CN117187069B - 一种碱裂解工艺的大肠杆菌hcp检测方法 - Google Patents

一种碱裂解工艺的大肠杆菌hcp检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,包括制备碱裂解生产工艺的大肠杆菌HCP抗原,免疫动物获得针对大肠杆菌HCP的多克隆抗体和建立适用于大肠杆菌HCP检测的ELISA检测方法。运用以上方案建立的检测方法可以检测碱裂解工艺提取的质粒中间品、原液及终产品的大肠杆菌HCP残留量。验证结果显示抗大肠杆菌HCP特异性多克隆抗体覆盖率高,并且不会与CHO、293、Vero等宿主细胞蛋白产生交叉反应,灵敏度可达0.4ng/mL,因此该方法实现了高灵敏度和特异性的大肠杆菌HCP残留检测,使质粒载体生产符合GMP和临床应用的要求。

Description

一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法
技术领域
本发明涉及生物制品检测领域,具体为一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法。
背景技术
残留宿主蛋白(Host Cell Proteins,HCP)是来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分,HCP组成复杂,种类繁多,既包含细胞分泌蛋白,也包括结构蛋白,而且这些蛋白的理化性质,如等电点、疏水性、相对分子质量等具有显著差异。HCP的存在对于产品的安全性和功效可能产生影响,例如某些HCP可以引发生物制品的聚集或片段化,促进聚山梨酯的降解,产生含有降解产物的可见异物从而导致产品不稳定、疗效差等质量风险,此外一些HCP会引起病人的免疫应答或过敏性反应等安全风险,因此生物制品中HCP残留量被认为是产品的关键质量属性之一。在对工艺中HCP的监控和产品放行中,酶联免疫吸附试验(ELISA)一直被用作HCP检测的金标准,也是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法,该方法具有操作简便、快速、高通量等特点。HCP ELSIA检测的基本原理是基于HCP的多克隆抗体来识别并捕获样品中的HCP,采用双抗体夹心进行检测,因此ELISA方法高度依赖于试剂盒中HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率,然而不同基因背景以及不同工艺处理方式,可能改变细胞系的基因表达谱和HCP组分,通用型商业化试剂盒无法针对特定工艺和细胞系检出特异HCP,易带来漏检的风险,从而增加了生物制品安全风险。
质粒是一种闭合环状的双链超螺旋DNA分子,广泛应用于疫苗制备及细胞基因治疗(CGT)领域,如DNA疫苗、裸质粒基因载体、腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体等。通常质粒是以大肠杆菌为宿主进行生产,最有代表性的宿主菌是由大肠杆菌K-12所衍生出的DH5a、Stbl3、Top10等菌株。在质粒的生产及纯化过程可能会存在大肠杆菌宿主细胞蛋白(大肠杆菌HCP)残留的污染,这些残留HCP会给质粒后续应用带来风险,如降低治疗药物的疗效,并导致不良的毒性或免疫反应,因此要对大肠杆菌HCP的残留量进行控制。不同于常规的使用大肠杆菌表达重组蛋白的工艺过程,质粒的生产纯化最常用工艺是碱裂解工艺,不同于机械裂解的方法,基于大肠杆菌碱裂解工艺过程得到的大肠杆菌HCP是一种变性蛋白,HCP表位发生了巨大变化,与通用型的大肠杆菌HCP检测试剂盒中所用的HCP抗体和标准品相比差异大,通用型的检测试剂盒检测值偏低,对质粒载体的质粒控制产生了巨大挑战。因碱裂解生产工艺的特殊性,迄今为止仍没有基于碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:
一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,包括以下步骤:
S1.碱裂解工艺的大肠杆菌HCP的制备,
S11.培养大肠杆菌获得菌体,
S12.将步骤S11获得的菌体进行碱裂解,具体裂解过程如下,
P1溶液:50mM葡萄糖,25mM Tris-Cl,10mM EDTA,pH8.0重悬步骤S11获得的菌体,P2溶液:0.2M NaOH,1%SDS,pH12.5裂解P1溶液产物, P3溶液:3M醋酸钾,5M醋酸沉淀P2溶液产物,收集P3溶液上清液作为碱裂解产物,
S13.将步骤S12中的碱裂解产物进行超滤浓缩,制得大肠杆菌HCP抗原;
S2.制备兔抗大肠杆菌HCP抗体,
S21.第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔,大肠杆菌HCP抗原为5mg,
S22.第14/28/42/56天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔,大肠杆菌HCP抗原为2.5mg,
S23.第63天采血离心,收集抗血清纯化,制得兔抗大肠杆菌HCP抗体;
S3.抗大肠杆菌HCP抗体生物素标记,
使用NHS-dPEG12-生物素,对步骤S2中制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体进行生物素标记,制备兔抗大肠杆菌HCP生物素化抗体;
S4.大肠杆菌HCP ELISA检测方法建立,
S41.包被:将步骤S23中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体用pH7.4、0.01M PBS缓冲液,稀释成1μg/mL~8μg/mL进行包被,每孔加100μL,然后用封板膜封口,置于4℃包被过夜,
S42.封闭:甩干除去包被液,300μL由1×PBS+0.05% Tween 20组成的洗涤液洗涤一次,每孔加入300μL由1%BSA+PBS组成的封闭液,室温孵育2小时,甩干除去封闭液,过夜吹干,
S43.结合抗原:将由步骤S13制得的大肠杆菌HCP抗原作为校准品和待测样本分别加入相应孔中,100μL/孔,用封板胶纸封住反应孔,37℃振荡孵育60分钟,
S44.检测抗体孵育:倾倒掉步骤S43中的板孔溶液,用洗涤液清洗后,加入用稀释缓冲液以1:10000~20000稀释的5.6mg/mL生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合,50μL/孔,37℃振荡孵育1小时,
S45.倾倒掉步骤S4中的板孔溶液,用洗涤液清洗后,向每孔加入100μL用稀释缓冲液以1:46000稀释的1mg/mL链霉亲和素标记辣根过氧化物酶,37℃振荡孵育1小时,
S46.加入TMB显色底物100μL/孔,25℃避光孵育15分钟,
S47.每孔加入100μL 1M HCl终止液,终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值,
S48.以大肠杆菌HCP校准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,用四参数拟合方程绘制校准曲线,根据校准曲线和待测样本的OD计算待测样本浓度。
优选的,所述步骤S41中,将所述步骤S23中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体用pH7.4、0.01M PBS缓冲液,稀释成4μg/mL进行包被。
优选的,所述步骤S43中的校准品的选取浓度为250.0、100.0、40.0、16.0、6.4、2.6、1.0、0ng/mL。
优选的,所述步骤S44中,加入用稀释缓冲液以1:20000稀释的5.6mg/mL生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合。
优选的,其特征在于,所述步骤S44和S45所用的稀释缓冲液由0.01M PBS、0.05%Tween 20和0.1%BSA组成。
与现有技术相比,本发明所达到的有益效果是:本发明提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,包括制备碱裂解生产工艺的大肠杆菌HCP抗原,免疫动物获得针对大肠杆菌HCP的多克隆抗体和建立适用于大肠杆菌HCP检测的ELISA检测方法。运用以上方案建立的检测方法可以检测碱裂解工艺提取的质粒中间品、原液及终产品的大肠杆菌HCP残留量。验证结果显示抗大肠杆菌HCP特异性多克隆抗体覆盖率高,并且不会与CHO、293、Vero等宿主细胞蛋白产生交叉反应,灵敏度可达0.4ng/mL,因此该方法实现了高灵敏度和特异性的大肠杆菌HCP残留检测,使质粒载体生产符合GMP和临床应用的要求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为大肠杆菌HCP SDS-PAGE考马斯亮蓝染色;
图2为兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体SDS-PAGE考马斯亮蓝染色;
图3为本发明大肠杆菌HCP ELISA检测试剂盒的校准曲线图;
图4为Western Blot检测兔抗大肠杆菌HCP抗体与质粒样本中大肠杆菌HCP的反应条带。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
实施例中所用到的试剂如下:
大肠杆菌DH5α(保藏中心:CGMCC,菌种编号:1.12873);
M9培养基(厂家:北京酷来搏,货号:SL0060);
3kD RC 0.11m2超滤膜包(厂家:Cobrtter,规格:UFCLA0003010P);
梯度胶(厂家:常州天地人和,货号:SLE0115);
考马斯亮蓝快速染液(厂家:北京天根,货号:PA101);
耐碱蛋白A亲和层析柱(厂家:博格隆,货号AA402311);
BCA蛋白定量试剂盒(厂家:赛默飞,货号:23227);
羊抗兔IgG多抗-HRP(厂家:华鼎生物,货号:30005);
TMB显色底物(厂家:KPL,货号:5420-0027);
NHS-dPEG12-生物素(厂家:西格玛Sigma,货号:QBD10198);
NHS预活化的琼脂糖微球(天地人和,SA083100);
液相色谱仪(厂家:赛默飞,型号:Easy-nLC 1000);
考马斯亮蓝定量试剂盒(厂家:赛默飞,型号:23236);
链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)(厂家:博莱莎,货号:BL-SH001A);
弗氏完全佐剂(厂家:赛默飞,货号:77140);
弗氏不完全佐剂(厂家:赛默飞,货号:77145);
10kD超滤管(厂家:默克密理博,货号:UFC9010);
CHO、293T、Vero HCP(厂家:塞纳生物Cygnus,货号:F018H,F653H,F503H);
经典碱裂解法质粒提取试剂盒(厂家:天根,货号:DP116);
HiTrap脱盐柱(厂家:思拓凡Cytiva,货号:29048684);
以下ELISA检测方法所用反应板为:96孔酶标板,(厂家:康宁costar,货号:42592)。
实施例1:大肠杆菌HCP抗原制备与纯化
利用大肠杆菌DH5α,制备大肠杆菌HCP,通过离心、超滤、浓缩及换液,制备用于动物免疫的大肠杆菌HCP抗原。
1.大肠杆菌培养
用大肠杆菌DH5α构建三级菌株库(种子菌株库、主菌株库、工作菌株库),将工作菌株划线37℃过夜培养,次日挑单克隆菌落接种至LB培养基,37℃、200rpm过夜培养,过夜培养菌液按1:50接种至M9培养基中,置于恒温摇床中37℃、200rpm培养16小时,12000rpm离心5分钟收集菌体。
2.大肠杆菌碱裂解
将上述培养获得菌株的菌体100g置于5L烧杯,加入2L P1溶液(50mM葡萄糖,25mMTris-Cl,10mM EDTA,pH8.0)于磁力搅拌器上搅拌使菌体完全混匀;加入2L P2裂解液(0.2MNaOH,1%SDS,pH12.5)温和的搅拌3分钟,使菌体完全裂解,此时菌液变的澄清透亮;加入2L的P3溶液(3M醋酸钾,5M醋酸)立即温和地搅拌2分钟,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。将上述混合溶液分装,4℃、12000rpm离心10分钟,收集上清液。
3.大肠杆菌HCP超滤浓缩换液
使用3kD RC 0.11m2超滤膜包对上述混合碱裂解液进行浓缩换液,6L裂解液浓缩至300mL,然后进行PBS缓冲液超滤换液,大肠杆菌碱裂解液换液至300mL PBS缓冲液中,最后用PBS缓冲液稀释至蛋白浓度2mg/mL,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装后-80℃保存;制得大肠杆菌碱裂解宿主蛋白。
4.SDS-PAGE检测大肠杆菌HCP抗原条带
将上述制备的碱裂解大肠杆菌HCP用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法检测HCP的条带分布,选用的胶为4%~20%的梯度胶。样本与5×SDS上样缓冲液按照4:1混匀,95℃加热15分钟,上样体积为10μL。将凝胶连同玻璃板放入电泳槽中,先在100V恒定电压电泳,直至样本进入分离胶。之后改用180V恒定电压,直至溴酚蓝染料跑出胶外。电泳后凝胶用纯化水清洗干净,放入塑料平皿中。使用考马斯亮蓝快速染液,按照说明书方法进行染色。凝胶成像仪拍照分析,结果见图1。
图1结果表明:碱裂解大肠杆菌HCP条带分布均匀,目测检出超过30条蛋白带,显示宿主蛋白谱具备多样性,能较全面地反映大肠杆菌HCP残留情况。
实施例2:抗大肠杆菌HCP抗体制备及纯化
利用实施例1中的大肠杆菌HCP抗原免疫新西兰白兔,制备大肠杆菌HCP抗血清,利用蛋白A纯化抗血清制备抗体。
1.动物免疫
取9只新西兰白兔进行动物免疫,分别进行5次免疫,采用抗原与佐剂等体积混合,乳化采用注射器混合法:将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内,两注射器之间以鲁尔接头相连,排净空气,然后交替推动针管,直到充分乳化(油包水状态)。乳化充分后,采用背部皮下注射6-8点方式免疫兔子。
具体免疫程序为:1.初次免疫之前先取血清1mL,作为免疫前阴性血清对照;2.初次免疫(0天,弗氏完全佐剂),抗原为5mg实施例1制备的大肠杆菌HCP;3.二免至五免(14/28/42 /56天,弗氏不完全佐剂),抗原为2.5mg实施例1制备的大肠杆菌HCP;三免之后,免疫后7天每只实验兔都需要采取1mL血清,进行效价检测,实时监控血清效价。第五次免疫之后的第7天处死实验兔,采血离心,收集抗血清,最终的5免之后的血清效价见表1。将9只兔的抗血清混合,用于制备抗大肠杆菌HCP抗体。
预实验最初使用的剂量为常规剂量0.4mg左右,但都不能实现本技术方案,5mg/mLHCP和2.5mg/mL是经过预实验摸索而来,能够有效增强最终的HCP抗体的免疫效价,可能是因为,一般的单一蛋白作为抗原初次免疫兔的剂量是0.4mg,由于HCP是近千种蛋白混合物,如果免疫剂量少HCP内的单一蛋白浓度低可能导致最终免疫效果弱。
表1终次免疫后兔抗大肠杆菌HCP血清效价
2.兔抗大肠杆菌HCP抗体纯化及定量
兔抗血清中加入结合缓冲液(20mM Na2HPQ4,0.3M NaCl,pH7.0)稀释5倍,充分混匀,用耐碱蛋白A亲和层析柱层析进行纯化,最后用0.1M、pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱,即得到兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体。利用BCA蛋白定量试剂盒对纯化的兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体进行定量,定量结果为6mg/mL。
将上述制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法检测抗体纯度,具体方法见实施案例1中HCP条带检测,结果经凝胶成像仪拍照分析,见图2。其中第1泳道为蛋白Marker,第2泳道为纯化后免疫血清,第3泳道为兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体 pAb3.75μg,第4泳道为兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体 pAb 7.5μg,第5泳道为BSA。图2结果表明:经过灰度分析,兔抗大肠杆菌HCP抗体纯度(重链+轻链)达95%以上。
实施例3:抗大肠杆菌HCP抗体效价测定、标记及抗体覆盖率测定
1.抗大肠杆菌HCP抗体效价测定
利用实施例1制备的大肠杆菌HCP,实施例2获得的兔抗大肠杆菌HCP抗体和羊抗兔IgG多抗-HRP进行ELISA效价检测。
(1)包被:将实施例1制备的大肠杆菌HCP抗原用包被缓冲液(0.01M PBS缓冲液,pH7.4)稀释至1μg/mL,每孔加100μL,4℃包被过夜,甩干除去包被液,300μL 1×洗涤液(1×PBS+0.05%Tween 20)溶液洗涤一次;
(2)封闭:每孔加入300μL封闭液(1%BSA+PBS),室温孵育2小时,甩干除去封闭液,300μL 1×洗涤液洗涤一次;
(3)抗体孵育:将实施例2制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体用稀释缓冲液(0.01M PBS,0.05%Tween 20,0.1%BSA)稀释至1mg/mL,再依次梯度倍比稀释。每孔加入100uL,于37℃孵育1小时,甩干除去抗体溶液,300μL 1×洗涤液洗涤5次;
(4)向每孔加入用稀释缓冲液以1:20000稀释的1mg/mL的羊抗兔IgG多抗-HRP,于37℃孵育1小时,甩干除去抗体溶液,300μL 1×洗涤液洗涤5次;
(5)加入TMB显色底物100μL/孔,37℃避光孵育15分钟;
(6)每孔加入100μL 1M HCl终止液,终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值,并计算抗体效价,抗体效价值如表2所示。检测结果如表2所示,结果表明抗血清效价大约在1:1280000左右。
表2动物抗体效价测定
2.抗大肠杆菌HCP抗体生物素标记
使用NHS-dPEG12-生物素,对实施例2中制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体进行生物素标记,制备兔抗大肠杆菌HCP生物素化抗体(Biotin-Rabbit Anti 大肠杆菌HCP Ab)。
制备方法如下:
(1)抗体超滤换液:取10mL实施例2制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体加入15mL 10KD超滤管超滤换液,换液3次,最后添加PBS缓冲液至10mL;
(2)按需取66.7μL 100mM NHS-dPEG12-生物素储存液平衡至室温,加入600.3μL超纯水稀释至10mM;
(3)取10mL步骤(1)超滤好的兔抗大肠杆菌HCP抗体(6mg/mL)加入到15mL离心管中,然后将667μL 10mM NHS-dPEG12-生物素加入离心管,15mL离心管置于旋转混合仪上,室温下孵育120分钟;
(5)透析袋预处理:按需裁剪合适大小的透析袋,先用含1mM EDTA-2Na的2%碳酸氢钠溶液煮沸10分钟,然后用1mmol/L EDTA,煮沸10分钟,最后于蒸馏水漂洗;
(6)将标记好的兔抗大肠杆菌HCP抗体加入到透析袋中,两端用透析袋夹夹紧,防止漏液,置于2L 1× PBS缓冲液中,搅拌透析过夜;
(7)搅拌透析过夜后,换液继续透析10小时,将标记好的兔抗大肠杆菌HCP抗体定量5.6mg/mL分装,加入50%甘油-20℃冰冻保存。
3.抗大肠杆菌HCP抗体覆盖率测定
以实施例1中的大肠杆菌HCP抗原以及实施例2获得的兔抗大肠杆菌HCP抗体为材料,采用免疫亲和层析-液相质谱分析技术(AAE-MS)进行兔抗大肠杆菌HCP抗体的覆盖率验证。
具体实验方法如下:
(1)抗体偶联NHS活化琼脂糖微球(NHS-Activated LA Beads):按照说明书将实施例2制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体偶联在NHS预活化的琼脂糖微球上,并用1M Tris-Cl进行封闭。
(2)抗体亲和纯化大肠杆菌HCP:将大肠杆菌HCP与抗体偶联后的琼脂糖微球混合后室温孵育2小时,孵育完成后,用移液器将琼脂糖微球加入层析柱中,收集流穿液,反复三次,至琼脂糖微球完全加入。层析柱顶端压入密封塞,装好柱之后,将层析柱连接蛋白纯化仪,用平衡缓冲液洗涤层析柱,直到UV线降到0。取下层析柱,拆除顶端密封塞,等待柱中平衡液流干,立即加入1.5mL 0.1M甘氨酸(pH3.0)孵育5分钟后,收集洗脱缓冲液,立即加入Tris-HCl(pH8.5)将其调至pH7.4,即为AAE-大肠杆菌HCP。利用BCA蛋白定量试剂盒对上述制备的AAE-大肠杆菌HCP进行定量,定量结果为1.8mg/mL。
(3)大肠杆菌HCP及AAE-大肠杆菌HCP样本LC-MS分析:
(a)样本酶解:分别将50μg的大肠杆菌HCP和AAE-大肠杆菌HCP样品转移到新的EP管中,并用50mM NH4HCO3调整至最终体积为100μL。加入DTT溶液使其终浓度为10mmol/L,于56℃水浴中还原1小时。加入IAM溶液使其终浓度为50mmol/L,避光反应40分钟。加入6个体积(约600μL)的预冷的(-20℃)丙酮并在-20℃下冷冻。使沉淀冷冻过夜。在4℃下以8000×g离心样品10分钟。小心倒转EP管,倒出丙酮,保留白色沉淀。让沉淀干燥2~3分钟。用100μL50mM NH4HCO3重溶蛋白质沉淀。加入1μg胰蛋白酶,在37℃下酶切样品过夜。酶切后肽段使用HiTrap脱盐柱脱盐,于45℃真空离心浓缩仪(Eppendorf,Concentrator plus)中挥干溶剂。
(b)液相色谱:设置液相色谱条件,分析柱:150μm i.d.×150mm,packed withAcclaim PepMap RPLC C18,3μm,100A;流动相A:0.1%甲酸;流动相B:0.1%甲酸,80%ACN;流速:600nL/分钟;每个组分分析时间:120分钟。
(c)质谱分析:
一级质谱参数(Thermo Fisher,Orbitrap Exploris™ 240 MassSpectrometer):分辨率:120000,自动增益控制目标:300,最大IT:45毫秒,扫描范围:350至1500m/z;
二级质谱参数:分辨率:15000,自动增益控制目标:100,最大IT:22毫秒。
(d)质谱原始文件使用Maxquant(1.6.2.10)软件检索目标蛋白数据库,设置检索参数如下:固定修饰(Fixed modifications):半胱氨酸经碘乙酰胺(Carbamidomethyl)(C);可变修饰(Variable modifications):氧化(Oxidation)(M);乙酰化(Acetyl);酶(Enzyme):胰蛋白酶;数据库名称:Escherichia coli (species)_reviewed;遗漏酶切位点(Maximum Missed Cleavages):2;一级质谱误差(Peptide Mass Tolerance):20ppm;二级质谱误差(Fragment Mass Tolerance):20ppm;肽段/碎片离子质量数(Mass values):Monoisotopic(单同位素);显著性阈值(Significance threshold):0.01。
(4)数据分析:
根据最终的LC-MS分析数据检索蛋白数目,大肠杆菌HCP样本中共含有1023种大肠杆菌宿主蛋白,AAE-大肠杆菌HCP样本中共含有1095种大肠杆菌宿主蛋白,其中两个样本共有的蛋白数目为820种。根据抗体覆盖率计算公式:与多克隆抗体特异性结合的蛋白的数量A、HCP样品中的蛋白的数量B、两样本都含有的蛋白数量C;并根据公式:A/(A+B-C)得到兔抗大肠杆菌HCP多克隆抗体的覆盖率为(820+275)/(820+275+203)=84.4%。
实施例4:大肠杆菌HCP ELISA检测方法建立和应用于碱裂解大肠杆菌HCP残留检测试剂盒
1.大肠杆菌HCP量值溯源方法建立
使用考马斯亮蓝法定量方法对实施例1中制备的大肠杆菌HCP进行定量,制备大肠杆菌HCP残留检测试剂盒内的校准品。
制备方法如下:
(1)将实施例1中制备的大肠杆菌HCP抗原用PBS缓冲液稀释到1mg/mL,进行分装,然后冻干制备成大肠杆菌HCP参考品;
(2)大肠杆菌HCP参考品加入TBS缓冲液稀释500倍,制备大肠杆菌HCP校准品,并用考马斯亮蓝定量试剂盒进行定量,通过绘制每个浓度的BSA标准品在595nm处测量的OD值及其浓度(μg/mL),绘制四参数拟合曲线,用校准曲线计算大肠杆菌HCP样品的蛋白浓度、CV及回收率;
(3)根据上一步的定量的浓度计算分装250ng大肠杆菌HCP校准品所需要的体积,并按照此体积用电动移液器进行吸液分装到校准品保存管中,分装好之后,加入校准品冻存液;
(4)分装之后的校准品(250ng/管),置于-70℃超低温冰箱冷冻2~3小时,冷冻之后立即置于真空冷冻干燥机,选择“ 冻干”程序,进行真空冻干,两天后从冻干机中取出冻干的校准品,立即旋转好帽盖,贴上标签,置于-20℃保存。
2.双抗体夹心法测定大肠杆菌HCP抗体配对
将上述制备的大肠杆菌HCP校准品和实施例2中制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体以及实施例3中新鲜制备的生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体摸索ELISA包被抗体浓度和检测抗体浓度,建立ELISA检测方法。
建立过程如下:
(1)包被:将纯化兔抗大肠杆菌HCP抗体用包被缓冲液稀释成8μg/mL,4μg/mL,2μg/mL,1μg/mL分别进行包被(具体包被位置见表3),每孔加100μL,然后用封板膜封口,置于4℃包被过夜;
(2)封闭:甩干除去包被液,300μL1×洗涤液洗涤一次,每孔加入300μL封闭液(1%BSA+PBS),室温孵育2小时,甩干除去封闭液,冻干间16~25℃过夜吹干;
(3)结合抗原:用稀释缓冲液将大肠杆菌HCP校准品进行稀释至250ng/mL、100ng/mL、1ng/mL、0ng/mL备用,倾倒掉封闭液,用1×洗涤液清洗5次,每次加洗涤液300μL,甩干,并在滤纸上倒扣拍干,清洗后加入稀释好后的大肠杆菌HCP校准品进行结合,100μL/孔,37℃振荡孵育1小时(具体结合梯度位置详见表3);
(4)检测抗体孵育:用稀释缓冲液将实施例3中新鲜制备的生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体分别稀释至10000×,20000×备用,倾倒掉抗原溶液,用1×洗涤液清洗5次,每次加洗涤液300μL,甩干,并在滤纸上倒扣拍干,清洗后加入稀释好后的生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合,50μL/孔,37℃振荡孵育1小时(具体结合梯度位置详见表3);
(5)倾倒掉检测抗体工作液,用1×洗涤液清洗5次,每次加洗涤液300μL,甩干,并在滤纸上倒扣拍干。向每孔加入用稀释缓冲液以1:46000稀释的1mg/mL链霉亲和素标记辣根过氧化物酶,37℃振荡孵育1小时;
(6)加入TMB显色底物100μL/孔,25℃避光孵育15分钟;
(7)每孔加入100μL 1M HCl终止液,终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值。
抗体搭配检测结果见表3,根据检测数据确定包被抗体浓度为4μg/mL,生物素标记的检测抗体最适稀释比例为20000×。
表3.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒包被抗体浓度及检测抗体浓度摸索结果
3.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒校准曲线的相关性
根据上述确定的最佳包被抗体和检测抗体的工作浓度,在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下,将大肠杆菌HCP校准品按一定比例(2.5倍)稀释7个浓度梯度,每个浓度作3复孔,以尽可能减少实验操作误差的干扰。按照上述抗体配对的方法在同一块板条上ELISA检测获得检测反应值,并以此绘制校准曲线。校准品浓度及对应的反应值如表4所示。
以校准品的校准值和测量OD值为X、Y轴进行四参数拟合,绘制校准曲线,如图3所示。经计算相关系数R2,R2≥0.999,可信度高;校准曲线各点的复孔之间OD值差异很小,变异系数(CV)均小于10%,检测浓度的回算值CV≤15%,回算浓度与理论浓度的偏差≤15%;定量上下限浓度检测值偏差≤20%。
表4.校准曲线四参数拟合结果分析
实施例5:大肠杆菌HCP ELISA试剂盒性能验证
1.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒定量下限分析
选校准曲线最高浓度(250ng/mL)和最低浓度(1.0ng/mL)为定量限,采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一块板条上重复ELISA检测两个浓度11次,根据试剂盒所获得的校准曲线和待测样本的OD计算待测样本浓度,并与理论浓比较,计算CV和偏差,结果如表5所示。250ng/mL和1.0ng/mL这两个校准点的浓度检测值的偏差均≤20%,CV≤15%。
表5.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒定量限检测结果
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2.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒检测下限分析
采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一块板条上重复ELISA检测“0ng/mL”稀释缓冲液15次,取其OD均值+3SD的检测值的回算浓度为试剂盒的检测下限,结果如表6所示,试剂盒检测下限不高于0.4 ng/mL。
表6.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒检测下限结果分析
3.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒精密度分析
采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一ELSIA块板条上重复检测3个浓度(100ng/mL,16ng/mL,2.6ng/mL)11次,计算批内CV;在不同批次ELSIA板条上重复检测3个浓度(100ng/mL,16ng/mL,2.6ng/mL)11次,计算批间CV,结果如表7和表8所示。100.0ng/mL,16ng/mL及2.6ng/mL的大肠杆菌HCP样品回算浓度批内CV均≤10%,批间CV均≤15%,因此本大肠杆菌HCP ELISA试剂盒批内差小于15%,批间差小于20%。
表7.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒批内变异系数结果分析
表8.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒批内变异系数结果分析
4.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒准确度分析
以实施例1中的大肠杆菌HCP制备高低两种质控品,质控品终浓度分别为50ng/mL和5ng/mL。采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一ELSIA块板条上检测高、低质控品,每个样本进行3复孔检测,根据实验所获得的校准曲线和待测样本的OD计算待测样本浓度,并与理论浓度进行比较,计算偏差结果如表9所示。同时用质控品进行加标回收实验,1/2浓度的高、低质控品分别加标16ng/mL,2.6ng/mL的校准品,每个样本进行3复孔检测,计算各样本的回算浓度值和加标回收率,加标回收率结果如表10所示。
偏差实验结果表明,高、低质控品的偏差均在±15%以内;高、低质控品的加标回收率分别为97%和81%,加标回收率在80%~100%之间。偏差实验和加标实验说明本试剂盒具有很好的准确度。
表9.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒偏差分析结果
表10.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒加标回收分析结果
5.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒特异性分析
以纯化后的Vero、293T和CHO的HCP作为待测样本,采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一ELSIA块板条上检测,用来评估大肠杆菌HCP ELISA试剂盒的特异性。分别取500ng/mL的CHO、293T、Vero HCP进行3复孔检测,同时进行加标回收实验(分别加标16ng/mL大肠杆菌HCP),结果如表11所示。
实验结果表明500ng/mL的CHO、293T、Vero HCP样品检测的大肠杆菌HCP浓度低于试剂盒检测下限,且回收率均大于90%,CHO细胞、293T细胞、Vero宿主细胞蛋白对ELISA反应的干扰程度非常小,与试剂盒之间无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性,能特异性的与大肠杆菌HCP反应。
表11.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒特异性分析
实施例6:HCP检测方法在质粒载体生产中的应用
在实施例2中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体以及实施例4中建立的ELISA检测方法基础上,将该方法应用于碱裂解工艺质粒样本的大肠杆菌宿主残留蛋白的检测,用来评估质粒样本中大肠杆菌HCP浓度。
选取实施例1制备的大肠杆菌HCP抗原以及经典碱裂解法质粒提取试剂盒提取的质粒,用实施例2中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体作为一抗,羊抗兔IgG多抗-HRP作为二抗进行蛋白质印迹检测。检测结果如图4所示,抗原抗体反应条带能覆盖绝大部分的大肠杆菌HCP抗原(条带4,6,8)和质粒样本(条带2)条带,且显色强度与抗原上样量成正比,表明兔抗大肠杆菌HCP抗体能与HCP抗原发生特异性反应。
以经典碱裂解法试剂盒提取的质粒作为待测样本,采用实施例4中建立的ELISA方法和试剂盒,在同一ELSIA块板条上检测,用来评估质粒样本中大肠杆菌HCP浓度,同时进行加标回收实验(分别加标16.5、6.8、1ng/mL大肠杆菌HCP)。结果如表12所示,实验结果表明质粒样品检测的大肠杆菌HCP终浓度104ng/mL,回收率均在90%-130%之间,且质粒样本稀释10倍,20倍,80倍稀释线性均在90%以上,说明试剂盒对实际样本检测效果良好,能准确报告样本检测值。
表12.大肠杆菌HCP ELISA试剂盒实际样本检测分析
综上所述,我们创新地使用碱裂解工艺的方法制备和纯化针对大肠杆菌的HCP抗原,并成功建立了ELISA夹心法,用于检测质粒载体中的大肠杆菌HCP残留。该方法特异性好,不与其他种属来源HCP发生交叉反应,灵敏度高,最低检测限达到0.4ng/mL,准确性好,模拟样本和实际质粒样本的加标回收率在80-130%范围内。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.碱裂解工艺的大肠杆菌HCP的制备,
S11.培养大肠杆菌获得菌体,
S12.将步骤S11获得的菌体进行碱裂解,具体裂解过程如下,
P1溶液:50mM葡萄糖,25mM Tris-Cl,10mM EDTA,pH8.0,重悬步骤S11获得的菌体,P2溶液:0.2M NaOH,1%SDS,pH12.5,裂解P1溶液产物, P3溶液:3M醋酸钾,5M醋酸,沉淀P2溶液产物,收集P3溶液上清液作为碱裂解产物,
S13.将步骤S12中的碱裂解产物进行超滤浓缩,制得大肠杆菌HCP抗原;
S2.制备兔抗大肠杆菌HCP抗体,
S21.第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔,大肠杆菌HCP抗原为5mg,
S22.第14/28/42/56天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔,大肠杆菌HCP抗原为2.5mg,
S23.第63天采血离心,收集抗血清纯化,制得兔抗大肠杆菌HCP抗体;
S3.抗大肠杆菌HCP抗体生物素标记,
使用NHS-dPEG12-生物素,对步骤S2中制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体进行生物素标记,制备兔抗大肠杆菌HCP生物素化抗体;
S4.大肠杆菌HCP ELISA检测方法建立,
S41.包被:将步骤S23中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体用pH7.4、0.01M PBS缓冲液,稀释成1μg/mL~8μg/mL进行包被,每孔加100μL,然后用封板膜封口,置于4℃包被过夜,
S42.封闭:甩干除去包被液,300μL由1×PBS+0.05% Tween 20组成的洗涤液洗涤一次,每孔加入300μL由1%BSA+PBS组成的封闭液,室温孵育2小时,甩干除去封闭液,过夜吹干,
S43.结合抗原:将由步骤S13制得的大肠杆菌HCP抗原作为校准品和待测样本分别加入相应孔中,100μL/孔,用封板胶纸封住反应孔,37℃振荡孵育60分钟,
S44.检测抗体孵育:倾倒掉步骤S43中的板孔溶液,用洗涤液清洗后,加入用稀释缓冲液以1:10000~20000稀释的5.6mg/mL生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合,50μL/孔,37℃振荡孵育1小时,
S45.倾倒掉步骤S4中的板孔溶液,用洗涤液清洗后,向每孔加入100μL用稀释缓冲液以1:46000稀释的1mg/mL链霉亲和素标记辣根过氧化物酶,37℃振荡孵育1小时,
S46.加入TMB显色底物100μL/孔,25℃避光孵育15分钟,
S47.每孔加入100μL 1M HCl终止液,终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值,
S48.以大肠杆菌HCP校准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,用四参数拟合方程绘制校准曲线,根据校准曲线和待测样本的OD计算待测样本浓度。
2.根据权利要求1所述的一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,其特征在于,所述步骤S41中,将所述步骤S23中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体用pH7.4、0.01M PBS缓冲液,稀释成4μg/mL进行包被。
3.根据权利要求1所述的一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,其特征在于,所述步骤S43中的校准品的选取浓度为250.0、100.0、40.0、16.0、6.4、2.6、1.0、0ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,其特征在于,所述步骤S44中,加入用稀释缓冲液以1:20000稀释的5.6mg/mL生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合。
5.根据权利要求1所述的一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法,其特征在于,所述步骤S44和S45所用的稀释缓冲液由0.01M PBS、0.05%Tween 20和0.1%BSA组成。
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