CN116284231A - 一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽技术领域，公开了一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用，为开发牡蛎蛋白资源，公开减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽制备方法和应用，所述牡蛎多肽为短肽或至少两种短肽的混合物；所述短肽为DIFMAWP、GSWSCDGCL、GPMGPRM、FSMPPQMFPY、AVLCFMYLMY、GPMMRGP、QMFPYMPN的混合物；所述牡蛎多肽经由牡蛎闭壳肌首先经胃蛋白酶酶解，再经胰蛋白酶、碱性蛋白酶双酶酶解，然后将其离心并过滤截留500～1500Da的分子；然后再经分离纯化组分进行冻干得到的多肽粉具有减脂效果。

Description

一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，具体涉及一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用。
背景技术
高脂血症是一种血液中脂质含量异常的慢性疾病，与脂肪肝、糖尿病及心血管疾病等的发生密切相关，对人类健康造成了极大威胁。近年的研究显示，多肽具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节和保护肝肾功能等功效。牡蛎隶属于软体动物双壳纲(Bivalvia)牡蛎科的一种贝壳类动物。牡蛎蛋白质含量丰富，并且蛋白是一种优质的水产蛋白。与牡蛎蛋白相比，牡蛎肽具有优良的理化特性：活性更高，在微量和低浓度的情况下，都能发挥其独特的生理作用；质量小易吸收、低渗透压等特点，且摄入牡蛎多肽不会导致腹泻。目前对于牡蛎肽闭壳肌蛋白水解肽应用于降脂功能的关注较少，本发明发掘了该部位经煮制后经胃蛋白酶消化，再经胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶二次消化后的水解多肽，对胰脂肪酶具有抑制活性，且对高脂饮食的小鼠具有降脂作用。
发明内容
为开发牡蛎蛋白资源，本发明的目的在于：提供了一种具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽及其制备方法和应用，即提供具有减脂功效的牡蛎多肽、以及含有牡蛎多肽的多肽粉；牡蛎多肽和多肽粉的纯化与制备方法；
本发明提供如下的技术方案：
具有减脂功效的牡蛎多肽，所述牡蛎多肽为短肽或至少两种短肽的混合物；
所述多肽为DIFMAWP、GSWSCDGCL、GPMGPRM、FSMPPQMFPY、AVLCFMYLMY、GPMMRGP、QMFPYMPN的混合物；
各短肽的氨基酸序列为：
DIFMAWP：Asp-Ile-Phe-Met-Ala-Trp-Pro；
GSWSCDGCL：Gly-Ser-Trp-Ser-Cys-Asp-Gly-Cys-Leu；
GPMGPRM：Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Arg-Met；
FSMPPQMFPY：Phe-Ser-Met-Pro-Pro-Gln-Met-Phe-Pro-Tyr；
AVLCFMYLMY：Ala-Val-Leu-Cys-Phe-Met-Tyr-Leu-Met-Tyr；
GPMMRGP：Gly-Pro-Met-Met-Arg-Gly-Pro；
QMFPYMPN：Gln-Met-Phe-Pro-Tyr-Met-Pro-Asn。
上述牡蛎多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牡蛎去壳后取闭壳肌组织后100℃加热5分钟；
(2)向牡蛎的匀浆液中先后加入胃蛋白酶在酸性条件下酶解后，再经胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶在碱性条件下酶解；
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液加入总体积为75％的乙醇溶液，在4℃下醇沉24h，然后离心处理取上清液；
(4)过滤步骤(3)所述的上清液，并截留分子量500～1500Da的分子；
(5)分离纯化凝胶柱层析：将上述截留酶解物溶于浓度为200mg/mL的多肽溶液，于4℃、10000r/min离心20min，上清液按照体积比1mL：25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中，用超纯水进行洗脱，采用214nm波长检测并绘制吸光度曲线，收集洗脱各组分后并冻干成粉状；
(6)根据对高血脂小鼠动物模型的口服减脂效果，确定步骤(5)中的组分2为最佳降脂作用的多肽组分。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中胃蛋白酶酶解时，保持匀浆液的pH值为1～3，酶解时间2～4小时，酶解温度35～38℃，胃蛋白酶加入量2～4％，胃蛋白酶的活力300～500U/mg。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中加入胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶酶解时，保持匀浆液的pH值为7.0～8.6，酶解时间1～2小时，酶解温度35～38℃，胰蛋白酶加入量1～3％，碱性蛋白酶添加量2～4％，胰蛋白酶的活力8000～12000U/g，碱性蛋白酶添活力30000～50000U/g。
包含上述牡蛎多肽的多肽粉。
进一步优选，上述多肽粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牡蛎去壳后取闭壳肌组织100℃加热5分钟；
(2)向牡蛎的匀浆液中先后加入胃蛋白酶在酸性条件下酶解后，再经胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶在碱性条件下酶解；
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液加入总体积为80％的乙醇溶液，在4℃下醇沉24h，然后离心处理取上清液；
(4)过滤步骤(3)所述的上清液，并截留分子量500～1500Da的分子；
(5)分离纯化凝胶柱层析：将上述截留酶解物溶于浓度为200mg/mL的多肽溶液，于4℃、10000r/min离心20min，上清液按照体积比1mL：25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中，用超纯水进行洗脱，采用214nm波长检测并绘制吸光度曲线，收集洗脱各组分后并冻干成粉状；
(6)根据对高血脂小鼠动物模型的口服减脂效果，确定步骤(5)中的组分2为最佳降脂作用的多肽组分。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中胃蛋白酶酶解时，保持匀浆液的pH值为1～3，酶解时间2～4小时，酶解温度35～38℃、，胃蛋白酶加入量2～4％，胃蛋白酶的活力300～500U/mg。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中加入胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶酶解时，保持匀浆液的pH值为7.0～8.6，酶解时间1～2小时，酶解温度35～38℃，胰蛋白酶加入量1～3％，碱性蛋白酶添加量2～4％，胰蛋白酶的活力8000～12000U/g，碱性蛋白酶添活力30000～50000U/g。
上述牡蛎多肽或者多肽粉在制备减脂功效口服液上的应用。
本发明的有益效果如下：
一、本发明经水解、超滤、分离纯化后得到的多肽组分的序列明确，分子量较小，易于利用吸收；
二、本发明制备的多肽粉可有效降低高脂小鼠血清中总甘油三酯和总胆固醇含量。
附图说明
图1为牡蛎多肽结构式；
图2为牡蛎多肽凝胶层析分离图谱；
图3为小鼠血液总TC含量；
图4为小鼠血液总TG含量。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
具有减脂功效的牡蛎多肽，经以下过程制成：
(1)将牡蛎去壳后取闭壳肌组织后100℃加热5分钟；
(2)向牡蛎的匀浆液中先后加入胃蛋白酶在酸性条件下酶解后，再经胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶在碱性条件下酶解；
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液加入总体积为80％的乙醇溶液，在4℃下醇沉15h，然后离心处理取上清液；
(4)过滤步骤(3)所述的上清液，并截留分子量1000Da的多肽；
(5)分离纯化凝胶柱层析：将上述截留酶解物溶于浓度为200mg/mL的多肽溶液(多肽浓度为200mg/mL)，于4℃、10000r/min离心20min，上清液按照体积比1mL：25mL加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中，用超纯水进行洗脱，采用214nm波长检测并绘制吸光度曲线(如图2)，收集洗脱各组分后并冻干成粉状；
如图2所示，表明经凝胶层析分离后，牡蛎闭壳肌多肽可在214nm波长下分离出三个组分，分别出峰时间为2min，6.5min和9min。
(6)根据对高血脂小鼠动物模型的口服减脂效果，确定步骤(5)中的组分2为最佳降脂作用的多肽组分。
(7)将效果最佳的组分2中的牡蛎多肽，采用UPLC-MS鉴定其多肽序列分别为分：AEELGIQ、GANSIEL、VTHCNVK、TSGFSDSGY、WTGFSFM、KHSVITG、EVDDAGG、LDVSWASD、FCENVCPY、TAGSTTCLD、DNMSIMV。具体结构式如图1所示。
步骤(2)中胃蛋白酶酶解时，保持匀浆液的pH值为1～3，酶解时间2～4小时，酶解温度30℃，胃蛋白酶加入量2.5％，胃蛋白酶的活力300U/mg；步骤(2)中加入胰蛋白酶酶解时，保持匀浆液的pH值为7.8，酶解时间1～2小时，酶解温度37℃，胰蛋白酶加入量2.5％，胰蛋白酶的活力10000U/mg，碱性蛋白酶添活力40000U/g。
多肽序列鉴定方法
(1)液相条件
仪器为超高效液相色谱仪,色谱柱规格为C18色谱柱,流动相A液为含有0.1甲酸的双蒸水,流动相B液为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，流速为0.5mL/min，温度为40℃，梯度条件为0～2.5min保持99％A液，1％B液；2.5～5min，B液从1％上升至5％，A液从99％下调至95％；5～10min，B液从5％上升至10％，A液从95％下调至90％；10～30min，B液从10％上升至25％，A液从90％下调至75％；31～35min，B液从25％上升至40％，A液从75％下调至60％；36～40min。
(2)质谱条件
质谱仪为Thermo QE Orbitrap。离子方式为ESI+，质量范围为50～2000m/z；毛细管电压(Capillary)为3.0kV；采样锥为35.0V；离子源温度为105℃；去溶剂温度为350℃；锥孔气流量为50.0L/h；去溶剂气流为：600.0L/Hr；碰撞能量：6.0e V；碰撞气流：0.6m L/min；扫描时间：0.26sec；内扫描时间：0.02sec。
肽的减脂功效测试
多肽对小鼠的减脂效果
模型小鼠实验方法
雄性SPF级C57BL6/J小鼠60只，空白组采用普通饲料饲养，采用纯水灌胃干预；模型组采用商用的高脂饲料饲养，采用纯水灌胃干预，阳性对照组采用商用的高脂饲料饲养，并采用辛伐他汀阳性药物(20mg/kg/d)灌胃，实施例组采用商用的高脂饲料饲养，并使用本发明方法制备的多肽(100mg/kg/d)灌胃干预。将小鼠适应性喂养两周后，按体重质量随机分为4组，每组8只，连续喂养16周。期间，每天按体重等体积灌胃，每周记录小鼠的摄食量。
第16周最后一次喂食后，禁食12h，称量体重，采用心脏取血，断颈处死。收集肝组织、血液样品1500g离心15min，取血清-80℃保存。
检测指标：①测定心脏指数与肝脏指数(心脏、肝脏重量与体重的比值)
②按照南京建成试剂盒说明书进行血清中甘油三酯TC、总胆固醇TG含量测定
表1小鼠心脏指数与肝脏指数
Figure BDA0004020060100000051
Figure BDA0004020060100000061
如图3所示，表明经凝胶层析分离后得到的组分2，可有效降低肥胖小鼠血液中总胆固醇含量。
如图4所示，表明经凝胶层析分离后得到的组分2，可有效降低肥胖小鼠血液中的总甘油三酯含量，综上经该方法制备得到的牡蛎闭壳肌多肽粉的分离纯化组分，即DIFMAWP、GSWSCDGCL、GPMGPRM、FSMPPQMFPY、AVLCFMYLMY、GPMMRGP、QMFPYMPN多肽混合物，可有效降低肥胖小鼠血脂水平。

Claims (7)

1.具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽，其特征在于，所述具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽为短肽或至少两种短肽的混合物；
所述短肽为DIFMAWP、GSWSCDGCL、GPMGPRM、FSMPPQMFPY、AVLCFMYLMY、GPMMRGP、QMFPYMPN；
各短肽的氨基酸序列为：
DIFMAWP：Asp-Ile-Phe-Met-Ala-Trp-Pro；
GSWSCDGCL：Gly-Ser-Trp-Ser-Cys-Asp-Gly-Cys-Leu；
GPMGPRM：Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Arg-Met；
FSMPPQMFPY：Phe-Ser-Met-Pro-Pro-Gln-Met-Phe-Pro-Tyr；
AVLCFMYLMY：Ala-Val-Leu-Cys-Phe-Met-Tyr-Leu-Met-Tyr；
GPMMRGP：Gly-Pro-Met-Met-Arg-Gly-Pro；
QMFPYMPN：Gln-Met-Phe-Pro-Tyr-Met-Pro-Asn。
2.如权利要求1所述的具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将牡蛎去壳后取闭壳肌组织后加热混匀，得到牡蛎的匀浆液；
(2)向牡蛎的匀浆液中先后加入胃蛋白酶在酸性条件下酶解后，再经胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶在碱性条件下酶解，得到酶解液；
(3)将步骤(2)酶解后的酶解液加入乙醇，醇沉，然后离心处理取上清液；
(4)过滤步骤(3)所述的上清液，并截留分子量500～1500Da的分子；
(5)分离纯化凝胶柱层析：将上述截留酶解物溶于多肽溶液，离心，上清液加入到葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱中，洗脱，收集洗脱各组分后即为短肽为DIFMAWP、GSWSCDGCL、GPMGPRM、FSMPPQMFPY、AVLCFMYLMY、GPMMRGP、QMFPYMPN。
3.如权利要求2所的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，胃蛋白酶酶解时，保持匀浆液的pH值为2.5～3.5，酶解时间3～5小时，酶解温度30～37℃。
4.如权利要求2所的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶酶解时，保持匀浆液的pH值为7.0～8.6，酶解时间1～2小时，酶解温度35～38℃。
5.如权利要求2所的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，醇沉的条件为：在2～6℃下醇沉12-18h。
6.如权利要求2所的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，于2～6℃、8000～12000r/min离心20～30min。
7.如权利要求1所述的具有减脂功效的牡蛎闭壳肌多肽在制备减脂功效口服液中的应用。
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