CN109384849B - 一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程制药领域,涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用,具体涉及一种人血清白蛋白分子(Human serum Albumin,HSA)与酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide,TMP)二联体的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋包含一个HSA分子和一个酵母偏好密码子编码的TMP二联体,所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达,可应用于工业生产;同时,该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性,在人体内具有较长的半衰期,可用于制备治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于基因工程制药领域,涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用,具体涉及一种人血清白蛋白分子(Human serum Albumin,HSA)与酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide,TMP)二联体的融合蛋白。
背景技术
在临床上常会遇到由各种原因引起的原发性和继发性血小板减少症,如原发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及肿瘤化/放疗造成的血小板减少等。对于这类疾病,比较适合应用长效升血小板药物进行救治,一方面,可以减少用药次数,减少病人的针痛之苦;另一方面,可以减少药物用量,降低治疗费用。
血小板由巨核细胞产生,促进巨核细胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),是骨髓巨核细胞增殖、分化和血小板生成的最重要调控因子。首先,人们利用研制出一种聚乙二醇(PEG)化的重组人巨核细胞生长和发展因子 PEG-rHuMGDF。动物实验结果表明,PEG-rHuMGDF不仅具有突出的促血小板生成活性,而且在体内具有较长的半衰期,单次应用即可达到显著升高血小板的效果。然而,在临床试验过程中人们发现,一些健康受试者在接受该药物治疗后所产生的抗体与内源性TPO存在交差中和反应,导致受试者出现血小板减少,从而使得PEG-rHuMGDF乃至重组人促血小板生成素rhTPO 的研制在1998年时即被美国FDA叫停。受其影响,在美、欧、日本等国家至今重组人促血小板生成素都未被批准进入临床。1994年科学家利用随机肽库首次筛选出TMP,TMP单体是由14 个氨基酸构成的短肽,氨基酸序列为IEGPTLRQWLAARA。此氨基酸序列与TPO没有序列同源性,并能够与TPO受体胞外部分结合。TMP的发现促进了第二代促血小板生成素的研发,其中最成功的案列为Amgen公司的Romiplostim,该融合蛋白药物已经进入临床应用阶段。 Romiplostim中融合蛋白载体为Fc片段,但是由于Fc片段为非惰性蛋白,它在体内可介导多种免疫反应。
人血清白蛋白分子(Albumin Human,HSA)是血浆中的主要蛋白成分,约占血浆总蛋白的50-60%。HSA是一种非糖基化单链蛋白,共由585个氨基酸残基组成,其分子量为66.5kDa (A.Dugaiczyk et al.,PNAS,1982,79:71-75),血浆半衰期长达两周以上。HSA在宿主细胞中是以一种原肽形式合成的,其中含24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽,在转运和分泌过程中信号肽和前肽被切除。HSA是一个稳定的惰性蛋白,可以作为药物载体。HSA全文已成功地在多宿主中表达(EP330451和EP361991),尤其在酵母细胞中可实现HSA较高水平的稳定表达。当目的多肽与HSA融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性,还可以增加多肽药物在体内的半衰期。专利号CN201310084212.8的二聚体化融合蛋白的制备及应用中公开了人血清白蛋白-二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体融合蛋白的制备及应用,但是其存在融合蛋白表达效果不理想的问题,为了提高表达产量、增强融合蛋白的生物活性,本发明采用了酵母偏好密码子编码促血小板生成素模拟肽TMP二联体的策略。基于上述研究现状,本发明现提供一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由酵母偏好密码子编码而成的,所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达,可应用于工业生产;同时,该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性,在人体内具有较长的半衰期。本发明同时提供该融合蛋白的制备方法和应用。
重组蛋白的异源表达受到基因自身序列特征如密码子偏好性、GC含量、mRNA二级结构、 mRNA稳定性等因素的影响。研究表明同义密码子的更换能够影响蛋白质翻译延伸的速率 [1-2],说明密码子的优化可能会对重组蛋白的表达起到适得其反的影响。另一方面,重组蛋白的表达还受到宿主、培养条件、分泌途径、启动子等因素的影响,现行的基因优化理论和设计方法还不成熟,存在着各种各样的局限性,基因优化策略对提高重组蛋白的表达量是必要条件,而不是充分条件。综上所述,通过酵母偏好密码子改造从而改良基因工程菌株表达量的策略在实际生产应用中存在着极大的不确定性,针对不同的目的基因进行改造,最终的结果是无法预知的。
参考文献:
[1]Komar AA,Lesnik T,Reiss C.Synonymous codon substitutions affectribosome traffic and protein folding during in vitro translation.FEBS Lett,1999,462(3): 387-391.
[2]Trinh R,Gurbaxani B,Morrison SL,et al.Optimization of codon pairuse within the(GGGGS)3 linker sequence results in enhanced proteinexpression.Mol Immunol, 2004,40(10):717-722.
发明内容
本发明的目的在于提供一种促血小板生成素的融合蛋白,该融合蛋白半衰期长,能在宿主体内高水平稳定表达。
本发明的另一个目的是提供上述融合蛋白的制备方法。
本发明的另一个目的是提供上述融合蛋白的应用。
本发明所述的上述目的是通过以下技术方案实现的:
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,包括人血清白蛋白HSA、促血小板生成素模拟肽TMP二联体,所述的人血清白蛋白HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列,编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ IDNO: 3所示,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列,促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的,编码所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:1所示,该融合蛋白还包括可形成二聚体化结构域的肽段。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,可形成二聚体化结构域的肽段中含有至少两个半胱氨酸。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,可形成二聚体化结构域的肽段中含有两个半胱氨酸。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段,其氨基酸序列如Seq ID No:8所示,或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列,编码H 肽段氨基酸序列的DNA序列如Seq ID No:7所示。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,其中HSA连接于融合蛋白的C-末端,结构式表示为HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP,L1、L2、L3表示肽接头,L1的氨基酸序列为GGPSG, L2的氨基酸序列为GGGGSGL,L3的氨基酸序列为EFGGGGS,H表示可形成二聚体化结构域的H 肽段。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,其中HSA位于融合蛋白的N-末端,结构式表示为HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,编码所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明公开了一种促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚体化融合蛋白。
本发明公开一种促血小板生成素的融合蛋白,包括人血清白蛋白HSA、促血小板生成素模拟肽TMP二联体,所述的人血清白蛋白HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列,编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ IDNO: 3所示,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的,编码所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:1所示,该融合蛋白还包括二聚体化结构域。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的二聚体化结构域是通过二硫键的共价作用使促血小板生成素的融合蛋白二聚体化。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的二聚体化结构域中含有至少两个由半胱氨酸形成的二硫键。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的二聚体化结构域中含有两个由半胱氨酸形成的二硫键。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的二聚体化结构域包含H肽段,H 肽段的氨基酸序列如Seq ID No:8所示。
本发明公开的促血小板生成素的融合蛋白,所述HSA连接于融合蛋白的C-末端,结构式表示为HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP,L1、L2、L3表示肽接头,L1的氨基酸序列为GGPSG,L2的氨基酸序列为GGGGSGL,L3的氨基酸序列为EFGGGGS,H表示可形成二聚体化结构域的H肽段。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述HSA位于融合蛋白的N-末端,结构式表示为HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,编码所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚体化融合蛋白。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白,所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白在制备治疗原发性或继发性血小板减少症的药物中的应用。
本发明公开的一种促血小板生成素的融合蛋白的制备方法,所述步骤如下:
1)全基因合成酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽TMP二联体基因序列;
2)通过PCR扩增获取HSA分子基因序列;
3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌,获得含编码所述酵母偏好密码子编码的人血清白蛋白的融合蛋白与促血小板生成素模拟肽二联体的DNA序列的重组表达载体;
4)提取步骤3)所述的重组表达载体并线性化,再转化到宿主表达***进行表达,纯化表达上清,获得所述融合蛋白。
一种含有上述促血小板生成素的融合蛋白编码基因的重组表达载体。可用于携带编码本发明融合蛋白的基因的表达载体包括但不局限于原核、真核表达***常用的质粒。
一种含有上述重组表达载体的宿主表达***。宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等,其中优选的是酵母,更优选的是毕赤酵母;对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化,这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术,其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。
本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用,这些药物载体包括水、盐水、糖类、醇类及氨基酸等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水量低于3%或不含水的冻干制剂,给药方式包括静脉输注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻内、呼吸道等,其中优选的是皮下或肌肉注射。
所述融合蛋白能在酵母体内稳定高效的表达,可应用于工业生产;同时,该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性,在人体内具有较长的半衰期,可用于制备治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病的药物。
以下提供具体实施例以实现本发明所述的一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用。但不限于这些实施例。
附图说明:
图1:***有HSA基因的pcDNA3.1-HSA载体,作为构建促血小板生成素的融合蛋白表达载体的模板。
图2:促血小板生成素的融合蛋白表达载体图谱
具体实施方式
主要实验仪器:
移液枪、超净工作台(安泰)、磁力搅拌器、微波炉、高温蒸汽灭菌锅、-80℃低温冰箱 (Forma)、超纯水仪(Millipore)、制冰机、离心机(Hitachi)、HDB-PLUS型恒温金属浴、HZQ-F16OA型恒温振荡培养箱(上海一恒)、PCR仪(Applied Biosystems)、台式冷冻离心机(Thermo)、DYY-8B型电泳仪(伯乐)、Image Quant 300型凝胶成像仪(GE)等。
主要实验材料:
1.限制性核酸内切酶KpnI、EcoRI、SacI、AflII(NEB公司产品,美国)
2.小提质粒试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(生工公司,中国)
3.T4 DNA连接酶试剂盒(Takara公司产品,中国大连)
4.载体pPinkα-HC、毕赤酵母菌株(Invitrogen公司产品,美国)
5.大肠杆菌TOP10(天根生化科技(北京)有限公司)
6.酵母提取物、蛋白胨(Oxford公司产品,美国)
7.LB培养基
酵母提取物5g,蛋白胨10g,NaCl 10g,溶于1000mL去离子水中,并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0,高压蒸气灭菌。
8.YPD培养基
酵母提取物10g,胰蛋白胨20g,Agar 20g,溶于900mL去离子水中,高压灭菌,冷却后加入100mL经滤器除菌后的20%的右旋糖。
9.YPDS培养基
酵母提取物10g,蛋白胨20g,山梨糖醇182.2g,溶于900mL去离子水中,高压灭菌,冷却后加入100mL经滤器除菌后的20%的右旋糖。
10.BMGY液体培养基
酵母提取物10g,蛋白胨20g,无氨基酸酵母氮源13.4g,甘油10g,磷酸钾26.631g,溶于1000mL双蒸水中高压灭菌,冷至室温,调节pH至6.0,4℃保存备用。
11.1%琼脂糖凝胶的配置
根据用量,每100mL的TAE缓冲液,加入1g琼脂糖,使用微波炉加热煮沸,使琼脂糖完全融解,室温冷却至不烫手时滴加少量溴化乙锭(EB),混匀后将其倒入事先摆放好梳子的胶槽中,待到室温冷却至完全凝固后拔去梳子即可使用。
实施例1 HSA-TMP融合蛋白酵母表达载体的构建与表达
一、p29-simple-TMP序列的获得
1.首先根据毕赤酵母偏爱密码子对编码(TMP)2的基因序列进行优化。
2.委托大连Takara公司合成优化后的(TMP)2基因,(TMP)2的DNA序列如SEQ ID NO:1 所示,并将其装载到p29-simple(p29-simple质粒载体大连Takara公司提供),获得载体p29-simple-(TMP)2。
3.其中p29-simple-TMP中已包含L,即连接肽,LDNA序列为 GGCGGCGGCGGTTCCGGACTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCGAATTCGGTGGTGGCGGCAGC,氨基酸序列为GGGGSGLEPKSCDKTHTCPPCEF GGGGS。
二、HSA cDNA的片段的克隆:
从质粒pcDNA3.1-HSA克隆获得(HSA全基因序列由宝生物公司全基因合成,pcDNA3.1质粒购自Invitrogen)
三、HSA序列的获得
1.设计合成PCR引物:
P1:GGTACCTCATAAGCCTAAGGCAGCTTG
P2:TCCGGAGATGCACACAAGAGTGAG
2.PCR扩增:以载体pcDNA3.1-HSA的DNA为模版,以P1和P2分别作为上、下游引物,进行PCR扩增。反应条件如下:①变性:94℃,5min;②变性:94℃,1min;③复性:55℃, 30S;④延伸:72℃,2min;⑤返回步骤“②”,35循环;⑥延伸:72℃,5min,总循环次数为30次。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示扩增出约1.8kb大小的HSA的DNA 条带。
四、pPinkα-HC-HSA-(TMP)2融合蛋白酵母表达载体的构建
1.提取p29-simple-(TMP)2载体,KpnI和EcoRI双酶切质粒,胶回收对应的TMP(KpnI/EcoRI)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
2.将HSA经PCR扩增后的产物EcoRI和SacI双酶切,胶回收对应的HSA(EcoRI/SacI)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO:3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
3.同时,SacI和KpnI双酶切载体pPinkα-HC(Invitrogen公司产品)的DNA,胶回收pPinkα-HC(SacI/KpnI)载体片段;
4.T4 DNA酶连接TMP(KpnI/EcoRI)DNA片段、HSA(EcoRI/SacI)DNA片段和pPinkα-HC (SacI/KpnI)载体片段,转化感受态大肠杆菌TOP10,涂布于氨苄抗性LB板37℃培养过夜,筛选阳性克隆。所得克隆送Invitrogen公司测序,序列正确的克隆命名为pPINKα-HC-HSA-(TMP)2。
五、HSA-(TMP)2融合蛋白在酵母中的表达
将测序正确的载体pPinkα-HC-HSA-(TMP)2的DNA用AflII酶切回收后得到 pPinkα-HC-HSA-(TMP)2,转化酵母感受态细胞。然后将转化菌液接种于PAD平板,30℃培养3-4天,挑取阳性克隆。将得到阳性克隆分别接种BMGY液体培养基,30℃培养48小时,然后转接至BMMY培养基中诱导表达,持续96小时后,1500rpm低温离心15分钟,取上清,SDS- PAGE电泳检测蛋白表达情况,分子量约70kD蛋白条带即为HSA-TMP融合蛋白,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6,编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示。选择表达水平最高的菌株作为工程菌,冻存于-80℃保种
实施例2 HSA-(TMP)2融合蛋白的生物活性检测
1、实验过程
细胞铺板,c-mpl、c-fos、pAdVAntage、Renilla,四质粒共转染。转染后48h,分别加入阳性对照、空白对照和受试样品,分别检测萤火虫荧光素酶活力和海肾荧光素酶活力,计算荧光比率。
阳性对照:特比澳特比澳(重组人促血小板生成素注射液)购买自沈阳三生制药有限责任公司
空白对照:血清
荧光比率=萤火虫荧光值/海肾荧光值。
具体步骤详见中国专利(CN201310084212)。
2.实验结果
表1 HSA-(TMP)2融合蛋白的生物活性检测结果
实验组 | 相对荧光比率 |
空白对照组 | 1.00±0.02 |
阳性对照组 | 1.44±0.12 |
1号酵母菌株 | 1.90±0.04 |
2号酵母菌株 | 2.01±0.16 |
3号酵母菌株 | 1.97±0.11 |
4号酵母菌株 | 2.98±0.09 |
结果表明,所有转染不含c-mpl受体的pcDNA3.1-HSA空载体各处理组,相对荧光比率均为1。所有转染c-mpl-pcDNA3.1载体的各处理组数据见上表1。由表1可知所检测4株酵母菌表达样品中的HSA-(TMP)2融合蛋白均具有显著的c-mpl受体依赖的生物活性。特比奥阳性药物及通过对TMP二联体核苷酸序列进行偏好密码子改造后的融合蛋白酵母表达菌株均具有受体依赖的生物活性。因此,本发明通过对TMP二联体实施偏好密码子改造,提高了促血小板生成素的融合蛋白生物活性。
专利号CN201310084212.8的二聚体化融合蛋白的制备及应用中公开了二聚体化促血小板生成素(TPO)模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的制备及应用,该专利中酵母表达的二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白c-mpl受体依赖的细胞水平生物活性平均值为1.635,本发明公开的促血小板生成素的融合蛋白生物活性检测结果平均值远高于1.635,因此,本发明通过对TMP二联体实施偏好密码子改造,提高了促血小板生成素的融合蛋白生物活性,远高于未对促血小板生成素模拟肽TMP二联体基因改造产生的融合蛋白的活性。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110> 兰州大学
<120>一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> TMP二联体的DNA序列
<400> 1
attgagggtc caactttgag acaatggttg gctgctagag ccggtggtcc atctggaatc 60
gagggaccta ccctgagaca gtggcttgct gctagagct 99
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> TMP二联体的氨基酸序列
<400> 2
Total amino acid number: 32, MW=3408
Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1) for 32 AA(96 bases), MW=3408
1 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Ser Gly Ile
21 Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
<210> 3
<211> 1755
<212> DNA
<213> HSA的DNA序列
<400> 3
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgt tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480
tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540
aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600
gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660
cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720
gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780
gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200
tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260
ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320
cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacgtt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gctta 1755
<210> 4
<211> 585
<212> PRT
<213> HSA的氨基酸序列
<400> 4
1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys
21 Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
41 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu
61 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
81 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu
101 Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
121 Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr
141 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
161 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro
181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
201 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser
221 Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu
261 Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
281 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala
301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
321 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp
341 Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu
381 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
401 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr
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441 Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu
461 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
481 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys
501 Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
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541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
561 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln
581 Ala Ala Leu Gly Leu
<210> 5
<211> 2010
<212> DNA
<213> ss-HSA-L2-H- L3-TMP-L1-TMP融合蛋白的DNA序列
<400> 5
aagtgggtaa cctttatttc ccttcttttt ctctttagct cggcttattc caggggtgtg 60
tttcgtcgag atgcacacaa gagtgaggtt gctcatcggt ttaaagattt gggagaagaa 120
aatttcaaag ccttggtgtt gattgccttt gctcagtatc ttcagcagtg tccatttgaa 180
gatcatgtaa aattagtgaa tgaagtaact gaatttgcaa aaacatgtgt tgctgatgag 240
tcagctgaaa attgtgacaa atcacttcat accctttttg gagacaaatt atgcacagtt 300
gcaactcttc gtgaaaccta tggtgaaatg gctgactgtt gtgcaaaaca agaacctgag 360
agaaatgaat gcttcttgca acacaaagat gacaacccaa acctcccccg attggtgaga 420
ccagaggttg atgtgatgtg cactgctttt catgacaatg aagagacatt tttgaaaaaa 480
tacttatatg aaattgccag aagacatcct tacttttatg ccccggaact ccttttcttt 540
gctaaaaggt ataaagctgc ttttacagaa tgttgccaag ctgctgataa agctgcctgc 600
ctgttgccaa agctcgatga acttcgggat gaagggaagg cttcgtctgc caaacagaga 660
ctcaagtgtg ccagtctcca aaaatttgga gaaagagctt tcaaagcatg ggcagtagct 720
cgcctgagcc agagatttcc caaagctgag tttgcagaag tttccaagtt agtgacagat 780
cttaccaaag tccacacgga atgctgccat ggagatctgc ttgaatgtgc tgatgacagg 840
gcggaccttg ccaagtatat ctgtgaaaat caagattcga tctccagtaa actgaaggaa 900
tgctgtgaaa aacctctgtt ggaaaaatcc cactgcattg ccgaagtgga aaatgatgag 960
atgcctgctg acttgccttc attagctgct gattttgttg aaagtaagga tgtttgcaaa 1020
aactatgctg aggcaaagga tgtcttcctg ggcatgtttt tgtatgaata tgcaagaagg 1080
catcctgatt actctgtcgt gctgctgctg agacttgcca agacatatga aaccactcta 1140
gagaagtgct gtgccgctgc agatcctcat gaatgctatg ccaaagtgtt cgatgaattt 1200
aaacctcttg tggaagagcc tcagaattta atcaaacaaa attgtgagct ttttgagcag 1260
cttggagagt acaaattcca gaatgcgcta ttagttcgtt acaccaagaa agtaccccaa 1320
gtgtcaactc caactcttgt agaggtctca agaaacctag gaaaagtggg cagcaaatgt 1380
tgtaaacatc ctgaagcaaa aagaatgccc tgtgcagaag actatctatc cgtggtcctg 1440
aaccagttat gtgtgttgca tgagaaaacg ccagtaagtg acagagtcac caaatgctgc 1500
acagaatcct tggtgaacag gcgaccatgc ttttcagctc tggaagtcga tgaaacatac 1560
gttcccaaag agtttaatgc tgaaacgttc accttccatg cagatatatg cacactttct 1620
gagaaggaga gacaaatcaa gaaacaaact gcacttgttg agcttgtgaa acacaagccc 1680
aaggcaacaa aagagcaact gaaagctgtt atggatgatt tcgcagcttt tgtagagaag 1740
tgctgcaagg ctgacgataa ggagacctgc tttgccgagg agggtaaaaa acttgttgct 1800
gcaagtcaag ctgccttagg cttaggcggc ggcggttccg gactggagcc caagagctgc 1860
gacaagaccc acacctgccc tccctgcgaa ttcggtggtg gtggttctat tgagggtcca 1920
actttgagac aatggttggc tgctagagcc ggtggtccat ctggaatcga gggacctacc 1980
ctgagacagt ggcttgctgc tagagcttaa 2010
<210> 6
<211> 669
<212> PRT
<213> ss-HSA-L2-H- L3-TMP-L1-TMP融合蛋白的氨基酸序列
<400>6
1 Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val
21 Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
41 Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu
61 Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu
81 Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val
101 Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
121 Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg
141 Pro Glu Val Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys
161 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe
181 Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
201 Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg
221 Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
241 Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp
261 Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
281 Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu
301 Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu
321 MET Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys
341 Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
361 His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu
381 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
401 Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln
421 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
441 Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys
461 Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu
481 Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys
501 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
521 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser
541 Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro
561 Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys
581 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
601 Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Pro Lys Ser Cys
621 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Pro
641 Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Ser Gly Ile Glu Gly Pro Thr
661 Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala ***
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> H 肽段的基因序列
<400> 7
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccctccct gc 42
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> H 肽段的氨基酸序列
<400>8
1 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
Claims (8)
1.一种促血小板生成素的融合蛋白,包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模拟肽TMP二联体,所述的人血清白蛋白HSA分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,编码所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:3所示,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,其特征在于,所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由酵母偏好密码子编码而成的,编码所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:1所示,该融合蛋白还包括可形成二聚体化结构域的肽段,所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备,所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述的一种促血小板生成素的融合蛋白,其特征在于,所述的可形成二聚体化结构域的肽段中含有至少两个半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种促血小板生成素的融合蛋白,其特征在于,所述的可形成二聚体化结构域的肽段中含有两个半胱氨酸。
4.根据权利要求3所述的一种促血小板生成素的融合蛋白,其特征在于,所述的可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段,其氨基酸序列如Seq ID No:8所示。
5.根据权利要求4所述的促血小板生成素的融合蛋白,其特征在于,所述HSA连接于融合蛋白的N-末端,结构式表示为HSA-L2-H-L3-TMP-L1-TMP,L1、L3、L3表示肽接头,L1的氨基酸序列为GGPSG,L2的氨基酸序列为GGGGSGL,L3的氨基酸序列为EFGGGGS,H表示可形成二聚体化结构域的H肽段;所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,编码所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
6.权利要求5所述的一种促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚体化融合蛋白。
7.权利要求1至6任意一项所述的一种促血小板生成素的融合蛋白在制备治疗原发性或继发性血小板减少症的药物中的应用。
8.一种如权利要求1所述的促血小板生成素的融合蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤如下:
1)全基因合成酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽TMP二联体基因序列,所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的基因序列如SEQ ID NO:1所示;
2)通过PCR扩增获取HSA分子基因序列,所述的HSA分子的基因序列如SEQ ID NO:3所示;
3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌,获得含编码所述酵母偏好密码子编码的人血清白蛋白的融合蛋白与促血小板生成素模拟肽二联体的DNA序列的重组表达载体;
4)提取步骤3)所述的重组表达载体并线性化,再转化到宿主表达***进行表达,纯化表达上清,获得所述融合蛋白。
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