CN113045624B - 具有降血脂活性和调节肠道菌群作用的黄酒多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有降血脂活性和调节肠道菌群作用的黄酒多肽及其应用，属于食品技术领域。本发明公开了一种具有降血脂作用的黄酒多肽在功能食品中的应用。利用分离纯化和氨基酸序列鉴定方法得到了一种黄酒多肽，其氨基酸序列为Tyr‑Val‑Lys‑Val(YVKV)。该黄酒多肽具有良好的降低高脂小鼠血脂水平的效果，可以有效调节高脂饮食导致的胆固醇水平改变。含有黄酒多肽YVKV的黄酒能够恢复高脂饮食导致的菌群结构变化，具有广阔的市场应用前景。

Description

具有降血脂活性和调节肠道菌群作用的黄酒多肽及其应用

技术领域

本发明涉及具有降血脂活性和调节肠道菌群作用的黄酒多肽及其应用，属于食品技术领域。特别涉及一种具有在高脂小鼠中调节脂质代谢和肠道菌群的黄酒多肽及其在功能食品中的应用。

背景技术

随着我国经济的日益发展，患有高血糖、高血脂、糖尿病等慢性病的人群大量增加。其中，高血脂症(hyperlipidemia，HPL)是一种临床上常见的体内脂代谢异常或转运异常的全身性疾病，又被称为脂质异常血症。其特征为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量低，长期的血脂异常会损害机体健康并引发其他相关代谢异常疾病，增加罹患脂肪肝和高血压等疾病的风险，严重影响身体健康。世界卫生组织的调查统计显示，近年来高脂血症在人群中的发病率逐年升高，并且有年轻化的趋势。相关的疾病监测数据表明，我国血脂异常患者已达1.6亿人，因此预防和控制高血脂症对于解决这些并发症至关重要。

尽管治疗高血脂症的药物已有很大进展，但是长期服用药物的副作用也逐渐显现，而天然肽类既具有良好的效果且没有副作用，进而逐步成为改善脂质代谢紊乱的新方法。此外，大量研究结果表明肠道菌群紊乱在肝脏脂质和胆固醇代谢失调中发挥着关键作用，并且提出肠道菌群是治疗和预防高脂膳食引发的高血脂症的新靶点。

黄酒的酿造原料富含蛋白质，而发酵过程中的微生物产出各类代谢酶，因此发酵酿造的黄酒中通过原料分解和微生物代谢积累而具有含量丰富且种类多样的肽类。虽然黄酒中的多肽丰富且种类多样，但是围绕其体内的降血脂评价很少，而且黄酒多肽调节肠道菌群的研究为空白状态，这极大限制了我国黄酒的产业发展。黄酒自古以来兼具风味口感和养生功能，深得民众喜爱。黄酒不仅是我国独特的瑰宝，也承载着传统中华文化和技艺，其中绍兴黄酒酿制技艺是国家级非物质文化遗产之一，因此，针对性研究黄酒中活性多肽，对了解传统黄酒的保健养生机理及提高产品质量都具有十分重要的经济意义和实践价值。

发明内容

利用大孔树脂吸附和凝胶色谱层析技术对黄酒多肽进行分离纯化，并采用氨基酸结构鉴定上述黄酒多肽，得到了一种黄酒多肽，其氨基酸序列为酪氨酸-缬氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Tyr-Val-Lys-Val，YVKV)，疏水氨基酸占比为2/4，分子量为507.30Da。将肽段的氨基酸序列与NCBI数据库进行比对，发现此为新多肽。

本发明提供了一种黄酒多肽，所述黄酒多肽的氨基酸序列为酪氨酸-缬氨酸-赖氨酸-缬氨酸。

本发明提供了所述黄酒多肽在制备调节血脂的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述调节血脂包括：血清总胆固醇及降低低密度脂蛋白胆固醇含量的降低、和/或高密度脂蛋白胆固醇含量的提升。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述功能性食品包括功能性黄酒、功能性乳饮料、功能性黄酒冷冻饮品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括动物饲料。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。

在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包括润滑剂、湿润剂、粘合剂、稀释剂和/或吸收剂。

本发明提供了所述黄酒多肽在制备调节肠道菌群的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述肠道菌群包括疣微菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括动物饲料。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述功能性食品包括功能性黄酒、功能性乳饮料、功能性黄酒冷冻饮品。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。

在本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包括润滑剂、湿润剂、粘合剂、稀释剂和/或吸收剂。

本发明提供了一种制备权利所述多肽的方法，所述方法包括：

(1)黄酒预处理：将黄酒过膜抽滤，得到抽滤液；

(2)将抽滤液经超滤***分离，取分子量不大于3kDa的组分；

(3)将分子量不大于3kDa的组分通过大孔树脂吸附，得到粗多肽；

(4)将粗多肽经凝胶色谱层析，收集洗脱液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的大孔树脂为DA201-C极性大孔吸附树脂；洗脱液为50％～70％的乙醇。

本发明的有益效果：

本发明通过建立小鼠高血脂模型，测定小鼠血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇等指标。结果表明摄入黄酒多肽YVKV后，血清总胆固醇含量降低，且低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的含量均改善至正常水平，黄酒多肽YVKV具有降低血脂作用。在高脂小鼠的菌群调节方面，黄酒多肽YVKV的干预恢复肠道菌群结构到正常水平，具有调节菌群结构的作用，具有良好的菌群调节效果。因此，本发明所述黄酒多肽YVKV具有菌群调节功能，具备极高的应用前景。

附图说明

图1为黄酒多肽YVKV的质谱分析图。

图2为黄酒多肽YVKV对高脂小鼠血清指标的改善作用图。

图3为黄酒多肽YVKV摄入后对高脂饮食小鼠肠道菌群结构的调节作用图。

具体实施方式

实施例中涉及的黄酒购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，黄酒酒精度均为15～18％vol，半干型黄酒。

实施例1：生物活性黄酒多肽的合成方法

分离纯化获得黄酒多肽，利用氨基酸序列分析明确其氨基酸结构为YVKV(如图1)。采用固态合成多肽技术对已知氨基酸序列的黄酒多肽进行合成。将树脂进行溶胀和脱保护剂等处理，作为固相载体参与氨基酸偶联反应。使用茚三酮监测法控制反应进程，当氨基酸缩合反应全部结束后即为完成氨基酸偶联过程。再通过高效液相色谱法进行氨基酸制备和分析过程，在质谱检测完全正确后，对多样样品进行旋转蒸发和冷冻干燥，进而得到目的肽段产物。

具体步骤如下：

(1)黄酒的预处理除杂：采用循环水式真空泵抽滤黄酒通过0.22μm的微孔滤膜，可去除黄酒中分子量较大的固形物。所用的超滤组件需经过0.1mol/L NaOH溶液洗涤处理，并用蒸馏水洗至流出液为中性方可使用。

(2)超滤分离：通过超滤***分级超滤酒样，得到小于3kDa的组分，取小于3kDa的组分进一步分离纯化。

(3)大孔树脂吸附：选用DA201-C极性大孔树脂，其比表面积为550-600m²/g，平均孔径为100-110A°，粒径范围为0.3～1.26mm，含水量为65-76％。对大孔树脂进行预处理，使用95％乙醇浸泡DA201-C大孔树脂24h后，使用蒸馏水清洗大孔树脂，直至流出液无明显乙醇气味并清澈透明。分别用1mol/L的HCl和4％的NaOH浸泡24h，以去除树脂在合成过程中的杂质，树脂洗至中性后滤去多余水分备用；取10g(干重)处理后的树脂置于锥形瓶中，加入步骤(2)得到的小于3kDa的组分100mL，于25℃、150r/min条件下吸附24h，抽滤后测定多肽含量。随后进行洗脱，洗脱液经旋蒸去除乙醇后冻干，得到黄酒粗多肽组分。

(4)凝胶色谱层析：使用Sephadex G-15葡聚糖凝胶预处理及装柱，装柱后用蒸馏水平衡2个柱体积至检测器基线平稳。用蒸馏水将黄酒粗多肽组分配制成浓度为16mg/mL的溶液，经0.22μm微孔膜过滤后经过凝胶过滤分离层析***，以蒸馏水(pH 7.0)为流动相，流速为3mL/min，收集洗脱液，合并同一分离峰的洗脱液进行冷冻干燥后得黄酒多肽分离纯化组分，经氨基酸结构鉴定(氨基酸结构鉴定使用电喷雾离子阱质谱仪将多肽进行还原烷基化后经反相色谱分离，鉴定出相应的氨基酸序列)，其氨基酸序列为酪氨酸-缬氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Tyr-Val-Lys-Val，YVKV)，疏水氨基酸占比为2/4，分子量为507.30Da。

实施例2：黄酒多肽YVKV的体内降血脂情况

利用高脂饲料和雄性小鼠(C57BL6J)建立高血脂模型。实验组饲喂高脂饲料并每日灌胃0.2mL含0.3g/(kg·BW·d)黄酒多肽YVKV的黄酒(16％vol)，8周后取血测定其血清生化指标，血液在4℃，3000×g条件下离心10min，使用小量程移液枪慢速吸取上层离心液即为血清，按照试剂盒方法测定其总胆固醇TC、总甘油三酯TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇HDL-C等指标。由图2可知，相比正常对照组，高脂饮食组的血清总胆固醇(P<0.001)和低密度脂蛋白胆固醇(P<0.05)的含量显著升高，同时高密度脂蛋白胆固醇(P<0.01)的含量显著降低，表明此高脂饮食导致的脂质代谢紊乱和高血脂模型成立。

黄酒多肽YVKV干预后，血清总胆固醇含量降低，且LDL-C和HDL-C的含量均改善至正常对照组水平，因此黄酒多肽YVKV具有降低血脂作用。

此外，与用相同方法从黄酒中提取的另一多肽FLF相比，黄酒多肽YVKV可显著改善高密度脂蛋白胆固醇到正常水平，效果优于另一黄酒多肽，因此进一步评价该黄酒多肽的调节菌群作用。

表1黄酒多肽对于胆固醇含量的调节作用

实施例3：黄酒多肽YVKV调节高脂小鼠肠道菌群的作用效果

在实施例2的基础上，采集小鼠粪便样品，提取粪便总DNA，并对细菌基因16SrDNAV4区进行PCR扩增(引物序列为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。胶回收后使用建库试剂盒进行文库构建，并进行上机测序。基于Illumina Nova测序平台进行双末端(paired-end)测序。下机后按97％的相似性将序列聚类成为可操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。根据聚类结果结合QIIME软件进行相对丰度比较，以明确各组间群落结构差异，并对特定菌群相对丰度变化进行统计分析。

如图3所示，在门水平上，高脂饮食会导致疣微菌门相对丰度相比对照组0.0047±0.0025显著增加为0.1262±0.0322，黄酒多肽干预恢复了肠道菌群结构到正常水平，其中厚壁菌门(对照组0.5263±0.0391和黄酒多肽组0.5207±0.1157)和拟杆菌门(对照组0.3581±0.0042和黄酒多肽组0.2406±0.0792)的相对丰度都与正常组无显著差异，具有调节菌群结构的作用。

实施例4：利用黄酒多肽YVKV制备富含多肽的半干型功能性黄酒

在黄酒酿造前酵和后酵完成后，经过压榨工艺得到黄酒原液，经过煎酒工艺，如70-85℃加热10-30min后，冷却、过滤、勾调。同时制备多肽溶液加热灭菌达到稳定后加入黄酒中，调制成多肽含量达到8-15g/L的功能性黄酒。

实施例5：制备含有黄酒多肽YVKV的功能性乳饮料

配制10％脱脂乳，加热溶解后在95℃ 5min条件下加热处理，冷却后按5％接种量接种乳酸菌发酵剂，在37℃下发酵24h左右，控制终点酸度为160°T左右，加入等量的110℃5min杀菌的糖肽混合溶液(含10％蔗糖，2％黄酒多肽YVKV，0.1％蔗糖酯和0.4％果胶)。混合后预热至60℃，20MPa压力下进行均质，热处理后冷却并灌装，可制成含有黄酒多肽YVKV的功能性发酵乳饮料。

实施例6：制备含有黄酒多肽YVKV的功能性黄酒冷冻饮品(雪糕)

黄酒雪糕原料成分基于以下配方：

(1)白砂糖15％、麦芽糖浆6％、果葡糖浆1％、全脂奶粉6.25％、脱脂奶粉3.75％、稀奶油2％、麦芽糊精2.5％、糯米粉0.8％、熟糯米2％、乳化稳定剂0.4％；

(2)黄酒5％、黄酒多肽YVKV0.5％，焦糖色素0.105％、黄酒香精0.02％、甜酒酿香精0.03％，余量为纯净水。

制作方法为：按照原料配方(1)投入缸中进行混合形成料液，进行杀菌处理和均质处理，均质处理时的温度为62-72℃，压力为15-18MPa。均质处理后冷却至0-4℃，并保温3.5-4小时。通过老化过程增加料液粘度，提高冷凝搅拌时的膨胀率。

按比例向制好的混合料液中加入原料(2)，并搅拌均匀。下料灌注并在-2℃至-6℃下进行凝冻，经过插棒和脱模，冷冻后得到含有黄酒多肽YVKV的功能性黄酒冷冻饮品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种黄酒多肽，其特征在于，所述黄酒多肽的氨基酸序列为酪氨酸-缬氨酸-赖氨酸-缬氨酸。

2.权利要求1所述黄酒多肽在制备辅助调节血脂的产品中的应用；所述调节血脂包括：降低血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇含量，和/或提高高密度脂蛋白胆固醇含量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括动物饲料。

6.权利要求1所述黄酒多肽在制备辅助调节肠道菌群的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群包括疣微菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品包括功能性食品、功能性饮品和/或药物组合物。

9.一种制备权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）黄酒预处理：将黄酒过膜抽滤，得到抽滤液；

（2）将抽滤液经超滤***分离，取分子量不大于3 kDa的组分；

（3）将分子量不大于3 kDa的组分通过大孔树脂吸附，得到粗多肽；

（4）将粗多肽经凝胶色谱层析，收集洗脱液。

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