CN112986575B - 一种串联式验证dna编码苗头化合物修饰抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种串联式验证DNA编码筛选分子修饰抗体功能的方法，对于已获得的分别靶向靶蛋白与醛缩酶抗体的双亲功能分子，通过分子修饰质谱检测实验，蛋白结合验证实验，细胞膜蛋白结合验证实验与免疫组化验证实验，从生物学外源与内源水平提高抗体识别靶点的能力。采用本发明的实验方法，可以准确、灵敏、实时地验证抗体通过双亲功能分子的修饰增强特异鉴定并识别靶蛋白的能力，为双亲功能分子的改造与优化并为后续体内功能实验提供了验证数据与方法支持，为DNA编码化合物广泛应用于双亲功能分子的研发与作用功能的阐明奠定了研究基础，使基于DNA编码化合物来源的靶蛋白分子的筛选、鉴定和验证过程标准化、精确化、数据化、通量化。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选领域，具体涉及DNA编码苗头化合物的改造并利用此分子对醛缩酶抗体进行修饰后的验证方法，尤其涉及一种串联式验证DNA编码苗头化合物来源的双亲功能分子修饰抗体的验证方法。
背景技术
DNA编码化合物(DNA encoded Library,DEL)通过DNA序列的连接标记化合物分子砌块的合成，根据组合化学的方式在短时间内即可获得通量化的DNA编码化合物库。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)与高通量二代测序(Next generationsequencing,NGS)的应用则可以高效推断化合物的分子组成，从检测水平克服了对高灵敏质谱的依赖。因此，DEL正逐渐成为新型苗头化合物发现的重要手段。DEL技术应用的苗头化合物鉴定通过DEL与靶蛋白孵育，洗脱后产物再次与靶蛋白进行孵育，通过多轮的富集得到与靶蛋白亲和力高的DEL分子，之后经过定量，扩增，测序，翻译得到与DNA序列对应的化合物分子信息。数据分析环节则根据化合物富集的程度进行计算，根据富集值与测序鉴定的分子数目作为参考并判断结合DEL分子的亲和力，从而推断出潜在的苗头化合物分子。针对苗头化合物，在确定了其母核结构与生物活性后，一般会通过初步的结构改造与优化形成先导化合物，使得先导化合物在苗头化合物的基础上选择性与生物活性提高，并改善其物化性质与药代毒理性。
抗体作为生物大分子的代表，其功能是帮助宿主细胞识别特异抗原，以抗体-抗原免疫作用达到清除病原体的目的。抗体的产生依赖于B淋巴细胞，在辅助T细胞递呈抗原的状态下，通过其可变区域特异且唯一识别抗原，因此，抗体具有极强的专一性。抗体的工程化改造通常从基因工程或蛋白质工程入手，在DNA层面可优化抗体表达序列，在蛋白质水平则可以通过细胞融合与化学修饰等手段增强抗体的特异性及生物活性。
目前，DEL技术与苗头化合物在生物化学领域的应用正处于起步时期，鲜少有研究报道苗头化合物用以改造抗体类大分子及其功能探究。我们将DEL筛选技术与抗体工程化改造相结合，基于DEL筛选技术得到的潜在苗头化合物分子与醛缩酶抗体识别的二酮分子进行融合，可直接应用于醛缩酶抗体的工程化改造，并通过串联式验证方法用以确定融合的双亲分子的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是验证醛缩酶抗体通过双亲功能分子改造后是否保留有高度识别靶蛋白的能力，避免了单独构建靶蛋白识别抗体耗时繁琐的流程，同时验证了多样化潜在DNA编码苗头化合物的功能，有效提高了DNA编码苗头化合物的构效关系及成药性的研究，降低DNA编码苗头化合物的改造与优化成本。本发明利用串联式验证方法检验DNA编码苗头化合物来源的双亲功能分子修饰抗体的功能，能够有效地降低阴性结合化合物的干扰，提高双亲功能分子修饰抗体应用的成功率。
为解决现有技术存在的问题，本方法采用串联式验证方法对DNA编码苗头化合物来源的双亲功能分子修饰抗体的功能进行检验并确定，可适用于DEL筛选后苗头化合物用以改造抗体及其功能验证研究。
本发明采用的技术方案是：
一种串联式验证DNA编码苗头化合物分子修饰抗体功能的方法，包括：
针对靶蛋白进行DNA编码化合物库亲和筛选，根据筛选所富集的DNA编码化合物按照其计算值及测序拷贝数由高到低进行排序，确定潜在的DNA编码苗头化合物的分子序列信息及设计去除DNA标签的苗头化合物的合成路径；
利用化学合成方法重新设计路线合成潜在的去除DNA标签的苗头化合物，并利用衔接体偶联二酮分子，形成双端分别包含DNA编码化合物来源的苗头化合物和二酮分子的双亲功能分子。该双亲功能分子通过其两端的潜在DNA编码苗头化合物可以分别靶向靶蛋白与醛缩酶抗体；
对于已获得的分别靶向靶蛋白与醛缩酶抗体的所述双亲功能分子，通过以下步骤从生物学外源与内源水平提高抗体识别靶点的能力，包括：
(1)通过分子修饰质谱检测实验来特异鉴定双亲功能分子与醛缩酶抗体的作用方式；
(2)通过蛋白结合验证实验来检测靶蛋白与醛缩酶抗体通过双亲功能分子产生的相互作用；
(3)通过细胞膜蛋白结合验证实验来验证细胞膜表面靶蛋白的表达及其通过双亲功能分子偶联醛缩酶抗体能力；
(4)通过双亲功能分子组装抗体的免疫组化验证实验来进一步定位靶蛋白在组织内的表达。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(1)中具体包括：配制双亲功能分子储存液，以100％二甲基亚砜溶解双亲功能分子，使得其终浓度为20mM。根据质谱检测需求设置双亲功能分子与醛缩酶抗体结合验证实验参照组与实验组样品，其中参照组样品为溶解于质谱亲和缓冲液的醛缩酶抗体，其蛋白量为20μg；实验组样品包括了双亲功能分子和醛缩酶抗体，其中每组醛缩酶抗体总量均为20μg，双亲功能分子在反应体系中终浓度均为25μM。
作为本发明优选的技术方案，所述质谱亲和筛选缓冲液成分均为1*PBS Tween 20缓冲液，1*PBS,pH 7.4,0.05％v/v Tween 20，每组样品需用50μL。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(1)中具体包括：将参照组与实验组样品放置于37℃，混匀仪设置垂直旋转速度为50rpm/min，孵育时间为一小时。之后收集样品并使用7K凝胶排阻色谱柱拦截未与醛缩酶抗体发生反应的化合物分子，收集洗脱液进行质谱检测。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(2)之前增加如下步骤：以清洗缓冲液清洗Protein G免疫磁珠三次，每次分别利用磁力架亲和吸附磁珠后弃清洗缓冲液上清；最后一次清洗完毕后分装免疫磁珠，每管20μL，使其与参照组与实验组样品一一对应，其中参照组样品分别为溶解于结合缓冲液的醛缩酶抗体溶液；溶解于结合缓冲液的靶蛋白溶液；两者混合后不加入双亲功能分子溶液；以及无蛋白组。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(2)中具体包括：以结合缓冲液溶解2μg醛缩酶抗体/组，将参照组样品与实验组样品溶液分别加入至各自对应的清洗后的Protein G免疫磁珠中重悬；混匀仪设置垂直旋转速度为50rpm/min，室温孵育半小时使得醛缩酶抗体包被磁珠，之后弃上清，并以结合缓冲液清洗醛缩酶抗体包被磁珠一次，轻轻吹打重悬，利用磁力架亲和吸附磁珠后弃上清，保留醛缩酶抗体-磁珠包被复合物。
作为本发明优选的技术方案，所述清洗缓冲液成分为1*TBS Tween 20缓冲液，25mM Tris,0.15M NaCl,0.05％Tween 20,pH 7.5，每组样品需用600μL。所述结合缓冲液成分为1*TBS Tween 20缓冲液，25mM Tris,0.15M NaCl,0.05％v/v Tween 20,pH 7.5，每次实验前配制新鲜亲和筛选缓冲液，每组样品需用200μL。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(2)中具体包括：以结合缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为10μM。将溶解于结合缓冲液中的双亲功能分子溶液加入到实验组样品中，参照组样品加入溶解于结合缓冲液中相同浓度二甲亚砜溶液(0.05％v/v)，每组反应总体积均为50μL。将参照组与实验组样品放置于37℃恒温箱中孵育一小时，之后收集磁珠并弃上清，以结合缓冲液清洗双功能分子-醛缩酶抗体包被磁珠三次，每次轻轻吹打重悬后利用磁力架亲和吸附磁珠，弃上清，保留双功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(2)中具体包括：以结合缓冲液溶解2μg靶蛋白/组，使得其终体积为50μL，分别将靶蛋白溶液加入双亲功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物的参照组与实验组中，室温孵育一小时，之后收集磁珠并弃上清，以结合缓冲液清洗靶蛋白-双功能分子-醛缩酶抗体包被磁珠三次，每次轻轻吹打重悬后利用磁力架亲和吸附磁珠，弃上清，保留靶蛋白-双功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物。利用Western Blot的方式检测靶蛋白是否通过双亲分子的作用与醛缩酶抗体发生免疫沉淀。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(3)之前增加如下步骤：利用pLV2载体构建靶蛋白表达质粒，将靶蛋白编码序列克隆进pLV2表达载体中，经测序得到序列正确的有靶蛋白编码序列的质粒，经放大后备用。FreeStyle 293细胞培养于FreeStyle 293完全培养基中，待细胞生长至对数期后进行传代，传代细胞经过夜培养后过表达质粒。构建有靶蛋白的质粒与转染试剂混合后加入FreeStyle 293细胞中，转染6小时后更换为FreeStyle 293完全培养基，培养48小时后进行细胞计数。取出1E6的细胞检测靶蛋白过表达水平。细胞与靶蛋白特异的一抗于37℃孵育一小时，经细胞亲和缓冲液清洗三遍，每次低速离心收集细胞体后重新以细胞亲和缓冲液重悬、之后收集的细胞与靶蛋白一抗对应的二抗进行荧光染色，于室温孵育一小时，之后经细胞亲和缓冲液清洗三遍，收集细胞体后用1mL细胞亲和缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪中通过荧光表达的强度推断细胞膜靶蛋白的表达水平。剩余细胞进行细胞膜蛋白结合验证实验。
作为本发明优选的技术方案，所述细胞亲和缓冲液成分为1*HBSS缓冲液，pH 6.7-7.8，每次实验前配制新鲜的细胞亲和筛选缓冲液，每组样品需用600μL。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(3)中具体包括：计算参照组与实验组所需反应管数，以细胞亲和缓冲液溶解20μg醛缩酶抗体/组，使得其终体积为25μL，同时以细胞亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为50μM，终体积为25μL。将醛缩酶抗体溶液与双亲功能分子稀释液等体积混合，使得混合液的终体积为50μL，双亲功能分子溶液终浓度为25μM，将参照组与实验组样品放置于37℃，混匀仪设置垂直旋转速度为50rpm/min，孵育时间为一小时。之后收集样品并使用7K凝胶排阻色谱柱过滤孵育溶液，拦截未与醛缩酶抗体发生反应的化合物分子，收集洗脱液(即双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液)进行细胞孵育。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(3)中具体包括：收集表达有底物蛋白的FreeStyle 293细胞并完成计数，将1E6细胞/组离心后弃上清，将洗脱得到的双亲功能分子-醛缩酶抗体复合物溶液与细胞进行混合，混合液终体积为50μL，于37℃混匀仪震荡孵育一小时，之后收集细胞低速离心后弃上清，以细胞亲和缓冲液清洗细胞一次后，离心后弃上清，使用荧光二抗羊抗鼠IgG标记醛缩酶抗体，于室温混匀仪震荡孵育一小时。之后收集细胞低速离心后弃上清，以细胞亲和缓冲液清洗细胞一次，低速离心后弃上清以细胞亲和缓冲液重悬细胞配置为细胞悬浮液，利用流式细胞仪检测荧光表达的强度，所得荧光表达强度在参照组与实验组之间的差异，从而推断表达于细胞膜表面的靶蛋白通过双亲功能分子的连接与醛缩酶抗体发生的相互作用。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(4)中具体包括：计算参照组与实验组所需反应管数，以质谱亲和缓冲液溶解20μg醛缩酶抗体/组，使得其终体积为25μL，同时以质谱亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为50μM，终体积为25μL。将醛缩酶抗体溶液与双亲功能分子稀释液等体积混合，使得混合液的终体积为50μL，双亲功能分子溶液终浓度为25μM，将参照组与实验组样品放置于37℃，混匀仪设置垂直旋转速度为50rpm/min，孵育时间为一小时。之后收集样品并使用7K凝胶排阻色谱板过滤孵育溶液，拦截未与醛缩酶抗体发生反应的化合物分子，收集洗脱液(即双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液)进行免疫组化。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(4)中具体包括：免疫组化的材料选择人胎盘组织，将购买的人胎盘组织石蜡块切片后置于60℃恒温箱中烘烤一小时，之后在二甲苯与梯度酒精中进行浸泡脱蜡操作，使用蒸馏水对切片进行清洗水化。抗原的修复使用EDTA抗原修复液分别于93℃和98℃高温水浴修复20分钟，冷却至室温后蒸馏水清洗。再使用3％过氧化氢室温孵育10分钟，蒸馏水清洗后完成组织切片内源性过氧化物酶灭活。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(4)中具体包括：将洗脱得到的双亲功能分子-醛缩酶抗体复合物溶液滴加至切片中央且完全覆盖切片组织，室温孵育一小时后PBS清洗三次。待吸净PBS溶液后加入CRF抗多种属(兔，大/小鼠，豚鼠)HRP多聚物标记二抗完全覆盖组织，室温孵育半小时至一小时后PBS清洗三次，蒸馏水清洗一次。
作为本发明优选的技术方案，在步骤(4)中具体包括：DAB(二氨基联苯胺)显色后以苏木素衬染孵育完成的切片，室温孵育2分钟，之后以PBS或自来水冲洗切片，待切片返蓝后浸泡梯度酒精脱水，之后浸泡二甲苯使得切片透明，以中性树胶封片后镜检拍照，以便于进行后续数据收集。
本发明中所述的衔接体(Linker)是指双亲功能分子中偶联二酮分子和结合靶蛋白的苗头化合物之间的部分。其具体可以是DNA链、聚乙二醇链、烷基链等。
本发明中所述的二酮分子(Diketone)是指本发明中可被醛缩酶抗体特异性识别的含有两个羰基的有机化物。最简单的二酮是丁二酮，即2,3-丁二酮。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种串联式有效鉴定双亲功能分子修饰抗体并验证其功能的方法。利用质谱鉴定技术，免疫沉淀技术，流式细胞仪检测技术与免疫组化技术，通过双亲功能分子对靶蛋白和醛缩酶抗体的特异识别能力，可直接应用于与靶蛋白结合的普适性抗体，避免了直接合成特异工程化抗体单一化且重复化的操作，同时提供了高可信度的与靶蛋白结合的潜在DNA编码苗头化合物的理化性质与生物活性，有利于进一步体内应用双亲功能分子与靶蛋白及普适性抗体的相互作用模式，扩大了DNA编码化合物库筛选向先导化合物改造及优化的应用，提高筛选的适用范畴，降低了化学合成分子的成本。相对于传统工程化抗体表达与纯化的方法，此方法与DNA编码化合物库筛选方法进行串联，可极大的促进药物筛选的通量与通用化抗体的普适范围，提高筛选化合物的应用范围，从8-10个月的时间，减少到3-6个月；同时可降低筛选成本，包括人力成本与物料成本。目前尚未见现有技术报道此项技术的开发，因此本方法具有较大的潜在市场空间与应用价值。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
图2是本发明实施例1的双亲功能分子修饰醛缩酶抗体质谱鉴定结果示意图。
图3是本发明实施例1的双亲功能分子与醛缩酶抗体体外相互作用结果示意图。
图4是本发明实施例1的双亲功能分子与醛缩酶抗体在细胞膜表面相互作用结果示意图。
图5是本发明实施例1的双亲功能分子与醛缩酶抗体相互作用免疫组化结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：对PD-L1靶蛋白进行串联式验证DNA编码苗头化合物来源的双亲功能分子修饰抗体的功能以确认方法的可行性
一、背景：PD-L1作为免疫监察点抑制剂在肿瘤免疫中发挥重要的调节作用，此例中用购买的His标签的PD-L1作为靶蛋白以验证方法。醛缩酶抗体选择鼠源的38C2蛋白作为工程化改造抗体对象。
二、实施方法：
如图1所示，该方法具体包括如下步骤：
1.缓冲液准备
10×PBS(Thermo fisher，美国)，100％Tween 20(Sigma-Aldrich，美国)，100％二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，美国)；1*HBSS(Invitrogen，美国)；Lipofectamine 3000(Thermo fisher，美国)；FreeStyle 293完全培养基(Thermo fisher，美国)；牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，美国)；PD-L1单抗(Abcam，美国)；羊抗鼠荧光二抗(Abcam，美国)；羊抗兔荧光二抗(Abcam，美国)。
配制质谱亲和缓冲液：1×PBS,0.05％Tween 20；
配制结合缓冲液：25mM Tris,0.15M NaCl,0.05％v/v Tween 20,pH 7.5；
配制细胞亲和缓冲液：1*HBSS缓冲液，pH 6.7-7.8
2.醛缩酶抗体溶液准备
将醛缩酶抗体38C2以总量按照(组数+1)*20μg溶解于质谱亲和缓冲液中，并分装至参照组和实验组。
3.双功能分子溶液准备
称取双功能分子(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)，根据称取质量＝摩尔浓度*体积*分子量来计算终浓度20mM的化合物分子所需的溶解体积。将称取完毕的化合物溶解于稀释100％二甲亚砜中，以质谱亲和缓冲液梯度稀释储存液至50μM。
4.亲和孵育
等体积混合化合物与醛缩酶抗体，使得每组终体积为50μL，且化合物终浓度为25μM。37℃翻转孵育一小时。
5.孵育后复合物收集
7K凝胶排阻色谱层析柱以蒸馏水200μL/组，1*PBS 200μL/组，1*PBS 200μL/组的顺序进行润洗，期间1200rpm，2分钟离心去除清洗液。将孵育后样品分别上样于凝胶排阻色谱层析柱，1200rpm，2分钟离心收集洗脱液。
6.质谱检测
洗脱产物使用BioAccord LC-MS System(Waters,美国)液相质谱联用仪检测双亲功能分子修饰醛缩酶抗体38C2的程度并计算修饰分子的个数。检测结果如图2所示。由图2可知，仅醛缩酶抗体组的蛋白质谱结果显示醛缩酶抗体包含150730/150933/151093/151256/151409Da这些分子量；加入双亲功能分子101050-18-34-40-diketone后，除原有分子量，出现了结合一个双亲功能分子的分子量(DAR＝1,+1330Da)152263/152422/152586Da等，以及结合两个双亲功能分子的分子量(DAR＝2,+2660Da)153593/153752/153916Da等；加入双亲功能分子101050-185-34-40-diketone后，除原有分子量，出现了结合一个双亲功能分子的分子量(DAR＝1,+1402Da)152335/152495/152662Da等，以及结合两个双亲功能分子的分子量(DAR＝2,+2804Da)153738/153900/154064Da等。以上结果表明醛缩酶抗体可以与双亲功能分子形成稳定复合物。
7.磁珠准备
将Protein G免疫磁珠(Thermo fisher,美国)放在涡旋振荡器(ScientificIndustries,美国)振荡30秒，用移液枪吸取(组数+1)*10μL至1.5ml低吸附离心管(Eppendorf,德国)中，将离心管放置于磁力架(Thermo fisher,美国)吸附磁珠，用移液枪吸走上清液。用50μL*(组数+1)结合缓冲液清洗磁珠三次，每次将离心管放置于磁力架吸附磁珠并弃掉上清，彻底去除磁珠储存缓冲液(stocking buffer)。
8.醛缩酶抗体38C2固载
将2μg/组醛缩酶抗体38C2按照参照组1仅PD-L1靶蛋白组，参照组2仅醛缩酶抗体38C2组，参照组3无蛋白组，参照组4无双亲功能分子组，实验组1无双亲功能分子组，实验组2阳性对照组(BMS202-diketone)，实验组3双亲功能分子组(10150-18-34-40-diketone)，实验组4双亲功能分子组(10150-185-34-40-diketone)进行分装，并加入到相应的清洗完成的Protein G免疫磁珠组别中，终体积为50μL。室温条件下，翻转孵育30分钟。将离心管放置于磁力架上，用移液枪吸走上清液；用200μL/组结合缓冲液清洗磁珠一次，将离心管放置于磁力架吸附磁珠并弃掉上清。
9.双亲功能分子孵育
将双亲功能分子(BMS202-diketone/10150-18-34-40-diketone/10150-185-34-40-diketone)按照参照组1仅PD-L1靶蛋白组，参照组2仅醛缩酶抗体38C2组，参照组3无蛋白组，参照组4无双亲功能分子组，实验组1无双亲分子组，实验组2阳性对照组(BMS202-diketone)，实验组3双功能分子组(10150-18-34-40-diketone)，实验组4双功能分子组(10150-185-34-40-diketone)加入到对应管数中，终体积为50μL。37℃条件下，翻转孵育一小时。将离心管放置于磁力架上，用移液枪吸走上清液；用200μL/组结合缓冲液清洗磁珠三次，每次将离心管放置于磁力架吸附磁珠并弃掉上清。
10.PD-L1靶蛋白孵育
将2μg/组PD-L1靶蛋白按照参照组1仅PD-L1靶蛋白组，参照组2仅醛缩酶抗体38C2组，参照组3无蛋白组，参照组4无双亲功能分子组，实验组1无双亲分子组，实验组2阳性对照组(BMS202-diketone)，实验组3双功能分子组(10150-18-34-40-diketone)，实验组4双亲功能分子组(10150-185-34-40-diketone)进行分装，并加入到相应化合物-醛缩酶抗体38C2复合物组别中，终体积为50μL。室温条件下，翻转孵育一小时，每组收取2.5μL作为Input样品。将离心管放置于磁力架上，用移液枪吸走上清液；每次用200μL/组结合缓冲液清洗磁珠三次，将离心管放置于磁力架吸附磁珠并弃掉上清。
11.Western Blot检测
每组加入15μL上样缓冲液，95℃煮样10分钟，120V电泳40分钟后进行PVDF膜转膜操作，1.3A-25V转膜7分钟，之后以用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭PVDF膜一小时，加入抗PD-L1一抗，4℃孵育过夜。以PBST洗三遍后，加入二抗常温孵育1小时。用PBST洗三遍后，用ECL反应液显色。检测结果如图3所示。由图3可知，左侧Input样品中PD-L1靶蛋白组、无双亲功能分子组、双亲功能分子组(BMS202-diketone,10150-18-34-40-diketone,10150-185-34-40-diketone)均有PD-L1靶蛋白加入；右侧Pull-down样品中仅双亲功能分子组(BMS202-diketone,10150-18-34-40-diketone,10150-185-34-40-diketone)检测到PD-L1靶蛋白的条带。以上结果表明，双亲功能分子可以介导PD-L1靶蛋白和醛缩酶抗体38C2的相互作用。
12.PD-L1质粒转染细胞
酶切处理后的表达载体pLV2与PCR并以相同酶切处理后的PD-L1编码片段连接，转化，测序后得到序列正确的PD-L1质粒，大抽后定量备用。传代后FreeStyle 293细胞培养于FreeStyle 293完全培养基中，过夜培养后转染PD-L1表达质粒。PD-L1质粒与转染试剂Lipo3000混合后加入FreeStyle 293细胞中，转染6小时后更换为FreeStyle 293完全培养基，培养48小时后备用。
13.PD-L1细胞表达检测
取1E6的PD-L1过表达细胞检测PD-L1表达水平。FreeStyle 293-PD-L1过表达细胞以1*HBSS溶液洗涤后，与PD-L1特异的一抗于37℃孵育一小时，经1*HBSS清洗三遍，每次1000rpm，3分钟低速离心收集细胞体后重新以1*HBSS重悬。清洗完三遍的细胞与PD-L1一抗对应的荧光羊抗兔二抗进行染色，于室温孵育一小时，之后经1*HBSS清洗三遍清洗三遍，收集细胞体后用1mL细胞亲和缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪中以前向反射光(FSC)与侧向反射光(SSC)确定所分析的细胞类群，圈门后检测细胞表面荧光的表达，通过荧光表达的强度推断细胞膜靶蛋白的表达水平。
14.细胞互作体外亲和孵育
将醛缩酶抗体38C2以总量按照(组数+1)*20μg溶解于细胞亲和缓冲液中，并分装至参照组和实验组，以细胞亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)至50μM。等体积混合化合物与醛缩酶抗体，将双亲功能分子(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)加入实验组，使得每组终体积为50μL，且化合物终浓度为25μM。37℃翻转孵育一小时。
15.孵育后复合物收集
7K凝胶排阻色谱层析柱以蒸馏水200μL/组，1*PBS 200μL/组，1*PBS 200μL/组的顺序进行润洗，期间1200rpm，2分钟离心去除清洗液。将孵育后样品分别上样于7K凝胶排阻色谱层析柱，1200rpm，2分钟离心收集洗脱液。
16.细胞孵育：
取3.75μL(约1500ng)38C2抗体-小分子复合物用PBS稀释至50μL，加入到PD-L1过表达的FreeStyle 293细胞(悬浮)，37℃孵育1小时。用200μL HBSS洗涤细胞一次，低速离心弃上清收集细胞。之后加入荧光标记的抗鼠源38C2的二抗常温孵育1小时。用200μL HBSS洗涤细胞两次，低速离心弃上清收集细胞。
17.细胞检测
以1*HBSS重悬细胞，1000μL/组，细胞通过Becton Dickinson FACSAriaTM IIIflow cytometer(BD Biosciences)进行流式细胞术检测。以前向反射光(FSC)与侧向反射光(SSC)确定所分析的细胞类群，圈门后检测细胞表面荧光的表达；以平均荧光表达强度为对比值衡量参照组与实验组荧光表达的差异，进而推断细胞膜靶蛋白通过双亲功能分子的亲和作用于醛缩酶抗体38C2，并以其作为指示来指征细胞膜靶蛋白的表达与亲和作用特异性。结果如图4所示。由图4可知，加入双亲功能分子(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)-醛缩酶抗体38C2复合物的PD-L1细胞的平均荧光强度明显高于仅加入醛缩酶抗体38C2的PD-L1细胞的平均荧光强度，也显著高于同组的未表达PD-L1的对照组细胞的平均荧光强度。以上结果说明，细胞膜靶蛋白PD-L1可以通过双亲功能分子亲和作用于醛缩酶抗体38C2。
18.免疫组化体外亲和孵育
将醛缩酶抗体38C2以总量按照(组数+1)*20μg溶解于细胞亲和缓冲液中，并分装至参照组和实验组，以细胞亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)至50μM。等体积混合化合物与醛缩酶抗体，将双亲功能分子(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)加入实验组，使得每组终体积为50μL，且化合物终浓度为25μM。37℃翻转孵育一小时。
15.孵育后复合物收集
7K凝胶排阻色谱层析柱以蒸馏水200μL/组，1*PBS 200μL/组，1*PBS 200μL/组的顺序进行润洗，期间1200rpm，2分钟离心去除清洗液。将孵育后样品分别上样于7K凝胶排阻色谱层析柱，1200rpm，2分钟离心收集洗脱液。
20.免疫组化组织准备
人胎盘组织蜡块购买自长沙南科。石蜡块切片后置于60℃恒温箱中烘烤一小时，之后进行浸泡脱蜡操作，按照两次二甲苯浸泡10分钟，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇与70％乙醇各浸泡5分钟进行梯度脱蜡；之后使用蒸馏水对切片进行清洗水化，冲洗2次，每次3分钟。之后进行抗原修复。使用EDTA抗原修复液分别于93℃和98℃高温水浴修复20分钟，冷却至室温后蒸馏水清洗，冲洗2次，每次3分钟。再使用3％过氧化氢室温孵育10分钟，蒸馏水清洗冲洗2次，每次3分钟，完成组织切片内源性过氧化物酶灭活。
21.免疫组化亲和孵育
各自吸取洗脱得到的参照组和实验组复合物溶液3.75μL(约1500ng)以1*PBS稀释至50μL，之后分别滴加至石蜡切片中央且完全覆盖切片组织，室温孵育一小时后PBS清洗三次，每次5分钟。待吸净PBS溶液后加入CRF抗多种属(兔，大/小鼠，豚鼠)HRP多聚物标记二抗完全覆盖组织，室温孵育半小时后PBS清洗三次，每次3分钟，蒸馏水清洗一次3分钟。
22.免疫组化染色与检测
加入配制好的DAB液，依据颜色变化显色2.5分钟，蒸馏水冲洗3次，每次3分钟。之后以苏木素对切片进行衬染，室温孵育2分钟，之后以PBS或自来水冲洗切片10-15分钟，待切片返蓝后分别浸泡70％乙醇，85％乙醇，95％乙醇与100％无水乙醇，每次3分钟，进行切片脱水操作。之后进行两次二甲苯浸泡10分钟透明操作，以中性树胶封片后镜检拍照。检测结果如图5所示。由图5可知，加入双亲功能分子(10150-18-34-40-diketone和10150-185-34-40-diketone)-醛缩酶抗体38C2复合物的人胎盘组织的滋养层细胞的着色较深，与使用PD-L1抗体组的着色相近，而仅加入醛缩酶抗体的人胎盘组织的滋养层细胞的着色较浅。且已知人胎盘组织的滋养层细胞高表达PD-L1靶蛋白。以上结果表明，醛缩酶抗体38C2可以通过双亲功能分子特异性识别组织切片中的PD-L1靶蛋白。
采用本发明的实验方法，可以准确、灵敏、实时地验证抗体通过双亲功能分子的修饰增强特异鉴定并识别靶蛋白的能力，为双亲功能分子的改造与优化并为后续体内功能实验提供了验证数据与方法支持，为DNA编码化合物广泛应用于双亲功能分子的研发与作用功能的阐明奠定了研究基础，使基于DNA编码化合物来源的靶蛋白分子的筛选、鉴定和验证过程标准化，精确化，数据化，通量化。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (16)
1.一种非疾病诊断治疗目的的串联式验证DNA编码苗头化合物分子修饰抗体功能的方法，其特征在于，
根据基于PD-L1靶蛋白的DNA编码化合物库筛选的结果，通过数据分析根据其富集计算值进行降序排序以得到可信度较高的潜在DNA编码苗头化合物；
合成潜在DNA编码苗头化合物，并将潜在DNA编码苗头化合物与二酮分子通过衔接体连接形成双亲功能分子；
对于已获得的分别靶向PD-L1靶蛋白与醛缩酶抗体的所述双亲功能分子，通过分子修饰质谱检测实验，蛋白结合验证实验，细胞膜蛋白结合验证实验与免疫组化验证实验，从生物学外源与内源水平提高抗体识别靶点的能力，包括：
（1）通过所述分子修饰质谱检测实验来特异鉴定双亲功能分子与醛缩酶抗体的作用方式；
（2）通过所述蛋白结合验证实验来检测PD-L1靶蛋白与醛缩酶抗体通过双亲功能分子产生的相互作用；
（3）通过所述细胞膜蛋白结合验证实验来验证细胞膜表面PD-L1靶蛋白的表达及其通过双亲功能分子偶联醛缩酶抗体能力；
（4）通过双亲功能分子组装抗体的免疫组化验证实验来定位PD-L1靶蛋白的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中具体包括：以100% 二甲基亚砜溶液溶解双亲功能分子配制为双亲功能分子储存液，使得其终浓度为20 mM，以质谱亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为50 μM。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中具体包括：以质谱亲和缓冲液溶解20 μg醛缩酶抗体，并与双亲功能分子溶液等体积混合，37℃孵育一小时；利用凝胶排阻色谱柱过滤孵育溶液，收集洗脱溶液进行质谱检测。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质谱亲和缓冲液成分为1* PBS Tween20缓冲液，1*PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20，每组样品需用50 µL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中具体包括：以清洗缓冲液清洗Protein G免疫磁珠三次，弃清洗缓冲液；以结合缓冲液溶解2 μg醛缩酶抗体/组，将两者室温孵育半小时使得醛缩酶抗体包被磁珠，之后弃上清并以结合缓冲液清洗醛缩酶抗体包被磁珠一次，弃上清保留醛缩酶抗体-磁珠包被复合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述清洗缓冲液成分为1* TBS Tween 20缓冲液，25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.5，每组样品需用600 µL；所述结合缓冲液成分为1* TBS Tween 20缓冲液，25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.5，每次实验前配制新鲜亲和筛选缓冲液，每组样品需用200 µL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中具体包括：以结合缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为10 μM；将稀释的双亲功能分子与醛缩酶抗体-磁珠包被复合物混合，于37℃孵育一小时，之后弃上清并以结合缓冲液清洗孵育后磁珠三次，弃上清保留双亲功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中具体包括：以结合缓冲液溶解2μg PD-L1靶蛋白/组，使得其终体积为50 µL，将双亲功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物与PD-L1靶蛋白溶液混合，室温孵育一小时，之后弃上清并以结合缓冲液清洗孵育后磁珠三次，弃上清保留PD-L1靶蛋白-双亲功能分子-醛缩酶抗体-磁珠包被复合物；利用WesternBlot的方式检测PD-L1靶蛋白是否通过双亲功能分子的桥连与醛缩酶抗体发生相互作用。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中具体包括：利用构建有PD-L1PD-L1靶蛋白编码序列的质粒在FreeStyle 293细胞中进行过表达操作；质粒与转染试剂混合后加入FreeStyle 293细胞中，培养48小时后进行细胞计数，之后取出1E6的细胞数检测PD-L1靶蛋白过表达水平；通过PD-L1靶蛋白特异的一抗与其对应的二抗进行荧光染色后，在流式细胞仪中通过荧光表达的强度推断细胞膜靶的表达水平；剩余细胞进行细胞膜蛋白结合验证实验。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中具体包括：以细胞亲和缓冲液溶解20 μg醛缩酶抗体，同时以细胞亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为50 μM；将醛缩酶抗体溶液与双亲功能分子稀释液等体积混合，使得混合液的终体积为50 µL，双亲功能分子溶液终浓度为25 μM，37℃孵育一小时；利用凝胶排阻色谱柱过滤孵育溶液，收集洗脱溶液，即双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞亲和缓冲液成分为1* HBSS缓冲液，pH 6.7-7.8，每次实验前配制新鲜的细胞亲和筛选缓冲液，每组样品需用600 µL。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中具体包括：将1E6细胞/组离心后弃上清，将洗脱得到的双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液与细胞进行混合，于37℃孵育一小时，离心后弃上清并以细胞亲和缓冲液清洗细胞一次，离心后弃上清，以荧光二抗标记醛缩酶抗体，于室温孵育一小时；离心后弃上清并以细胞亲和缓冲液清洗细胞一次，离心后弃上清以细胞亲和缓冲液冲悬细胞配置为细胞悬浮液，利用流式细胞仪检测荧光表达的强度，从而推断表达于细胞膜表面的PD-L1靶蛋白通过双亲功能分子的连接与醛缩酶抗体发生的相互作用。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中具体包括：以质谱亲和缓冲液溶解20 μg醛缩酶抗体，同时以质谱亲和缓冲液梯度稀释双亲功能分子储存液，使得其终浓度为50 μM；将醛缩酶抗体溶液与双亲功能分子稀释液等体积混合，使得混合液的终体积为50 µL，双亲功能分子溶液终浓度为25 μM，37℃孵育一小时；利用凝胶排阻色谱柱过滤孵育溶液，收集洗脱溶液，即双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中具体包括：取人胎盘组织石蜡块进行切片，之后分别通过脱蜡与水化，抗原修复与内源性过氧化物酶灭活，将双亲功能分子与醛缩酶抗体复合物溶液与组织切片进行室温一小时孵育，之后利用PBS溶液冲洗切片三次。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中具体包括：利用HRP多聚物标记二抗与组织切片进行室温一小时孵育，之后利用PBS溶液冲洗切片三次，蒸馏水冲洗切片一次。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中具体包括：分别利用DAB显色，苏木素衬染，脱水透明后封片，以便于进行后续数据收集。
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