CN113030298A - 检测人体血浆中儿茶酚胺类物质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测血清样本中儿茶酚胺类物质含量的方法，其包括(1)配制内标溶液；(2)衍生化和蛋白沉降；(3)固液萃取；(4)上机检测。本发明的方法明显拥有需要样本量更少、操作简便、操作容错率较高、结果稳定等优点。

Description

检测人体血浆中儿茶酚胺类物质含量的方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，主要涉及一种检测人体血浆中儿茶酚胺类物质含量的方法。

背景技术

嗜铬细胞瘤、副神经节瘤在临床诊断中容易被忽视，该病的发病率虽然比较低，但是我国的人群基数非常大，所以有大量的患者被误诊或漏诊。不过近年来，临床上越来越重视检测儿茶酚胺类物质对嗜铬细胞瘤、副神经节瘤患者的必要性，所以更多的患者被发现，所以需要一个可以以较高的通量去满足临床的检测需求，同时儿茶酚胺类物质在血浆中稳定性极差，所以需要一个快速稳定的检测方法。

现阶段检测儿茶酚胺类物质的方法主要有荧光法、高效液相色谱法、毛细管电泳、放射酶免疫法、化学发光法等。其中荧光法所需的设备比较便宜，操作人员的技术门槛较低，也不会产生放射性危害，所以整个检测过程中的运行成本比较低，在实际推广中有一定的优势。但是其试剂准备比较繁琐，影响因素(pH值、温度以及荧光剂的种类选择)比较多，所以结果的重现性以及稳定性欠佳，这些缺点导致其在临床检验中推广的并不是特别好。而放射酶免疫法与化学发光法并没有太多的文献进行介绍，并不是一些主流的检测方法，在此就不做太多的讨论。而现在检测儿茶酚胺类物质最主流的技术是高效液相色谱法，按照检测器的不同还有一些其他的方法，例如高效液相-电化学检测法，由于电化学检测器相比较紫外检测器的灵敏度更高，所以更广泛得被选择。但是液相的前处理相对更加复杂，检测时间较长，而且人体基质复杂，干扰物非常多，所以液相方法局限性很大，在高通量为需求的临床检测中就会遇到困难。高效液相-电化学检测法的前处理根据文献描述来看，检测儿茶酚胺类物质大多数均采用氧化铝粉末提取，一般调整的参数为氧化铝粉末的用量、以及洗脱溶液的种类等方面，但是这个方法的前处理困难程度以及麻烦程度并不会改善。针对上述各个方法的不足之处，高效液相串联质谱法可以提供很好的解决办法。

随着高效液相串联质谱检测法进入临床检测领域，优势也是越来越明显，它具有高灵敏度、检测时间短、样本用量小以及特异性高的优势，特别适合高通量临床检验的要求。由于质谱检测器的本身的特性就有高度的选择性，所以在样本前处理中相较于高效液相-电化学检测器可以简单很多。在国内外众多文献中记载，使用高效液相串联质谱法检测的前处理基本采用的是固相萃取法提取人体血浆当中的儿茶酚胺类物质，再对物质进行纯化以及浓缩，得到的样本后可以在高效液相串联质谱仪上进行检测。

固相萃取法的操作步骤主要由以下几步：

1、使用缓冲盐调节样本的pH值，使样本的pH值在适当的范围。

2、使用有机溶剂、水活化固相萃取小柱。

3、将调节好pH值的样本加入到固相萃取小柱中，通过用惰性气体加压的方式让样本通过固相萃取小柱。此时，所需检测的儿茶酚胺类物质会结合在固相萃取小柱中。

4、使用淋洗液淋洗固相萃取小柱，使样本中的一些蛋白、盐分冲洗掉。

5、使用洗脱液冲洗固相萃取小柱，使结合在固相萃取小柱中的儿茶酚胺类物质再还原出来，并被洗脱下来。

这样就得到了经过分离、纯化与浓缩的样本，可以在高效液相串联质谱上进行检测，目前使用最为广泛得前处理即是固相萃取法。但是这个方法的限制因素为萃取以及洗脱步骤中的效率。根据实验结果表明，采用固相萃取法可以获得高浓度的样本，但是在回收率的计算中可以发现该方法的回收率并不高，甚至是很低的。关乎回收率的计算中，萃取和洗脱的环节最为密切，萃取效率和洗脱效率直接制约着这个前处理方法的使用前景，目前也只能在较高灵敏度的液相串联质谱平台上开展儿茶酚胺的检测，这也极大提高了儿茶酚胺物质检测的成本。而且该方法的处理时间比较长，儿茶酚胺类物质稳定性较差，在较长时间的操作下极易分解，导致最后样本中浓度较低，对检测也产生较大的影响。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，本发明旨在用高效液相串联质谱技术快速、方便以及稳定的检测人体血浆中儿茶酚胺类物质(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3-甲氧酪胺)。为了实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明一方面涉及一种检测人体血浆中儿茶酚胺类物质含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)配制内标溶液：采用同位素氘内标的待测儿茶酚胺类物质用甲酸水配置成内标液；

(2)衍生化和蛋白沉降：在标准曲线工作液和待测血浆样本中都加入内标溶液，加入衍生化试剂孵育进行衍生化和蛋白沉降，离心取上清液；

(3)固液萃取：将上清液分别加入到固液萃取板上，萃取板中的填料与加入的样本结合后加入洗脱液进行洗脱得到待测样品；

(4)上机检测：将洗脱得到的待测样品吹干，再使用乙腈水溶液复溶得到待检测液，采用高效液相色谱串联质谱***对待检测液进行检测；

其中，衍生化试剂为丹磺酰氯的乙腈溶液。

本发明通过使用丹磺酰氯的乙腈溶液，在对儿茶酚胺物质提取前能够同时实现沉淀蛋白和衍生化的操作。因为样本的基质为人体血浆，成分复杂，含有各类脂质等，而儿茶酚胺类物质为小分子化合物。所以可以先将蛋白质等大分子杂质采用蛋白沉淀的方法除去，而后再进行衍生化的操作，让衍生化反应中的杂质减少，这样对于衍生化的效率是有利的。另外，本发明在分离浓缩纯化的环节并未采用固相萃取法，而采用了固液萃取方式。固液萃取的原理是将通过其填料的大分子物质、蛋白质以物理吸附的方式吸附在填料中，再使用相似极性的洗脱液进行洗脱，利用相似相溶的原理将所需的化合物洗脱下来，最后对洗脱液进行吹干复溶，达到浓缩的目的。固相萃取法的弊端在于整个萃取过程时间较长、萃取的回收率较低。而采用固液萃取法后萃取的时间大大缩短，操作十分简便，对于操作人员的要求也相应的降低了。

在本发明的一个优选实施方式中，所述儿茶酚胺类物质选自去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素和3-甲氧酪胺中的1种、2 种、3种、4种、5种或6种。

在本发明的一个优选实施方式中，所述同位素氘内标的待测儿茶酚胺类物质选自去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D3、多巴胺-D4、甲氧基去甲肾上腺素-D3、甲氧基肾上腺素-D3和3-甲氧酪胺-D4中的1种、2种、3种、4种、5种或6种。

在本发明的一个优选实施方式中，所述标准曲线工作液和待测血浆样本中都加入样本保存液，所述保存液为磷酸水溶液。优选地，所述磷酸水溶液的浓度为 0.5-2mol/L。本发明中在标准曲线工作液和待测血浆样本中均添加了样本保存液，该保存液的作用为减缓儿茶酚胺类物质的降解、尤其是去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺这3样物质，具体数据见表1(用量：样本与保存液体积比9:1)。在传统方法中，由于未添加保存液的原因，儿茶酚胺类物质会在几个小时中降解，在检测时又必须经过固相萃取等长时间的操作，可以检测的浓度已非常低、并且并不能准确的反映出临床患者的情况。绝大多数情况下，使用传统固相萃取的方法一般都只会检测甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3甲氧酪胺。本发明也为去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺提供了稳定、快速、有效的检测方法。

表1、保存液对标准曲线与质控品的稳定作用考察

从表中可以看出，在添加保存液后去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的稳定性有明显改善，-20℃保存5天后浓度没有变化，峰面积基本没有变化，但是再未添加保存液的情况下，去甲肾上腺素与多巴胺的浓度有明显降低的情况，峰面积明显减小，而且肾上腺素也有一定程度的减小。所以添加保存液对标曲与样本中儿茶酚胺物质的稳定性起到一定的保护作用。

在本发明的一个优选实施方式中，在加入衍生化试剂孵育的过程中加入碱性pH调节液。本发明的碱性pH调节剂用于调节衍生化时整个体系内的pH环境。衍生化反应过程中会产生盐酸，使得整个体系呈一个酸性环节，而pH调节液则可以将盐酸消耗，使得整个反应继续完全，达到提高衍生化效率的目的。

在本发明的一个优选实施方式中，加入衍生化试剂孵育是在40-60℃条件下进行。本发明通过控制孵育温度，有助于提供衍生化反应所需的温度又避免对样品产生不良影响。

在本发明的一个优选实施方式中，所述洗脱液为二氯甲烷。本发明发现在洗脱溶剂中二氯甲烷拥有最好的洗脱效果。据推测，是由于二氯甲烷的极性与衍生化产物的极性相似，可以将物理吸附在固液萃取板中的衍生产物洗脱下来，达到洗脱的目的。

在本发明的一个优选实施方式中，所述高效液相的液相条件：

(1)色谱柱：Kinetex 2.6um F5 100A，100*3.0mm，柱温40℃

(2)流动相：A：2mmol/L氟化铵-0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈

(3)洗脱梯度见表2：

表2：液相色谱洗脱梯度表

时间(min)	流速(mL/min)	A.Conc(％)	B.Conc(％)
				0	0.6	80	20
1	0.6	80	20
				1.5	0.6	30	70
3.9	0.6	10	90
				5	0.6	10	90
5.05	0.6	80	20
				5.5	0.6	stop

在本发明的一个优选实施方式中，所述质谱采用多反应检测模式，利用三重四级杆只有中的多反应检测模式特异性的检测儿茶酚胺衍生产物。本发明配合高效液相串联质谱中的三重四级杆质谱的高特异性与高选择性：三重四级杆质谱的多反应监测功能在于对一个检测的化合物的母离子在第一级四级杆中就进行选择，也就是除了设置的儿茶酚胺类物质，其他的杂质分子在通过第一级四级杆时已经被筛除；接着所需的母离子进入第二级四级杆进行碰撞，碰撞时所采用的为化学性质较为稳定的氮气，与母离子碰撞出特定得碎片离子；再第三级四级杆中，仪器将会对碎片离子再一次进行选择，来提高母离子特异性；所以在这样的工作原理下，质谱仪就赋予了这项检测极高的特异性和敏感度。

对于本发明的检测方法而言，其可以是诊断目的的，也可以是非诊断目的的。

在本发明的另一方面，还涉及一种用于血浆样本的儿茶酚胺类物质衍生化试剂，所述衍生化试剂为丹磺酰氯的乙腈溶液。

本发明突破传统方法的思维，采用了沉淀蛋白，衍生化以及固液萃取这三项操作，这其中沉淀蛋白即可以消除大分子蛋白质，减轻检测中所产生的的基质干扰，也提供给衍生化反应一个相对纯净的反应体系，还有最重要的一步即为固液萃取，相比较传统的固相萃取，不仅大大的缩短了前处理操作时间，更提高了提取效率，让整个前处理过程更为高效简洁。

特别是，本发明采用衍生化这个方法提高了儿茶酚胺物质在用液相串联质谱时的响应，从而解决了固相萃取方法回收率低的问题。在使用高效液相串联质谱检测中，化合物的离子化效率是影响物质响应的一个重要因素，儿茶酚胺物质的离子化效率低而且人体血浆中浓度也是比较低，所以使用固相萃取法浓缩纯化后可以在较高灵敏度的仪器上进行检测，本发明根据儿茶酚胺物质共有的官能团进行衍生化操作，使其成为一个离子化效率比较高的物质，再采用固液萃取的操作对这个物质进行分离、浓缩和纯化，使得在检测时响应大幅度的提升，从而对于仪器灵敏度的要求可以降低，在临床推广上也降低了门槛。而针对固相萃取法操作时间长，儿茶酚胺物质容易降解的问题，使用衍生化的方法也能解决。在衍生化反应完成后，衍生化产物相比于儿茶酚胺原型物质的稳定性要好的多，所以在操作过程中不会发生降解，最终样本中待测物的浓度水平也会保持比较高的水平。

终上所述，在临床检测的大量操作下，本发明的方法明显拥有需要样本量更少、操作简便、操作容错率较高、结果稳定、适用质谱仪器更广泛等优点。

附图说明

图1：去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的色谱图；

图2：甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3甲氧酪胺的色谱图。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明作进一步说明，以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1：

1、标准品配制：采购去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素、3-甲氧酪胺标准品以及其氘代物作为内标物质。用含硫代硫酸钠的盐酸水溶液溶解各个固体标准品以及内标物质，溶液标准品与内标物质可直接稀释使用。标准品配制成浓度为10mg/ml的溶液，内标物质配制成为1mg/ml的溶液，保存于-80℃冰箱备用。随后用含0.1％甲酸水稀释各个标准品以及内标溶液，按表3 的浓度配制标准曲线工作液。

表3：配制标准曲线工作液

pg/mL	STD1	STD2	STD3	STD4	STD5	STD6	STD7
								去甲肾上腺素	50	100	250	500	1250	2500	5000
肾上腺素	20	40	100	200	500	1000	2000
								多巴胺	10	20	50	100	250	500	1000
甲氧基去甲肾上腺素	20	40	100	200	500	1000	2000
								甲氧基肾上腺素	10	20	50	100	250	500	1000
3-甲氧酪胺	10	20	50	100	250	500	1000

2、取2mL离心管，标记SD1至SD7，以及样本若干，标记Sample1至Sample7，向各个离心管中加入20μL内标溶液，再加入200μL标准曲线工作液或者待测样本血浆(保存液中保存)，最后加入400μL衍生化试剂(5mg/ml丹磺酰氯的乙腈溶液)，涡旋混匀30秒。

3、各个离心管中加入200μl pH调节液(饱和碳酸氢钠溶液与2mol/L氢氧化钠溶液体积比7:3混合溶液)，将pH值调整到10左右，涡旋混匀10分钟，放入50℃烘箱中孵育15分钟。

4、待孵育完成后，将各个离心管放入离心机中，14000转/分钟的速度离心10 分钟。

5、取一块固液萃取板，再使用一块2ml规格的96孔板置于下方作为接收板，将离心完的样本吸取500μl上清溶液按顺序加入固液萃取板中，等待10分钟，让萃取板中的填料与加入的样本充分的结合。

6、使用移液器往固液萃取板中的每个样本孔位加入500μl二氯甲烷，待其流干后再加500μl，总共加3次(共计1500μl二氯甲烷)。等待洗脱完成后，洗脱液均收集于下方的接收板。

7、将接收板中的液体使用96孔氮吹仪50℃氮气吹干，再使用100μl的50％乙腈水溶液复溶

8、将复溶液转移至96孔上样板中，上机检测。

9、高效液相串联质谱仪的液相条件：

(1)色谱柱：Kinetex 2.6um F5 100A，100*3.0mm，柱温40℃

(2)流动相：A：2mmol/L氟化铵-0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈

(3)洗脱梯度：

表4：液相色谱洗脱梯度表

时间(min)	流速(ml/min)	A.Conc(％)	B.Conc(％)
				0	0.6	80	20
1	0.6	80	20
				1.5	0.6	30	70
3.9	0.6	10	90
				5	0.6	10	90
5.05	0.6	80	20
				5.5	0.6	stop

(4)质谱采用多反应检测模式：色谱上分离6种儿茶酚胺衍生产物后进入到 ABSCIEX TRIPLE QUAD 4500MD质谱中进行检测，利用三重四级杆多反应检测模式特异性的检测6种儿茶酚胺衍生产物，根据不同的洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数，质谱的参数如下：

碰撞气：25psi

反吹气：6psi

离子源电压：5500V

离子源温度：550℃

雾化气：55psi

加热气：55psi

多反应监测参数见下表5：

表5、多反应监测参数

检测结果谱图如图1和图2所示。从结果中可以看出：去甲肾上腺素保留时间为2.83min，肾上腺素3.49min，多巴胺3.55min，甲氧基去甲肾上腺素2.85min，甲氧基肾上腺素3min，3甲氧酪胺3.07min，各个化合物分离度完整，出峰周围未有明显干扰峰、响应良好，信噪比完全达到要求(定义信噪比＞3，定量信噪比＞10)。对于方法也进行了性能验证，各指标总结如下：

(1)准确度和批内精密度：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3甲氧酪胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素：偏倚(Bias％)在-15％～15％，变异系数(CV％) ＜15％；批间精密度Between Precision：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3 甲氧酪胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素：变异系数(CV％)＜15％；符合批间精密度(CV％)＜15％，因此批间精密度的验证通过。

(2)最低检出限：甲氧基肾上腺素：最低检出限是10pg/mL，偏倚(Bias％) 为-2.14％，变异系数(CV％)为8.44％；甲氧基去甲肾上腺素：最低检出限是20pg/mL，偏倚(Bias％)为-5.13％，变异系数(CV％)为8.16％；多巴胺：最低检出限是10pg/mL，偏倚(Bias％)为-4.88％，变异系数(CV％)为7.84％；3甲氧基酪胺：最低检出限是10pg/mL，偏倚(Bias％)为-4.66％，变异系数(CV％)为6.96％；肾上腺素：最低检出限是20pg/mL，偏倚(Bias％)为-1.19％，变异系数(CV％)为10.35％；去甲肾上腺素：最低检出限是50pg/mL，偏倚(Bias％)为2.41％，变异系数(CV％) 为14.73％；均符合最低检出限中Bias％＜20％及CV％＜20％，因此最低检出限的验证通过。

(3)线性：甲氧基肾上腺素：线性范围为10-1000pg/mL，相关系数R2为0.9992，SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；线性均符合要求。

甲氧基去甲肾上腺素：线性范围为20-2000pg/mL，相关系数R2为0.9982， SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；线性均符合要求。

3甲氧酪胺：线性范围为10-1000pg/mL，相关系数R2为0.9996，SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；多巴胺：线性范围为10-1000pg/mL，相关系数R2为0.9993， SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；肾上腺素：线性范围为20-2000pg/mL，相关系数R²为0.9995，SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；去甲肾上腺素：线性范围为50-5000pg/mL，相关系数R2为0.9995，SD1-SD7的偏倚(Bias％)均＜15％；线性均符合要求。

(4)携带污染：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3甲氧酪胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素：carryover样本峰面积响应＜25％LLMI；因此携带污染可忽略。

(5)稳定性数据：

注：Y表示稳定，N表示不稳定

上述实验结果表明该方法检测结果准确、重复性、稳定性良好。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (10)

1.一种检测人体血浆中儿茶酚胺类物质含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)配制内标溶液：采用同位素氘内标的待测儿茶酚胺类物质用甲酸水配置成内标液；

(2)衍生化和蛋白沉降：在标准曲线工作液和待测血浆样本中都加入内标溶液，加入衍生化试剂孵育进行衍生化和蛋白沉降，离心取上清液；

(3)固液萃取：将上清液分别加入到固液萃取板上，萃取板中的填料与加入的样本结合后加入洗脱液进行洗脱得到待测样品；

(4)上机检测：将洗脱得到的待测样品吹干，再使用乙腈水溶液复溶得到待检测液，采用高效液相色谱串联质谱***对待检测液进行检测；

其中，衍生化试剂为丹磺酰氯的乙腈溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，所述儿茶酚胺类物质选自去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素和3-甲氧酪胺中的1种、2种、3种、4种、5种或6种。

3.根据权利要求2所述的方法，所述同位素氘内标的待测儿茶酚胺类物质选自去甲肾上腺素-D6、肾上腺素-D3、多巴胺-D4、甲氧基去甲肾上腺素-D3、甲氧基肾上腺素-D3和3-甲氧酪胺-D4中的1种、2种、3种、4种、5种或6种。

4.根据权利要求1所述的方法，所述标准曲线工作液和待测血浆样本中都加入样本保存液，所述样本保存液为磷酸水溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，在加入衍生化试剂孵育的过程中加入碱性pH调节液。

6.根据权利要求1所述的方法，加入衍生化试剂孵育是在40-60℃条件下进行。本发明通过控制孵育温度，有助于提供衍生化反应所需的温度又避免对样品产生不良影响。

7.根据权利要求1所述的方法，所述洗脱液为二氯甲烷。

8.根据权利要求1所述的方法，所述高效液相的液相条件：

(1)色谱柱：Kinetex 2.6μm F5,100A，100*3.0mm，柱温40℃

(2)流动相：A：2mmol/L氟化铵-0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈

(3)洗脱梯度：

时间(min) 流速(ml/min) A.Conc(％) B.Conc(％) 0 0.6 80 20 1 0.6 80 20 1.5 0.6 30 70 3.9 0.6 10 90 5 0.6 10 90 5.05 0.6 80 20 5.5 0.6 stop

。

9.根据权利要求1所述的方法，所述质谱采用多反应检测模式，利用三重四级杆只有中的多反应检测模式特异性的检测儿茶酚胺衍生产物。

10.一种用于血浆样本的儿茶酚胺类物质衍生化试剂，所述衍生化试剂为丹磺酰氯的乙腈溶液。

Images