CN118126172A

CN118126172A - Dsc2结合蛋白、制备方法和应用

Info

Publication number: CN118126172A
Application number: CN202410260499.3A
Authority: CN
Inventors: 徐立超; 叶悦云; 徐亮; 曾敏霞
Original assignee: Zhuhai Lihe Medical Diagnosis Products Co ltd; Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Current assignee: Zhuhai Lihe Medical Diagnosis Products Co ltd; Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Priority date: 2024-03-07
Filing date: 2024-03-07
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明提供了一种DSC2结合蛋白、制备方法和应用，涉及抗体技术领域。DSC2结合蛋白包含轻链可变区和重链可变区，其中VH‑CDR1如SEQ ID NO.1所示，VH‑CDR2如SEQ ID NO.2所示，VH‑CDR3如SEQ ID NO.3所示；VL‑CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，VL‑CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，VL‑CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该结合蛋白与DSC2具有良好的特异性结合能力，可用于DSC2抗原的鉴定和DSC2相关疾病的诊断检测。

Description

DSC2结合蛋白、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其是涉及一种DSC2结合蛋白、制备方法和应用。

背景技术

Desmocollin 2(桥粒芯胶蛋白2，DSC2)是细胞间桥粒连接的组成部分，参与斑块蛋白和中间丝的相互作用，介导细胞-细胞粘附。在人类细胞中，DSC2蛋白由901个氨基酸编码，理论分子量大小约100Kda，由于含有多个糖基化位点，实际分子量大小约120Kda，为单次跨膜糖蛋白。

近年来的研究结果显示，DSC2在肿瘤的发生发展中发挥多种重要功能，包括在乳腺癌、食管癌以及胰腺癌等疾病中均存在不同程度的高表达。因此，利用免疫荧光染色、流式分选或荧光微球等技术可以对病人做早期肿瘤疾病诊断。

由于肿瘤标志物诊断对检测所用抗体的亲和力要求较高，因此开发出高亲和力，可规模化生产，批间差小，性能稳定，尤其是可用于疾病检测中的抗DSC2的重组单抗，有着重要的临床意义和应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供DSC2结合蛋白，该结合蛋白与DSC2具有良好的特异性结合能力。基于本发明提供的DSC2结合蛋白，本发明的目的还在于提供其应用。本发明的另一目的在于以操作更简单的方法开发结合活性好的DSC2结合蛋白，可用于DSC2抗原表达升的疾病的鉴定，以及辅助用于具有高表达DSC2特征的疾病检测试剂盒或方法的开发。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

名词定义：

本文中“DSC2”指的是桥粒芯胶蛋白2(Desmocollin 2)，其是细胞间桥粒连接的组成部分，参与斑块蛋白和中间丝的相互作用，介导细胞-细胞粘附。本发明提供的DSC2结合蛋白能够与DSC2特异性结合，DSC2结合蛋白结合的DSC2包括由细胞天然表达或经DSC2基因转染的细胞表达的DSC2。DSC2结合蛋白结合的DSC2还包括经人工改造的DSC2，所述人工改造包括但不限于突变、截短或者与其他结构域融合后的多肽或蛋白，且保留与抗体结合的必要的抗原表位。

在本文中“结合蛋白”此技术术语是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。蛋白及蛋白片段可以为抗体，“抗体”特别指全长抗体。“抗体”和“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。非天然发生的抗体在本文中也被称为“重组抗体”，“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

蛋白及蛋白片段也可以是包含抗体CDR的一部分或全部的抗原结合片段，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自但不限于F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)、dsFv(二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments,dsFv))、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

结合蛋白的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自通过4个骨架区(framework region，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determiningregion，CDR)(也被称作高变区)组成。骨架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等)和Chothia中，本领域众所周知的任何CDR确定方法，包括方法的组合，可以鉴别可变结构域的CDR。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

术语抗体的“恒定区”或“恒定结构域”表示单独的或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。抗体的重链具有一个可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域或区域，例如铰链、CH1、CH2、CH3和CH4中的一个或多个，CH1结构域邻近VH结构域且在抗体重链的铰链区的氨基端，且不形成抗体的Fc区的部分；铰链区包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分；CH2的N端通常为CH3结构域，CH3结构域通常形成抗体的C-端部分，在一些抗体类型中，例如IgM和IgE中恒定区还包括CH4结构域。抗体的恒定区可以源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD，以及它们的亚类和突变形式的恒定区。

本发明不限制DSC2结合蛋白的获得方式。在一些可选的实施方式中，利用编码DSC2结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，在细胞表达能够获得相应抗体。可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达所述DSC2结合蛋白。在另一些可选的实施方式中，结合蛋白还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，如自动肽合成仪获得(例如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪)；抗原结合片段还可选地通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解产生，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶裂解；或化学裂解产生，例如通过化学还原***二硫键的方法获得上述的抗原结合片段。

术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指结合蛋白对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，结合蛋白以大约小于10^-5M，例如大约小于10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_d值结合。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的K_d值。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。

本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述DSC2结合蛋白，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。术语“多核苷酸”和“核酸”本文中可互换地使用。

本文中术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物。

本文中，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本文中“DSC2相关疾病”是指疾病的特征包括表达或过表达DSC2和或DSC2相关基因；或包括不表达或低表达DSC2和/或DSC2相关基因。在一些实施方式中，DSC2相关疾病是与过度细胞增殖有关的病症，例如癌症。

本文中“表达DSC2的癌症”是指在癌细胞或肿瘤浸润的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达DSC2，并且在癌细胞或肿瘤浸润的免疫细胞或免疫抑制细胞中表达DSC2的水平显著高于正常细胞所预期的水平的癌症。

第一方面，提供了一种DSC2结合蛋白，其包含重链可变区和轻链可变区：所述重链可变区包含互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；所述轻链可变区包含互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3；

VH-CDR1的氨基酸序列为SYWMN(SEQ ID NO.1)；

VH-CDR2的氨基酸序列为NIDPYDSETHYNQKFKD(SEQ ID NO.2)；

VH-CDR3的氨基酸序列为SPEYGYFDV(SEQ ID NO.3)；

VL-CDR1的氨基酸序列为KASQDVSTAVA(SEQ ID NO.4)；

VL-CDR2的氨基酸序列为SASYRYT(SEQ ID NO.5)；

VL-CDR3的氨基酸序列为QQHYSTPPT(SEQ ID NO.6)。

可选的实施方式中，所述DSC2结合蛋白的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

可选的实施方式中，所述DSC2结合蛋白为完整抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

可选的实施方式中，所述抗体其余部分序列来源物种包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述DSC2结合蛋白为嵌合抗体或其抗原结合片段；或所述DSC2结合蛋白为人源化抗体或其抗原结合片段。

可选的实施方式中，所述DSC2结合蛋白还包含恒定区。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白的恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列，以及它们的亚类和突变形式。恒定区的种属来源例如可以为但不限于为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白包括重链恒定区。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链恒定区。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白包括轻链恒定区。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的轻链恒定区。

可选的实施方式中，DSC2结合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

第二方面，还提供了一种生物材料，包括多核苷酸、载体、细胞；其中，多核苷酸编码上述DSC2结合蛋白；载体携带所述多核苷酸；细胞携带所述多核苷酸、或含有所述载体或能够表达所述DSC2结合蛋白。

利用编码DSC2结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达DSC2结合蛋白的细胞系，在细胞表达能够获得相应蛋白。

可选的实施方式中，用于表达DSC2结合蛋白的宿主细胞为293细胞(人肾上皮细胞系)，优选为293F细胞。

可选的实施方式中，用于表达DSC2结合蛋白的宿主细胞为CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。

第三方面，还提供了DSC2结合蛋白的制备方法，包括培养能够表达所述DSC2结合蛋白的细胞，例如第二方面中所述的细胞。

可选的实施方式中，所述制备方法还包括将编码含有所述DSC2结合蛋白的多核苷酸转化至宿主细胞并表达，通过纯化获得DSC2结合蛋白。

可选的实施方式中，根据需要合成含有所述DSC2结合蛋白编码基因的多核苷酸，和/或，根据需要制备合适的表达载体，将表达载体转化至所需的宿主细胞中并表达，通过纯化可得到所述DSC2结合蛋白。

可选的实施方式中，所述的DSC2结合蛋白的多核苷酸包括重链表达质粒和轻链表达质粒，将所述重链表达质粒和所述轻链表达质粒共转化至宿主细胞，通过纯化获取所述DSC2结合蛋白。

可选的实施方式中，包括将重链可变区C端融合重链恒定区片段，构建完整的重链表达质粒。

可选的实施方式中，包括将轻链可变区C端融合轻链恒定区片段，构建完整的轻链表达质粒。

可选的实施方式中，宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，进一步优选为293细胞或CHO细胞。

可选的实施方式中，293细胞包括293F细胞。

第四方面，还提供了第一方面的DSC2结合蛋白、或第二方面的生物材料、或第三方面的制备方法在如下(Ⅰ)～(IV)任意一项中的应用：

(Ⅰ)非诊断和治疗目的地检测DSC2或表达DSC2的细胞；

(Ⅱ)制备用于检测DSC2或表达DSC2的细胞的产品；

(Ⅲ)制备DSC2相关疾病的诊断产品；

(IV)DSC2蛋白或其蛋白突变体的纯化。

可选的实施方式中，上述第(Ⅰ)方面的应用可以利用DSC2结合蛋白能够特异性靶向结合DSC2，基于免疫检测技术实现DSC2或表达DSC2的细胞的检测，如当DSC2结合蛋白为免疫偶联物，例如连接有荧光基团，可以采用荧光检测装置实现对DSC2的定位或实时检测。例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀或流式细胞技术等涉及到利用DSC2抗原和抗体的特异性结合性能来检测DSC2或表达DSC2的细胞。相应的，上述第(Ⅱ)方面，本领域技术人员可以根据实际的检测手段制备相应的产品(如上述提到的免疫偶联物)，并选配产品中的其他试剂组成，包括但不限于缓冲试剂、盐、二抗、显色底物、封闭液、洗涤液、溶剂、洗脱液、偶联剂、阴性对照、阳性对照、标准品、质控品和标记物中的一种或多种。

可选的实施方式中，上述第(Ⅲ)方面，所述DSC2相关疾病包括表达DSC2的癌症。示例性的表达DSC2的癌症包括但不限于乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、***癌、胃癌和肝癌中的一种或多种。

第五方面，还提供了DSC2检测试剂或试剂盒，所述DSC2检测试剂或试剂盒包括但不限于用于检测DSC2分子、表达DSC2的细胞或诊断DSC2相关疾病。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒还包括示踪标记物和/或固相载体。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒中的DSC2结合蛋白与示踪标记物偶联；或所述试剂或试剂盒中的DSC2结合蛋白与示踪标记物分别独立的包装。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒中的DSC2结合蛋白与固相载体偶联；或所述试剂或试剂盒中的DSC2结合蛋白与固相载体分别独立的包装。

上述试剂或试剂盒还任选地包括本领域用于检测反应的，本领域技术人员熟知的试剂和/或耗材，包括但不限于缓冲试剂、盐、二抗、显色底物、封闭液、洗涤液、溶剂、洗脱液、偶联剂、阴性对照、阳性对照、标准品、质控品和标记物中的一种或多种。

上述试剂或试剂盒可用于本领域可接受的、一般的免疫检测方法中，包括但不限于免疫荧光染色、流式分选、免疫印记、免疫组化、ELISA、免疫层析或免疫磁珠中，本领域技术人员可根据对应的检测手段配制试剂或试剂盒中的其他试剂，本发明对此不做限制。

上述示踪标记物包括酶、发光标记、荧光微球、彩色微球、乳胶微球、胶体金、量子点、生物素、链霉亲和素、放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属和光敏剂中的一种或多种。

酶的实例例如可以为但不限于为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，发光标记例如可以为但不限于为荧光蛋白、合成类小分子或聚合物染料等，具体的实例包括但不限于Alexa350、Alexa 405、Alexa430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。荧光微球、彩色微球和乳胶微球分别独立的选自本领域可接受的产品，例如来源于市售的产品。放射性核素包括但不限于¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的一种或多种。顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)中的一种或多种。

上述固相载体包括微管、柱、微粒、硝酸纤维素膜、层析基质或侧流装置；更具体的例如可以为但不限于为酶标孔、免疫层析试纸或磁珠。所述层析基质可选择本领域可接受的，已知的任何层析基质，包括但不限于聚苯乙烯、多糖聚合物或硅胶等。可选的实施方式中，所述层析基质包括凝胶颗粒。

本发明公开了一种特异性识别结合DSC2的DSC2结合蛋白。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)该方法制备过程操作简单，耗时短，且单抗序列已知，能够通过细胞随时进行表达，表达量高，生产工艺可控、产品批间差小。

(2)本发明的DSC2结合蛋白具有较好的特异性，EC50值约为1.3nM，能够特异地与DSC2蛋白结合；

(3)本发明公开的DSC2结合蛋白可偶联标记物或固相载体，从而制备用于DSC2抗原的检测的试剂，可用于DSC2表达的相关疾病，特别是癌症的辅助诊断，诊断方法包括但不限于：免疫荧光染色、流式分选、荧光微球等技术。

(4)可偶联凝胶颗粒等层析固定材料进行DSC2抗原的免疫亲和层析纯化，蛋白纯度更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中用于构建文库的重链(Fd)与轻链(L)的核酸电泳图；

图2为实施例1中用于构建文库的Fab基因片段的核酸电泳图；

图3为实施例2中抗DSC2重组单抗的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中Ab-DSC2-非还原：大小约为150kDa；Ab-DSC2-还原：重链和轻链分别为50kDa，25kDa；

图4为实施例3中ELISA测定重组单抗与DSC2蛋白的结合情况分析，Ab-DSC2为重组单抗对DSC2抗原的结合活性。Ab-BSA为重组单抗对对照蛋白BSA的非特异性结合活性。

图5为实施例4中免疫荧光染色检测Ab-DSC2与过表达DSC2蛋白的293F细胞结合情况分析；实验组为在293F细胞中过表达DSC2后，Ab-DSC2重组单抗与DSC2过表达细胞的结合荧光图；阴性对照组为在293F细胞中过表达空载后，Ab-DSC2重组单抗与空载过表达细胞的结合荧光图；红色细胞为在荧光显微镜下被Ab-DSC2识别的DSC2过表达细胞，透明色为明场显微镜下细胞视野，比例尺20μm。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1DSC2结合蛋白的筛选

(一)噬菌体展示文库的制备：

(1)使用小鼠淋巴细胞分离液分离DSC2抗原免疫后的小鼠脾淋巴细胞。

(2)抽提RNA：取1×10⁶细胞，提取淋巴细胞的总RNA。

(3)反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA。

(4)抗体基因片段扩增：以cDNA为模板，通过特异性扩增引物，扩增抗体的轻链L(κ)及重链的VH-CH1(Fd)区。扩增体系(总体积20μL)如表1所示，反应程序如表2所示：

表1扩增体系

试剂	所需体积或质量
		cDNA	30ng
Prime F	0.8μL
		Prime R	0.8μL
2×phanta max master mix	10μL
		Nuclease-Free Water	补足至20μL

表2反应程序

反应结束后，体系中加入6×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图如图1所示，目的条带约750bp。切下目的条带，分别回收抗体重链(Fd)基因片段和轻链基因片段(L)，如图1。

(5)抗体轻链及重链基因片段通过overlapping PCR组成完整Fab基因片段。反应体系如表3所示，反应程序如表4所示：

表3overlapping PCR反应体系

表4overlapping PCR反应程序

反应结束后，体系中加入6×loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图如图2所示，目的条带约1500bp。切下目的条带，回收抗体Fab片段。

上游引物sfiⅠF：5’>GAGCAGGAGCATAGGAGGATCGGGCGGCGGCC<3’(SEQ ID NO.13)；

下游引物sfiⅠR：5’>CCATGGCAATGGTGATTCTGCTGCGCGGCCTGGCC<3’(SEQ IDNO.14)。

(6)质粒构建：将抗体Fab片段及pComb3xSS质粒分别用sfiⅠ酶酶切、回收。回收产物按照抗体Fab片段酶切产物与质粒酶切产物摩尔比＝3:1的比例混匀，加入T4 DNAligase，16℃连接过夜。

(7)文库构建：回收上步中连接产物。取1.5μL回收产物，加入40μL TG1感受态，混匀后转移至电转杯中电转，参数选择：Bac-Ec1。电转结束37℃活化培养1h，转移活化后的菌液至200mL2×YT培养基中，加入1/1000氨苄抗生素及终浓度为2％的葡萄糖溶液，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6。加入20倍菌数的辅助噬菌体M13K07。混匀后，置于37℃摇床中静止感染45min。离心15min收菌，用200mL 2×YT+Amp+Kana培养基重悬沉淀，30℃，220rpm摇菌14h进行phage扩增。第二天离心收上清，加入1/4体积20％ PEG6000沉降噬菌体，并用PBS重悬，得到噬菌体展示文库。

(二)利用噬菌体展示库淘选抗DSC2抗体

(1)偶联生物素的DSC2蛋白为靶标抗原，与SA磁珠一起孵育1h后，反应体系中加入1×10¹²个实施例1中获得的噬菌体，孵育1h，特异性的噬菌体被抗原捕获。用PBST(PBS+0.05％ Tween-20)清洗10次。

(2)结合抗原的磁珠加入TG1菌液中，37℃静置感染45min，之后37℃，220rpm活化培养1h。取适量静置感染后的菌液梯度稀释涂布氨苄平板，其余菌液加入葡萄糖(终浓度为2％)和1/1000氨苄抗生素，37℃，220rpm摇菌3h。

(3)向菌液中加入10μL M13K07，37℃静置感染45min。

(4)6000×g，离心10min，用10mL 2×YT+Amp+kana培养基重悬，30℃，220rpm，摇菌14h扩增噬菌体。第二天离心收上清，加入1/4体积20％PEG6000沉降噬菌体，并用PBS重悬，得到第一轮筛选的噬菌体。

(5)用第一轮筛选得到的噬菌体，重复步骤1～4，进行第2轮筛选。

(6)单克隆鉴定：第二轮筛选涂布平板中挑选单克隆于96孔深孔板中，过夜摇菌扩增噬菌体。

包板：DSC2抗原包被ELISA板，同时以BSA作为对照蛋白包板，4℃过夜。

封闭：第二天弃去包被液，PBST洗板3次，拍干，加入3％milk，37℃封闭2h。

一抗准备：96孔深孔板离心，取上清稀释于终浓度为1％milk中，混匀作为一抗备用。

一抗孵育：弃去封闭液，PBST洗板3次，拍干，加入一抗，37℃孵育2h。

二抗孵育：弃去一抗，PBST洗板5次，拍干，加入1:5000稀释的Anti-M13 Antibody(HRP)二抗，37℃孵育1h。弃去二抗，PBST洗板5次，拍干，加入显色底物显色，15min后加入终止液停止反应，酶标仪读数。

(7)挑选读值高(DSC2抗原孔OD值>3)且非特异性结合低(BSA对照蛋白孔OD值<0.5)的克隆送测序。

轻链测序引物：Bomp：5’>GTGTGGAATTGTGAGCGG<3’(SEQ ID NO.15)；

重链测序引物：Pelb：5’>ACCTATTGCCTACGGCAGCCG<3’(SEQ ID NO.16)。

测序得到一种包括抗原结合结构域的DSC2结合蛋白序列，重链可变区序列如SEQID NO.7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO.8所示，下划线部分为CDR序列：

SEQ ID NO.7：

QLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGFTFTSYWMNWLKQRPEQGLEWIGNIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSPEYGYFDVWGAGTTVTVSS

SEQ ID NO.8：

DIVMSQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPPTFGGGTKLEIK

进一步分析得到，所述抗原结合结构域包含以下轻链和重链CDR：

重链CDR：

VH-CDR1为SYWMN(SEQ ID NO.1)；

VH-CDR2为NIDPYDSETHYNQKFKD(SEQ ID NO.2)；

VH-CDR3为SPEYGYFDV(SEQ ID NO.3)；

轻链CDR：

VL-CDR1为KASQDVSTAVA(SEQ ID NO.4)；

VL-CDR2为SASYRYT(SEQ ID NO.5)；

VL-CDR3为QQHYSTPPT(SEQ ID NO.6)。

实施例2：抗DSC2重组单抗的表达纯化

测序获得候选抗体Fab区序列后进行基因合成：

载体选择pCDNA3.1质粒，以EcoRI+XhoI作为克隆位点，***重链基因片段。重链恒定区序列如SEQ ID NO.9所示，为鼠源序列；重链完整序列如SEQ ID NO.10所示。

载体选择pCDNA3.1质粒，以EcoRI+XhoI作为克隆位点，***轻链基因片段。轻链恒定区序列如SEQ ID NO.11所示，为鼠源序列；轻链完整序列如SEQ ID NO.12所示。

采用哺乳动物细胞293F表达体系表达。

(1)质粒抽提：基因合成的质粒分别转化TOP10感受态，活化1h后转移至200ml LB培养基中，37℃过夜培养，第二天提取质粒，得到相应的重链质粒和轻链质粒。

(2)转染前1天接种293F细胞于悬浮细胞培养瓶，控制细胞密度为1×10⁶个/mL。

(3)第二天将100μg重链表达质粒及200μg轻链表达质粒稀释于20mL转染buffer中轻轻混匀，加入1200μL PEI 4000轻轻混匀，室温孵育15分钟。逐滴加入细胞中，将细胞放入培养箱中，98rpm，37℃，5％ CO₂悬浮培养。

(4)6天后收集培养基上清，用rProtein G填料纯化IgG，0.1M Glycine(pH 3.0)洗脱，加入1M Tris(pH 8.5)进行中和。洗脱完成后用超滤离心管浓缩，经PBS缓冲液透析过夜，测定蛋白浓度，经SDS-PAGE验证其纯度。如图3。

实施例3：ELISA测定重组单抗与DSC2抗原的结合活性

(1)将DSC2蛋白(1μg/mL)包被在ELISA板上，同时包被BSA作为非特异性结合对照，4℃孵育过夜。

(2)弃去包被液，PBST洗3次，拍干，加入3％milk，37℃封闭2h。

(3)弃去封闭液，PBST洗3次，拍干，加入1μM起始3倍梯度稀释的抗体，37℃孵育1.5h。

(4)弃去一抗，PBST洗5次，拍干，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h。

(5)弃去二抗，PBST洗5次，拍干，加入显色底物显色，15min后加入终止液停止反应，酶标仪测OD值。

(6)以OD值为纵坐标，抗体摩尔浓度取对数作为横坐标，进行非线性拟合作图。如图4，抗体的EC50值约为1.3nM。

实施例4：免疫荧光染色测定重组单抗与过表达DSC2 293F细胞的结合

(1)质粒抽提：将基因合成DSC2过表达的质粒转化TOP10感受态，活化1h后转移至200ml LB培养基中，37℃过夜培养，第二天提取质粒，得到相应的DSC2过表达质粒。

(3)第二天将30μg DSC2过表达质粒稀释于2mL转染buffer中轻轻混匀，加入120μLPEI 4000轻轻混匀，室温孵育15分钟。逐滴加入细胞中，将细胞放入培养箱中，98rpm，37℃，5％ CO₂悬浮培养。

(4)2天后离心收集部分细胞后再用适当体积的PBS洗涤后重悬。

(5)加入终浓度2μg/mL的DSC2-Ab，4℃孵育1小时。

(6)孵育结束后，弃掉一抗，用PBS洗涤1次。

(7)按1:200稀释比例加入PE Goat Anti-Mouse IgG(H&L)荧光二抗，4℃孵育30min。

(8)孵育结束后，弃掉二抗，用PBS洗涤1次。将细胞转移到孔板里，在荧光显微镜下观察荧光情况，如图5。由图5可见，仅有过表达DSC2的293F细胞在荧光下可见，说明制得的抗体具有较好的特异性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种DSC2结合蛋白，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；所述轻链可变区包含互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3；

VH-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，VH-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，VH-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

VL-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，VL-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，VL-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的DSC2结合蛋白，其特征在于，所述DSC2结合蛋白的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根据权利要求1或2所述的DSC2结合蛋白，其特征在于，所述DSC2结合蛋白为完整抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；

优选地，所述抗体其余部分序列来源物种包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的DSC2结合蛋白，其特征在于，还包含恒定区；

优选地，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一的部分或全部恒定区的序列；

优选地，所述DSC2结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链恒定区；

优选地，所述DSC2结合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的轻链恒定区；

优选地，所述DSC2结合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.生物材料，其特征在于，包括多核苷酸、载体或细胞；

所述多核苷酸编码权利要求1～4任一项所述的DSC2结合蛋白；

所述载体携带所述多核苷酸；

所述细胞携带所述多核苷酸，或含有所述载体，或能够表达权利要求1～4任一项权利要求所述的DSC2结合蛋白。

6.DSC2结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括培养如权利要求5中所述的细胞；

优选地，所述细胞为将编码包括如权利要求1～4任一项所述的DSC2结合蛋白的多核苷酸转化至宿主细胞制得，所述的DSC2结合蛋白的多核苷酸包括重链表达质粒和轻链表达质粒，所述表达所述DSC2结合蛋白的细胞为将所述重链表达质粒和所述轻链表达质粒共转化至宿主细胞制得；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞；

优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞或CHO细胞，进一步优选为293F细胞。

7.权利要求1～4任一项所述的DSC2结合蛋白、或权利要求5所述的生物材料、或权利要求6所述的制备方法在如下(Ⅰ)～(IV)任意一项中的应用：

(Ⅰ)非诊断和治疗目的地检测DSC2或表达DSC2的细胞；

(Ⅱ)制备用于检测DSC2或表达DSC2的细胞的产品；

(Ⅲ)制备DSC2相关疾病的诊断产品；

(IV)DSC2蛋白或其蛋白突变体的纯化。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述DSC2相关疾病包括表达DSC2的癌症；

优选地，所述表达DSC2的癌症包括乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、***癌、胃癌和肝癌中的一种或多种。

9.DSC2检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的DSC2结合蛋白，和/或权利要求5所述的生物材料。

10.根据权利要求9所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括示踪标记物和/或固相载体；

所述示踪标记物包括酶、发光标记、荧光微球、彩色微球、乳胶微球、胶体金、量子点、生物素、链霉亲和素、放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属和光敏剂中的一种或多种；

所述固相载体包括微管、柱、微粒、硝酸纤维素膜、层析基质或侧流装置。