CN116519854A - 黄水活性提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄水活性提取物及其用途，属于白酒副产物再利用技术领域。本发明为实现酿酒副产物黄水的循环利用价值，从黄水中提取获得了一种活性提取物，提取步骤为：取黄水，有机溶剂沉淀，离心，上清液依次经超滤膜过滤和纳滤膜过滤，最后浓缩，得到黄水活性提取物。本发明利用有机溶剂沉淀除去大分子的多糖和蛋白，再以超滤膜、纳滤膜分子截留方式，得到黄水中活性成份；经超高效液相色谱‑质谱检测，黄水活性提取物中含有大量氨基酸及小分子肽等氨基酸类衍生物，并通过细胞实验，验证了黄水活性提取物对BV2神经细胞有一定的保护作用，为黄水在药用方面的价值提供了数据基础，提高了黄水的应用价值，扩大了黄水用途。
Description
技术领域
本发明属于白酒副产物再利用技术领域，具体涉及一种黄水活性提取物及其用途。
背景技术
黄水是固态酿造白酒过程中起糟滴窖产生的黄色或棕黄色液体，是微生物以粮食为原料的发酵产物，富含糖类、蛋白及白酒风味成份，黄水风味成份通过蒸馏方式得到回收利用，而剩余的底锅黄水则作为废液处理排放。黄水中丰富的多糖，蛋白质分解形成的多肽、小分子肽等活性化合物没有得到回收利用，导致黄水废液的COD值高至10万以上，同时黄水属于固态酿造白酒副产物，产量大，常常只能作为废液排掉，既造成了废液处理负担，又造成了极大的资源浪费。分离提取黄水中的活性成份，并进行活性评价，可以提升黄水循环利用价值。
小胶质细胞BV2作为中枢神经***内的免疫细胞，既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用，又可在致炎因子的作用下，激活成反应性小胶质细胞，分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用，是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点。神经病理性疼痛是神经***损伤引起的一种慢性疼痛，其发病机制复杂，至今尚缺乏有效的治疗药物。活化的小胶质细胞表达P2X4受体和P2X7受体，可以诱导病理性疼痛的发生。
从黄水中提取活性成份，以细胞活力，P2X4、P2X7 mRNA表达评价活性提取物对BV2神经细胞的治疗作用方面的研究未见报道。
发明内容
本发明为实现酿酒副产物黄水的循环利用价值，从黄水中提取获得了一种活性提取物，其具有体外抗氧化活性，并且经细胞实验，该活性提取物对BV2神经细胞具有良好的治疗作用。
本发明首先提供了一种黄水活性提取物，其制备方法包括以下步骤：
A、取黄水，经第一次静置冷藏，取上清液和有机溶剂混合均匀，再经第二次静置冷藏，然后离心除去沉淀，得清液；
B、取步骤A所得清液，先经超滤膜过滤，除去大分子，再经纳滤膜过滤，除去水分和有机试剂，得提取液，将提取液浓缩，即得黄水活性提取物。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，所述黄水为浓香型白酒酿造过程中起糟滴窖时产生的黄色液态副产物。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，所述有机溶剂为醇系有机溶剂。
优选的，上述黄水活性提取物，步骤A中，所述有机溶剂为食品级乙醇。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，所述有机溶剂与黄水的体积比为3～4：1。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，第一次静置冷藏的温度为0～10℃。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，第一次静置冷藏的时间为24～48h。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，第二次静置冷藏的温度为0～10℃。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，第二次静置冷藏的时间为24～48h。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，离心的温度为0～10℃。
其中，上述黄水活性提取物，步骤A中，离心的转速为4000～8000r/min。
其中，上述黄水活性提取物，步骤B中，所述超滤膜的截留分子量为3000～10000Da。
其中，上述黄水活性提取物，步骤B中，所述纳滤膜的截留分子量为200～300Da。
其中，上述黄水活性提取物，步骤B中，所述浓缩的温度为50～80℃。
本发明通过上述方法提取获得黄水活性提取物后，还采用超高效液相色谱-质谱，用TargetLynx定量软件计算靶向数据峰面积，采用单点内标法对步骤B所得黄水活性提取物进行检测。
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述超高效液相色谱采用反相色谱。
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述超高效液相色谱采用梯度洗脱：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；洗脱程序如下：
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述高效液相色谱的色谱柱为UPLC HSST3柱；优选地，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm。
优选的，上述黄水活性提取物中，检测时，所述高效液相色谱的色谱柱得柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm。
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述高效液相色谱的柱温为30～50℃，流速为0.1～0.5mL/min，进样量为1～10uL。
优选的，上述黄水活性提取物中，检测时，所述高效液相色谱的柱温为50℃，流速为0.5mL/min，进样量为5uL。
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述质谱为串联四极杆质谱***，采用正模式检测。
其中，上述黄水活性提取物中，检测时，所述质谱的检测条件为：正离子离子源电压1.5kV、锥孔电压20V；去溶剂温度600℃，去溶剂气体流速1000L/h；锥孔气体流速10L/h。
基于上述黄水活性提取物，本发明还提供了一种药物组合物，其以前述黄水活性提取物为活性成分，添加药学上可接受的辅料，制备而成。
本发明还提供了上述黄水活性提取物、上述药物组合物在制备防治BV2神经细胞相关疾病的药物中的用途。
进一步的，上述黄水活性提取物、上述药物组合物可用于防治神经炎症、神经退行性疾病或神经病理性疼痛。
本发明的有益效果：
本发明将液液萃取、膜过滤等多种分离技术相结合，利用食品级乙醇等有机溶剂沉淀除去大分子的多糖和蛋白，再以超滤膜、纳滤膜分子截留方式，得到黄水中活性成份；经超高效液相色谱-质谱检测，黄水活性提取物中含有大量的氨基酸及小分子肽等氨基酸类衍生物，此类化合物具有多方面的生物活性。本发明提供黄水活性成份时，没有任何有毒有害化学试剂的参与，方法简便，安全性高。
本发明创造性地将黄水活性提取物在BV2神经细胞的治疗作用方面进行活性评估，以ATP(三磷酸腺苷)诱导体外神经疼痛模型，以细胞活力，P2X4、P2X7 mRNA表达作为活性评价指标，发现黄水活性提取物对BV2神经细胞有一定的治疗作用，为黄水在药用方面的价值提供了数据基础，提高了黄水的应用价值，扩大了黄水用途。
附图说明
图1为实施例1中23个氨基酸标准品和黄水活性提取物HC的TIC图；其中，左为标准品，右为黄水活性提取物HC。
图2为不同浓度HC样品组对细胞活力影响柱状图。
图3为实施例2中不同浓度HC样品组与ATP模型组的BV2细胞活力对比图。
图4为实施例2中HC样品的EC50计算图。
图5为实施例2中不同浓度HC样品的P2X4受体表达图。
图6为实施例2中不同浓度HC样品的P2X7受体表达图。
具体实施方式
本发明首先选用安全性高的有机溶剂(如食品级乙醇)，通过合适料液比，可以将黄水中的大分子多糖和蛋白通过沉淀除去，得到活性小分子部分；然后，采用分子截留方式以3000～10000Da规格超滤膜过滤除去黄水活性小分子部分高于10000Da分子量的组份，再以200～300Da规格纳滤膜过滤除去大量的水分子、乙醇及乳酸成份，从而得到黄水活性提取物的清液，再通过蒸馏方式回收除去乙醇，得到黄水活性提取物。
本发明利用高分辨的超高效液相色谱-串联四极杆质谱***对黄水活性提取物进行定性检测，确定其中的活性成份。
本发明将黄水活性提取物在BV2神经细胞的治疗作用方面进行活性评估。以ATP(三磷酸腺苷)诱导体外神经疼痛模型，以细胞活力，P2X4、P2X7 mRNA表达作为活性评价指标，首次考察验证了黄水活性提取物对BV2神经细胞具有治疗作用。
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明保护范围限制在所述的实施例范围之中。本发明实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1
(1)取五粮液的黄水10L，4℃静置冷藏24h，取上清液8L，加入30L95％的乙醇，混匀后于4℃静置冷藏24h，4000r/min，0～10℃低温离心除去沉淀，得清液36L。
(2)取清液，以3000Da规格的超滤膜循环过滤，除去清液中残留大分子组份，得滤液34L，滤液再经200Da规格纳滤膜过滤，除去其中的水份、乙醇和乳酸等小分子组份，得到提取液4L。将提取液50℃旋蒸浓缩移除溶剂，得到黄水活性提取物HC260g。
(3)样品前处理：
样品HC溶液配置：取HC 100mg，加900uL 50％甲醇作为母液。分别取母液稀释5倍，稀释10倍。取10μL稀释液，置于1.5mL离心管中，加入10μL水、5μL内标和40μL异丙醇(0.1％甲酸)，涡旋振荡20min。将离心管置于低温离心机中，4℃、12000rpm下离心10min。取上清液10μL，置于1.5mL离心管中，加入70μL硼酸缓冲盐，20μL AccQ Tag衍生试剂(美国Kairos氨基酸试剂盒)，立即振摇10s。1min后，过量衍生剂水解，衍生反应结束；将离心管置于55℃下加热10min；然后，加入400μL水稀释后待测。
标准品配制：采用梯度稀释法，依次配制浓度为400、200、100、40、20、10、4、2、1μmol/L的各氨基酸溶液，加入等体积同位素内标，混匀后待测。
采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱***进行检测。
(4)超高效液相色谱-串联四极杆质谱***检测条件：
采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色谱进行色谱分离，条件如下：
色谱柱：Waters UPLC HSS T3(1.8μm，2.1mm×150mm)；流动相：A相(水，0.1％甲酸)、B相(乙腈)，梯度洗脱程序见表1；流速：0.5mL/min；进样量：5.0μL；柱温：50℃。
采用Waters XEVO TQ-S串联四级杆质谱***进行质谱分析，条件如下：
正离子离子源电压1.5kV、锥孔电压20V；去溶剂温度600℃，去溶剂气体流速1000L/h；锥孔气体流速10L/h。
表1梯度洗脱程序
待测样品HC质谱定性检测结果见表2，HPLC色谱图和总离子流图见图1。
表2黄水活性提取物HC检测结果
实施例2：黄水活性提取物HC对ATP诱导BV2细胞的保护作用
体外培养小鼠小胶质细胞(BV2)，用ATP诱导体外神经疼痛模型。设空白对照组(NC)、模型对照组(MC)及HC给药组，以细胞活力、P2X4、P2X7 mRNA受体表达水平作为评价指标，探讨实施例1所得HC对各指标的影响。
引物序列P2X4-F如SEQ ID NO:1所示：GACCAACACTTCTCAGCTTGG；
P2X4-R如SEQ ID NO:2所示：GTGACGATCATGTTGGTCATG。
P2X7-F如SEQ ID NO:3所示：TTATGGCACCGTCAAGTGG；
P2X7-R如SEQ ID NO:4所示：TCTCCGTCACCTCTGCTATG。
(1)细胞培养：BV2细胞培养于含10％胎牛血清、1％抗生素(100U/ml青霉素和100lg/ml链霉素)的DMEM完全培养基中，再置于95％空气和5％CO2的37℃加湿培养箱进行孵育。
(2)药物毒性范围与药效检测：待BV2细胞长至对数期时，用0.25％胰酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，以1×105个/mL细胞接种于96孔板(每孔为0.2mL)中，置培养箱中继续培养。待细胞融合度达到80％左右时，分别单独给予黄水活性提取物HC 12.5、25、50、100、200、400μg·mL-1并设置空白对照组(NC)和模型对照组(MC，ATP 500μM)，HC给药组(在ATP造模同时加入12.5、25、50、100、200、400μg·mL-1的HC。孵育结束后用MTT法检测细胞活力(MTT Assay试剂盒(Cell Proliferation))。
结果见图2，HC在0～400μg·mL-1浓度下没有细胞毒性。图3可见，与MC模型组相比，HC各浓度组在ATP干预下对BV2细胞有一定的保护作用。图4可见，HC的半最大效应浓度EC50值为28.77μg·mL-1。Qrt-PCR法检测P2X4和P2X7受体mRNA的表达水平。如图5和图6所示，MC组的P2X4和P2X7受体mRNA的表达水平明显上调，12.5μg·mL-1浓度下的HC有效的逆转P2X4受体mRNA的表达水平上调(#P＜0.05)，50和200μg·mL-1浓度下的HC有效的逆转P2X7受体mRNA的表达水平上调(##P＜0.01)。当P2X4被激活时，BV2细胞中脑源性神经营养因子(BDNF)的释放增加，细胞内氯离子浓度升高，从而激活氨基丁酸和甘氨酸，导致脊髓背角过度兴奋，从而引发疼痛。当P2X4被激活时，激活NLRP3炎症小体释放促炎细胞因子和细胞内容物，导致炎症细胞死亡。HC能不同程度的改善这种情况。
(3)使用GraphPad Prism 8对实验数据进行处理，数据结果用平均值(mean)和标准差(S.D.)来表示。三组或三组以上数据之间的统计学比较采用单因素方差(ANOVA)分析。P<0.05时被认为具有统计学意义。
Claims (10)
1.黄水活性提取物，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
A、取黄水，经第一次静置冷藏，取上清液和有机溶剂混合均匀，再经第二次静置冷藏，然后离心除去沉淀，得清液；
B、取步骤A所得清液，先经超滤膜过滤，除去大分子，再经纳滤膜过滤，除去水分和有机试剂，得提取液，将提取液浓缩，即得黄水活性提取物。
2.根据权利要求1所述的黄水活性提取物，其特征在于：至少满足下列的一项：
步骤A中，所述黄水为浓香型白酒酿造过程中起糟滴窖时产生的黄色液态副产物；
步骤A中，所述有机溶剂为醇系有机溶剂；优选为食品级乙醇；
步骤A中，所述有机溶剂与黄水的体积比为3～4：1。
3.根据权利要求1所述的黄水活性提取物，其特征在于：至少满足下列的一项：
步骤A中，第一次静置冷藏的温度为0～10℃；
步骤A中，第一次静置冷藏的时间为24～48h；
步骤A中，第二次静置冷藏的温度为0～10℃；
步骤A中，第二次静置冷藏的时间为24～48h；
步骤A中，离心的温度为0～10℃；
步骤A中，离心的转速为4000～8000r/min。
4.根据权利要求1所述的黄水活性提取物，其特征在于：至少满足下列的一项：
步骤B中，所述超滤膜的截留分子量为3000～10000Da；
步骤B中，所述纳滤膜的截留分子量为200～300Da；
步骤B中，所述浓缩的温度为50～80℃。
5.根据权利要求1～4任一项所述的黄水活性提取物，其特征在于：采用超高效液相色谱-质谱对步骤B所得黄水活性提取物进行检测。
6.根据权利要求5所述的黄水活性提取物，其特征在于：至少满足下列的一项：
所述超高效液相色谱采用反相色谱；
所述超高效液相色谱采用梯度洗脱：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇或乙腈；洗脱程序如下：
；
所述超高效液相色谱的色谱柱为UPLC HSS T3柱；优选地，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm；
所述超高效液相色谱的柱温为30～50℃，流速为0.1～0.5mL/min，进样量为1～10uL；优选地，柱温为50℃，流速为0.5mL/min，进样量为5uL。
7.根据权利要求5所述的黄水活性提取物，其特征在于：至少满足下列的一项：
所述质谱为串联四极杆质谱***，采用正模式检测；
所述质谱的检测条件为：正离子离子源电压1.5kV、锥孔电压20V；去溶剂温度600℃，去溶剂气体流速1000L/h；锥孔气体流速10L/h。
8.药物组合物，其特征在于：以权利要求1～7任一项所述黄水活性提取物为活性成分，添加药学上可接受的辅料，制备而成。
9.权利要求1～7任一项所述的黄水活性提取物、权利要求8所述的药物组合物在制备防治BV2神经细胞相关疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述BV2神经细胞相关疾病为神经炎症、神经退行性疾病或神经病理性疼痛。
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