CN108414643B

CN108414643B - 一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法

Info

Publication number: CN108414643B
Application number: CN201810321458.5A
Authority: CN
Inventors: 葛庆联; 高玉时; 唐修君; 樊艳凤; 马丽娜; 刘茵茵; 陆俊贤; 唐梦君; 陈大伟; 贾晓旭; 顾荣; 张小燕; 张静; 蒲俊华
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2018-04-11
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2038-04-11
Also published as: CN108414643A

Abstract

本发明涉及一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱‑三重四级杆质谱检测方法。按照以下方式进行：提取：称取冷鲜鸡胸脯肉，置于离心管中，加入提取液乙腈+甲醇，涡旋混匀，离心移取上清液供净化；净化：MCX固相萃取柱活化后，将上清转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，经甲酸水溶液和甲醇淋洗后，抽干，用氨水甲醇洗脱；洗脱液经吹干，用初始流动相溶解，过滤膜，供HPLC‑MS/MS测定。本发明建立了HPLC‑MS/MS法对冷鲜鸡中6种生物胺同时快速检测的方法，此方法可在5min内完成6种化学物质同时分析，检测时间短、线性关系较好、方法回收率高、稳定性良好，满足分析要求。

Description

一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法，属于化合物检测技术领域。

背景技术

生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量化合物。大多数食品中都含有生物胺，这些生物胺主要由微生物氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧而生成。适量生物胺摄入能促进生长、增强代谢活力、免疫力和清除自由基等，但是过量摄入生物胺则会引起头疼、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应。其潜在的毒性作用和对食品新鲜度的指示作用已引起了大量研究者的关注。

冷鲜鸡是指将检验检疫合格，屠宰后的鸡胴体进行冷却处理，并在1小时内使体内温度降至0℃～4℃，然后分割、修整、包装，并在后续的加工、流通和零售环节中始终保持在此温度范围内，保质期在7天内的整鸡或分割鸡肉。由于冷鲜鸡在加工、贮藏、运输和销售过程中极易受到微生物的污染，导致腐败变质，可能产生高浓度的生物胺。因此，监控冷鲜鸡中生物胺的变化尤其重要。

目前，生物胺的检测方法主要有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）等。其中液相色谱法是测定食品中生物胺含量主要方法，但该方法需要进行柱前或柱后衍生，操作步骤繁琐、耗时耗力，且衍生程度也难以保证，同时衍生反应还可能生成非目标衍生物，这些都会对生物胺的准确测定产生影响。相较于其他的检测方法，TLC法具有设备简单、操作简便、分离速度快、价格低廉等优势，能够有效降低测定生物胺的检测成本，但该方法的重现性和精密度较差，相比现代分析仪器，灵敏度也是一大缺陷。GC法具有分离效率高、分析速度快、选择性好等优点，但由于采用该法测定生物胺时同样需要衍生化处理、费时费力，且部分生物胺在高温下不稳定。而液相色谱串联质谱法，将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度结合起来，且不需要衍生化处理，同时具有可提供相对分子质量与结构信息的优点，为冷鲜鸡中多种生物胺的同时定性和定量分析提供了有效便利的分析方法。

发明内容

本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种方法简单、能实现快速检测的一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法。

为此本发明采用的技术方案是：一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法，其特征在于，按照以下方式进行：

提取：称取冷鲜鸡胸脯肉，置于离心管中，加入提取液乙腈+甲醇，涡旋混匀，离心移取上清液供净化；

净化：MCX固相萃取柱活化后，将上清转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，经甲酸水溶液和甲醇淋洗后，抽干，用氨水甲醇洗脱；洗脱液经吹干，用初始流动相溶解，过滤膜，供HPLC -MS/MS 测定。

净化步骤中，还可采用WCX柱。

色谱条件为：

流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：2uL；色谱柱：Sepx BR-C18（2.1×150mm，3μm）。

质谱条件为：

扫描方式：电喷雾正离子扫描（ESI+）；检测反应：多反应监测（MRM）；离子源温度：350 ℃；电喷雾电压：3500 V；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：10Arb；碰撞气：氩气。

流动相洗脱程序如下：

时间	0.1%甲酸水溶液(A)	乙腈(B)
			0	90	10
2	50	50
			2.1	90	10
4	90	10

定量和定性离子对、碰撞能量：

化合物	定性离子对（m/z）	定量离子对（m/z）	碰撞气能量/eV	保留时间/min
					腐胺Put	30.56/88.96	72.25/88.96	20/6	1.17
尸胺Cad	69.26/103.01	86.17/103.01	14/6	1.18
					组胺His	68.25/111.89	95.12/111.89	19/11	1.18
酪胺Tyr	91.27/137.92	121.05/137.92	21/6	1.72
					精胺Spm	84.19/202.71	112.13/202.71	28/16	1.09
亚精胺Spd	72.22/145.95	112.14/145.95	14/12	1.09

用如下的标准溶液：

6种生物胺标准储备液：分别称取6种生物胺标准品适量（精确到0.1mg）于10mL的棕色容量瓶中，用适量0.1%甲酸定容，配制成1mg/mL储备液，于4℃避光保存，保质期6个月；

所述6种生物胺分别为腐胺（Put，C₄H₁₂N₂）标准品，尸胺（Cad，C₅H₁₄N₂）标准品，组胺（His，C₅H₉N₃）标准品，酪胺（Tyr，C₈H₁₁NO）标准品，精胺（Spm，C₁₀H₂₆N₄）标准品，亚精胺（Spd，C₇H₁₉N₃）标准品。

将所述混合标准储备液用0.1%甲酸分别稀释成5、10、20、50、100、200、500ng/mL的混合标准工作曲线，以各特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

本发明的优点是：本试验建立了HPLC-MS/MS法对冷鲜鸡中6种生物胺同时快速检测的方法。利用液相色谱-三重四极杆质谱联用技术的优势，分别优化液相色谱和质谱条件，选择合适的电离模式，对质谱参数进行了优化，对检测的6 种生物胺分别选择一对定性离子对和定量离对，最终实现对6种化学物质的分离、提取及确证，实现了它们的定量分析。此方法可在5min内完成6种化学物质同时分析，检测时间短、线性关系较好、方法回收率高、稳定性良好，满足分析要求。

附图说明

图1为本发明的MBR色谱图。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：80日龄冷鲜鸡，购自江苏立华食品有限公司，约2000g/羽。

仪器：Thermo TSQ MAX三重四级杆质谱仪配Thermo ACCLEA高效液相色谱仪（美国Thermo公司），N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司），固相萃取装置（美国Supelco公司）；AB104-L电子天平（瑞士梅特勒公司），3-30K台式高速离心机（德国Sigma公司）

试剂：腐胺（Put，C₄H₁₂N₂）标准品，尸胺（Cad，C₅H₁₄N₂）标准品，组胺（His，C₅H₉N₃）标准品，酪胺（Tyr，C₈H₁₁NO）标准品，精胺（Spm，C₁₀H₂₆N₄）标准品，亚精胺（Spd，C₇H₁₉N₃）标准品，购于Sigma公司；甲醇，乙腈，甲酸，无水硫酸钠（均为HPLC级，CNW公司）；超纯水（18.2MΩ.cm）

1.2 试验方法

1.2.1色谱条件

流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：2uL；色谱柱：Sepx BR-C18（2.1×150mm，3μm）；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱

时间	0.1%甲酸水溶液(A)	乙腈(B)
			0	90	10
2	50	50
			2.1	90	10
4	90	10

1.2.2 质谱条件

扫描方式：电喷雾正离子扫描（ESI+）；检测反应：多反应监测（MRM）；离子源温度：350 ℃；电喷雾电压：3500 V；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：10Arb；碰撞气：氩气。定量和定性离子对、碰撞能量等参数见表 2。

表2 质谱检测参数

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备液的配制

6种生物胺标准储备液：分别称取6种生物胺标准品适量（精确到0.1mg）于10mL的棕色容量瓶中，用适量0.1%甲酸定容，配制成1mg/mL储备液，于4℃避光保存，保质期6个月。

1. 3.2 标准曲线的绘制

将混合标准储备液用0.1%甲酸分别稀释成5、10、20、50、100、、200、500ng/mL的混合标准工作曲线，以各特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4 样品前处理

提取：称取冷鲜鸡胸脯肉2.0g，置于离心管中，加入提取液（乙腈+甲醇=9+1）10mL，无水硫酸钠少许，涡旋混匀，4℃下以5000r/min离心5min。分离后的残渣再用10 mL提取液处理，涡旋混匀，4℃下以5000r/min离心5min。合并两次的上清液。移取5mL上清液供净化。

净化：MCX固相萃取柱（100mg，3mL）经3 mL甲醇、3 mL水活化后，将上清转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，经3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗后，抽干，用5mL 5%氨水甲醇洗脱。洗脱液经30℃氮气吹干，用1mL初始流动相溶解，过0.22 μm 滤膜，供HPLC -MS/MS测定。

1.5 回收率和精密度的测定

对冷鲜鸡样品进行三水平添加回收率实验，使鸡肉中实际添加量为 10、50、100μg/kg，平行测定6次，按照本方法进行样品前处理和测定。精密度是通过相对标准偏差（RSD）的比值来评估的。

2结果与分析

2.1样品前处理的优化

2.1.1提取试剂的选择

有研究者认为生物胺检测分析中存在两个瓶颈: 一是样品基质的复杂性，二是样品中生物胺实际浓度较低。提取溶剂的选择会直接影响分析方法的回收率。本试验分别使用乙腈、甲醇、水、0.1% 甲酸、0.1% 甲酸甲醇、乙腈+甲醇、乙腈+甲醇+甲酸提取。结果表明：采用纯乙腈或含水溶剂进行提取，尸胺、腐胺等小分子二元胺，在SPE上有明显吸附，回收率过低；使用纯甲醇或含水溶剂提取，由于其强氢键作用，生物胺不会在SPE上吸附，但是许多杂质也不能在SPE上吸附，达不到净化效果；最终选取乙腈+甲醇为提取溶剂，不仅能够去除样品中的大部分杂质，还能获得较高的回收率。

进一步优化提取时乙腈+甲醇的比例，分别使用不同比例的乙腈+甲醇（1+1、1+9、9+1、8+2、2+8）溶剂进行试验。结果表明，随着提取溶剂中甲醇组分的提高，腐胺和尸胺的回收率迅速升高；但甲醇含量过高时，杂质含量也上升，样品的基质效应不断增强，影响分析的准确性。在甲醇含量为10% 时，各生物胺回收率均可达到分析要求；在甲醇含量达到20%时，色胺开始出现明显的基质效应。综合以上试验结果，最终选择乙腈+甲醇( 9+1) 为提取溶剂。

2.1.2 固相萃取柱的选择

根据各种SPE小柱的特点和使用条件，对样品中的所有目标物进行净化。本文对比了弱阳离子交换柱C18，WCX，MCX和 HLB小柱的净化效果。净化方法为：用3mL甲醇、3mL去离子水活化SPE小柱后，弃去流出液，将上述离心后的样品加入小柱内，等样品完全吸附后，再以3mL 2%甲酸水溶液过柱，弃去流出液，再用2.5mL 5%氨水甲醇洗脱洗两次，收集洗脱液氮吹至干，用甲醇定容至1mL。研究发现在冷鲜鸡中使用MCX小柱对6种生物胺的净化效果最好，空白加标回收率（6种生物胺的平均值）在90%以上，WCX柱次之，HLB 柱最差。

2.1.3洗脱液的选择

洗脱液的选择会影响样品中生物胺的回收率，对试验结果精确度影响很大。试验采用MCX 固相萃取小柱，样品过柱流速控制在1mL/min，探究了四种常见的洗脱液：甲醇，乙腈，二氯甲烷和丙酮混合液（1:1），氨水甲醇溶液（5mL氨水，95mL甲醇）。结果表明，用氨水甲醇混合溶液（5:95）洗脱，腐胺和酪胺的回收率分别为89.8%、93.0%，六种生物胺的平均回收率在88.0%～93.6%，而用二氯甲烷和丙酮混合液（1:1）、甲醇和乙腈洗脱时，六种生物胺的平均回收率为低于80%，当用甲醇洗脱时，酪胺和腐胺的回收率仅为18.7%、24.6%。另外二氯甲烷和丙酮混合液（1:1）洗脱氮吹后，需要转溶剂为甲醇并定容到 1.0 mL，氨水甲醇混合液洗脱后无需转溶剂可直接定容进样，操作也简单。所以实验最终选取氨水甲醇溶液（5:95）作为洗脱液。

2.2 质谱条件的确立

在电喷雾正离子方式下对6种生物胺进行一级质谱分析（Q1扫描）得到分子离子，即母离子。对化合物的分子离子进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息，即子离子，然后优化6种生物胺的二级质谱参数，使得特征碎片离子强度达到最大时为最佳，得到每种化合物的二级质谱图；按照二级质谱图提供的碎片离子信息，选择6种生物胺的定性和定量离子对，其多反应监测谱图见图1。

2.3 方法的线性关系及灵敏度

用生物胺标准混合溶液做线性试验，按照本实验所创建的方法进行测定，然后以定量离子的峰面积为纵坐标（Y），相对应的标准溶液浓度为横坐标（X）作标准曲线，并计算所得标准曲线的线性回归方程以及相关系数，结果显示6种生物胺的相关系数R的平方均大于0.99，说明在5～500 ng/mL的浓度范围内该方法具有良好的线性关系(见表3)。以３倍信噪比（S/N=3）对应的目标物含量作为检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）对应的目标物含量作为定量限（LOQ）(结果见表3)。

表3线性关系、检出限（LODs）和定量限（LOQs）

名称	线性范围（ng/mL）	标准曲线方程	相关系数（R<sup>2</sup>）	检出限LOD（μg/kg）	定量限LOQ（μg/kg）
						Put	5～500	Y=8866.4X+2.7e<sup>5</sup>	0.995	0.40	1.20
Cad	5～500	Y=113764X+4.0e<sup>5</sup>	0.991	0.30	0.90
						Tyr	5～500	Y=229123X+2.5e<sup>6</sup>	0.990	0.02	0.06
His	5～500	Y=121985X+1.2e<sup>7</sup>	0.992	0.10	0.30
						Spd	5～500	Y=295.6X+1.2e<sup>5</sup>	0.996	0.10	0.30
Spm	5～500	Y=297262X+0.9e<sup>5</sup>	0.997	0.10	0.30

2.4 方法的回收率和精密度

选取一冷鲜鸡胸肌样品，按本试验方法进行10、50、100 ug/kg三浓度水平的添加回收和精密度试验（n=6），试验结果见表4。可见，6种待测物的平均回收率在73.74%～102.35%之间，相对标准偏差（RSD）在1.23%～9.89%之间，说明方法的回收率和精密度良好。

表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）

Claims

1.一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法，其特征在于，按照以下方式进行：

净化：MCX固相萃取柱活化后，将上清转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，经甲酸水溶液和甲醇淋洗后，抽干，用氨水甲醇洗脱；洗脱液经吹干，用初始流动相溶解，过滤膜，供HPLC -MS/MS 测定；

净化步骤中，还可采用WCX柱；

色谱条件为：

流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：2uL；色谱柱Sepx BR-C18:2.1×150mm，3μm；

质谱条件为：

扫描方式：电喷雾正离子扫描ESI+；多反应监测MRM；离子源温度：350 ℃；电喷雾电压：3500 V；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：10Arb；碰撞气：氩气；

流动相洗脱程序如下：

；

定量和定性离子对、碰撞能量：

；

用如下的6种生物胺标准储备液：分别称取6种生物胺标准品精确到0.1mg于10mL的棕色容量瓶中，用0.1%甲酸定容，配制成1mg/mL生物胺标准储备液，于4℃避光保存，保质期6个月；

所述6种生物胺分别为腐胺Put，尸胺Cad，组胺His，酪胺Tyr，精胺Spm，亚精胺Spd；

将所述生物胺标准储备液用0.1%甲酸分别稀释成5、10、20、50、100、200、500ng/mL的生物胺标准溶液，并形成标准曲线：以各特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，生物胺标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。