3所示；反向引物：hFLG-HSA-R如Seq ID NO.5所示)筛选INVSc1/pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA阳性克隆子。

本发明制备工程菌中rhFLG-HSA基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使rhFLG-HSA分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达***和其他有益菌分泌表达***而言，获取工艺简单，成本更低。

实施例5

为了验证实施例4中提供INVSc1/pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA阳性克隆子能够诱导产生长效重组人丝聚蛋白，本实施例提供了一种酿酒酵母营养缺陷型菌株的摇瓶培养、诱导表达及检定，即含有人工hFLG-HSA真核表达载体pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达及检定，其具体包括以下操作步骤：

分别挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA)以及INVSc1(pYES2/CT)于30ml液体SC-U选择培养基(含2％棉籽糖和氨苄)，30℃正道培养过夜，测定OD₆₀₀ _nm吸光值，取适量的培养液接种于100ml的SC-U诱导培养基中(含2％棉籽糖和氨苄)，培养过夜，使其OD₆₀₀ _nm为0.4，4℃1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基(含2％棉籽糖和氨苄)悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中(含2％棉籽糖和氨苄)，置于30℃震荡培养96h，4℃1500g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤。

使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用Binding Buffer(pH8.0PBS)平衡2～3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5～6ml/min，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD₂₈₀ _nm稳定。设置梯度咪唑浓度的洗脱液(pH8.0PBS含有100～300mM咪唑)洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，取纯化过程蛋白样做SDS-PAGE电泳，以便分析纯化效果。

诱导表达纯化得到的上清蛋白液经SDS-PAGE电泳可观察到76.6kDa左右有明显的特异性条带出现，而同样经诱导的含有pYES2/CT质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则没有该条带(见图4)，使用兔抗FLG单克隆抗体经Westernblot鉴定含有pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液均可观察到76.6kDa左右特异性条带(见图5)，此可见本发明制备的含人丝聚蛋白的真核表达载pYES2/CT-Mfα-hFLG-HSA的酿酒酵母工程菌经棉籽糖诱导能产生76.6KD左右的重组人丝聚蛋白和血清白蛋白的融合蛋白。

实施例6

本实施例提供了一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白在保湿化妆品中的应用，其含有如实施例1所述的酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白。为了验证实施例1提供的长效重组人丝聚蛋白对皮肤的保湿作用，即人工hFLG-HSA融合蛋白对皮肤的保湿作用，本实施例通过以下试验进行验证：

1、试验分组

选取受试人数共30人，年龄20～40岁，随机分为3组(每组男女各5人)，低剂量组(0.1mg/ml融合蛋白上清液)、高剂量组(0.5mg/ml融合蛋白上清液)和对照组(PBS pH7.4)；受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史。

2、试验处理

测试环境温度为25℃，相对湿度(RH)为61％，测定前10min将被检部位露出，同时让被检者在此环境中安静下来。在左右前臂上各划出3.5cm×3.5cm的正方形实验区域，并将实验区域编号，左臂作为涂抹融合蛋白上清液的测试区域，右臂的对称区域为使用空白对照产品的测试区域。首先使用碱性香皂清洗受试部位，冲洗干净后晾干。融合蛋白涂敷前，使用Comeometer CM 825测试仪测定被测部位的角质层水分含量。取0.2ml以上各组融合蛋白以及PBS溶液涂于受试部位，在皮肤上均匀涂抹2min。在10min、40min、60min、120min和180min时使用Comeometer CM 825测试仪测试出皮肤角质层水分含量值(其度量单位以a.u.来表示)，即在受试区内选取10个点进行测量，并记录平均值作为各个时间点的测量结果。

3、试验结果

如图2所示，使用低剂量融合蛋白和高剂量融合蛋白后，皮肤表皮水分含量的值都有不同程度的提高，特别是含0.5mg/ml融合蛋白的试验组，在40min时表皮含水量的值达到最高，约为对照组表皮含水量的1.6倍，说明hFLG-HSA融合蛋白使用后能够显著提高皮肤的含水量，对皮肤具有一定的保湿作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

安徽普若汀生物科技有限公司

<120>一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白及其应用

<141> 2021-04-01

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atggattctt cccgtcatag ccaatctggt caaggtgaat ccgccggttc tcgtagatcc 60

agaagacaag gttcttcagt ttctcaagac tctgactctg aagcttaccc agaagattca 120

gaaagaagat ctgaatccgc cagtagaaac caccacggtt cctccagaga acaatccaga 180

gatggttcca gacacccagg tagcgcagag gcggcggcta aggaagctgc agccaaagcc 240

atgaagtggg ttacgtttat ctccctatta tttctgttct catccgccta ctccagaggt 300

gttttcagga gagatgctca caaatctgag gttgctcata gattcaagga tttgggtgaa 360

gaaaacttta aggccttagt gttaatagct ttcgcacaat acctgcaaca gtgtcctttt 420

gaagaccatg tcaaattagt taatgaagtc accgaatttg ctaagacgtg cgttgctgat 480

gagtctgccg aaaattgtga caaatcactg catacattgt tcggtgataa gctatgtacc 540

gttgcaactc ttagagaaac gtacggagag atggcggact gttgtgctaa acaagaacct 600

gaaagaaatg aatgtttttt gcaacacaaa gatgataatc caaacttgcc aagattggta 660

agaccagaag ttgacgttat gtgtaccgct tttcatgata atgaagaaac atttttgaaa 720

aagtatcttt atgaaatagc aaggaggcat ccttacttct acgctccaga gttattattt 780

tttgcaaaaa gatataaggc agcttttact gaatgttgtc aggctgcgga taaagccgca 840

tgtctgttac ccaaattgga tgaattgaga gacgagggca aagctagtag tgccaaacaa 900

agattaaaat gcgcttcatt acaaaaattt ggagaaagag cgtttaaggc ttgggccgta 960

gcaagattgt ctcagagatt cccgaaagcc gaatttgcag aagtgagtaa actggtcaca 1020

gatttgacga aagttcacac agaatgttgt cacggagatt tattggaatg cgctgacgat 1080

agggctgact tagctaaata catatgcgag aatcaagatt ccatatcatc aaaattgaaa 1140

gaatgttgtg agaaaccatt attagaaaaa tcccactgta tagctgaagt tgagaacgat 1200

gaaatgcccg cggatttacc ctcccttgcg gctgacttcg ttgagtcaaa ggatgtttgc 1260

aagaattacg cggaggccaa ggatgttttt cttggcatgt ttttatatga gtatgccaga 1320

cgtcatccgg attattctgt agttctactg ttaaggcttg ccaagacata cgaaactacc 1380

ttagaaaaat gttgtgcggc tgccgatcca catgaatgtt acgcaaaagt ttttgatgaa 1440

ttcaagccgc ttgtcgagga gccacaaaat ttaattaaac aaaactgtga attatttgaa 1500

caattaggtg aatataaatt ccaaaacgca ttattggtca gatatacaaa aaaagtacct 1560

caggtttcca caccaacttt agtggaagtg tcacgtaacc taggcaaggt tggtagtaag 1620

tgctgtaaac acccagaagc taagagaatg ccatgcgctg aagattatct atcagtcgta 1680

cttaatcaac tgtgtgtcct acacgagaag actcctgtca gtgacagagt gacaaaatgt 1740

tgcaccgaga gcttagttaa tagaagaccg tgtttttcag cgctggaagt tgatgaaacc 1800

tatgttccaa aggagttcaa tgcagaaaca ttcaccttcc atgctgatat atgtactctt 1860

agtgaaaaag aaaggcagat caaaaaacaa actgccctgg tcgaattagt caaacataaa 1920

cctaaagcaa cgaaggaaca gttgaaggcc gtaatggatg atttcgcagc tttcgttgaa 1980

aaatgttgca aggctgatga caaagagaca tgttttgctg aagagggaaa aaaattggtg 2040

gcagcttctc aagccgcttt agggttacat caccatcacc atcactaa 2088

<210> 2

<211> 695

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Asp Ser Ser Arg His Ser Gln Ser Gly Gln Gly Glu Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ser Arg Arg Ser Arg Arg Gln Gly Ser Ser Val Ser Gln Asp Ser Asp

20 25 30

Ser Glu Ala Tyr Pro Glu Asp Ser Glu Arg Arg Ser Glu Ser Ala Ser

35 40 45

Arg Asn His His Gly Ser Ser Arg Glu Gln Ser Arg Asp Gly Ser Arg

50 55 60

His Pro Gly Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

65 70 75 80

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

85 90 95

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

100 105 110

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

115 120 125

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

130 135 140

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

145 150 155 160

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

165 170 175

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

180 185 190

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

195 200 205

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

210 215 220

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

225 230 235 240

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

260 265 270

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

275 280 285

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

290 295 300

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

305 310 315 320

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

325 330 335

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

340 345 350

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

355 360 365

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

370 375 380

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

385 390 395 400

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

405 410 415

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

420 425 430

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

435 440 445

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

450 455 460

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

465 470 475 480

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

485 490 495

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

500 505 510

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

515 520 525

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

530 535 540

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

545 550 555 560

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

565 570 575

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

580 585 590

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

595 600 605

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

610 615 620

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

625 630 635 640

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

645 650 655

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

660 665 670

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

675 680 685

Leu His His His His His His

690 695

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

ggggtaccaa aaaaatgaga tttccttct 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

cgggatcctc ttttatccaa agaaacacct 30

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 5

gctctagatt agtgatggtg atggtgatgt aaccctaa 38

Claims

1.一种酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白，其特征在于：所述长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白，其特征在于，所述长效重组人丝聚蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白，其特征在于，所述长效重组人丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列；所述丝聚蛋白的氨基酸序列包括丝聚蛋白核苷酸序列重复单元C端的一个单体结构所对应的氨基酸序列。

4.一种酿酒酵母信号肽重组质粒，其特征在于，其采用如权利要求1-2中任意一项所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白的基因。

5.如权利要求4所述的酿酒酵母信号肽重组质粒，其特征在于，所述酿酒酵母信号肽重组质粒的构建包括以下操作步骤：

根据酿酒酵母Mfα基因的序列设计合成引物，所述合成引物包括正向引物Mfα-F及反向引物Mfα-R；

通过RT-PCR扩增酵母中信号肽Mfɑ基因，获得RT-PCR扩增产物后，胶回收所述RT-PCR扩增产物，获得胶回收产物；

对所述胶回收产物及空质粒pYES2/CT进行双酶切，再进行胶回收，获得分泌信号肽片段Mfα及载体片段pYES2/CT；

连接所述分泌信号肽片段Mfα及所述载体片段pYES2/CT。

6.如权利要求4所述的酿酒酵母信号肽重组质粒，其特征在于，所述正向引物Mfα-F如Seq ID NO.3所示，所述反向引物Mfα-R如Seq ID NO.4所示。

7.一种酿酒酵母分泌表达载体，其特征在于，其含有如权利要求1-2中任意一项所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白的基因。

8.一种酿酒酵母营养缺陷型菌株，其特征在于，所述酿酒酵母营养缺陷型菌株含有如权利要求1-2中任意一项所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白的基因。

9.如权利要求8所述的酿酒酵母营养缺陷型菌株，其特征在于，所述酿酒酵母营养缺陷型菌株的制备及转化包括以下步骤：

步骤一：酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

步骤二：含所述酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白基因的重组质粒转化酿酒酵母。

10.一种酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白在保湿化妆品中的应用，其特征在于，其采用如权利要求1-2中任意一项所述的酿酒酵母表达的长效重组人丝聚蛋白。