CN111965295A - 一种基于液质联用技术验证的dna编码苗头化合物的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液质联用技术验证的DNA编码苗头化合物鉴定方法,包括根据筛选后数据分析得到的DNA编码苗头化合物,遵循DNA编码化合物库分子合成的策略进行重新合成,重合成的DNA编码苗头化合物与靶点亲和孵育后,利用高分辨质谱***对于洗脱产物进行分子量鉴定,从而达到发现准确结合分子的目的。采用本发明的鉴定方法,可以准确、快速、实时地发现与靶点发生亲和作用的DNA苗头化合物分子,为后续先导化合物的优化和修饰提供结合活性的数据支持,使DNA编码化合物苗头化合物的合成、筛选和鉴定的过程标准化,定量化,精确化,通量化。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选领域,具体涉及DNA编码苗头化合物的鉴定方法,尤其涉及一种基于液质联用验证的DNA编码苗头化合物的鉴定方法。
背景技术
DNA编码化合物(DNA encoded Library,DEL)作为新型先导药物发现的重要手段,正逐步发展为药物发现的重要推动力。DEL的优势在于短时、高效地完成上亿级别的分子库构建和筛选,在新药发现中展现出时间优势和成本优势。现有鉴定DNA编码苗头化合物的方式是根据测序结果拆解DEL序列,并对应至相应的分子砌块的组合信息。依据生物信息学计算DEL的富集值,根据富集值的排序确定高可信度的靶点结合DNA编码苗头化合物。然而,DEL的合成是通过组合化学的方式在短时内获得大量的分子,在化学反应的过程中,考虑到节省反应原料与反应时间,中间产物的残留与副产物的生成无法在每一步的合成完毕后被纯化去除,因此DEL的最终产物包含了合成路线所生成的所有分子。这些分子在于靶点蛋白孵育的过程中,均有相等的几率与靶点蛋白发生结合。通过洗脱后再次与靶点蛋白孵育等2-3次循环,将最终洗脱产物进行定量,扩增,测序。测序后数据通过拆解与翻译以获得结合分子的信息,并通过生物信息学的方法计算获得高富集度的分子排序。此后,高富集度分子将去除DNA序列,重新设计反应路线以获得单纯化学小分子产物并进行后续与靶点蛋白的结合力检测及功能验证。
然而,通过测序及生物信息学所获得的高富集度分子,是基于DNA编码的全长序列分析而获得的。DEL合成中的中间产物与副产物,其DNA端仍可以通过连接获得完整的DNA链信息,因此,针对合成路线中的某一DEL分子,其最终产物,中间产物与副产物都被标记了同一条DNA序列的信息,在筛选,测序直至数据分析结束后,都不能定位与区别与靶点蛋白精确结合的DEL分子。
目前,尚未发现有效的方法可以鉴定与靶点蛋白精确结合的潜在DNA苗头化合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种DNA编码苗头化合物鉴定方法,能够精确鉴定出与靶点蛋白结合的DNA苗头化合物,避免依赖纯化学分子砌块耗时繁琐的鉴定流程,同时解决了潜在DNA苗头化合物从DNA标记向纯化学合成分子盲目转化的问题,有效提高了DNA苗头化合物的鉴定效率,降低DNA苗头化合物的鉴定成本。
为解决上述技术问题,本发明利用高分辨质谱对于重新合成的潜在DNA编码化合物进行亲和筛选并鉴定,可适用于DEL筛选数据分析后的化合物亲和鉴定。
本发明采用的技术方案是:
一种基于液质联用技术验证的DNA编码苗头化合物鉴定方法,包括如下步骤:
(1)DNA编码苗头化合物的合成:针对靶点蛋白DNA筛选数据分析的结果,确定与靶点蛋白结合的富集DNA编码化合物,按照其富集计算值由高到低进行排序,确定潜在的DNA编码苗头化合物的分子序列信息及合成路径,并获得所述合成路径的所有潜在的DNA编码苗头化合物产物;
(2)实验组和参照组的制备:配制潜在的DNA编码苗头化合物亲和筛选实验组与参照组样品;其中,实验组包括靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组;在靶点蛋白孵育组中,靶点蛋白与潜在的DNA编码苗头化合物共同孵育;在无靶点蛋白孵育组中,潜在的DNA编码苗头化合物不与靶点蛋白共同孵育,是单独配制;然后将靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组分别清洗,弃去上清液;清洗完毕后,将靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组分别进行洗脱,洗脱与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物,分别收集洗脱液,即得靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组与无靶点蛋白组孵育洗脱组;参照组为溶解于亲和缓冲液中的潜在的DNA编码苗头化合物;
(3)液质联用检测与结果判断:采用液质联用直接对产物进行分子量的测定,所述产物包括靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组、无靶点蛋白组孵育洗脱组以及参照组;依照同一产物的分子量分别提取三个质谱中单分子峰数据并进行对比;若靶点蛋白孵育组中分子峰面积除以参照组中分子峰面积大于等于1%,且无靶点蛋白孵育组中分子峰面积除以参照组分子峰面积小于等于0.1%,可判断为该分子为与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(1)中还包括靶点蛋白潜在DNA苗头化合物分子合成过程具体包括:根据潜在的DNA编码苗头化合物合成路径确定反应的原料信息与投料顺序,溶解原料后按照反应要求依次将各个反应砌块与DNA链进行连接反应,直至所有反应路径的砌块均完成连接反应,其中每一反应结束后不做产物纯化处理,依靠质谱鉴定其中所含反应产物分子质量,并将所有反应产物直接投入下一个反应循环中。比如,溶解原料后按照反应要求进行反应砌块1与DNA链的连接,随后进行反应砌块2与前一步反应产物的连接反应,以此类推,直至所有反应路径的砌块均完成与前步反应产物连接。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(1)中还包括:潜在的DNA编码化合物反应完成后补水,加入适量NaCl混匀,然后离心并添加-80℃的冷乙醇,于-80℃下冷藏0.5~5h,离心,吸取上清液后使用离心浓缩仪干燥样品,得到产物DNA编码化合物为干粉状态。更优选的,该步骤具体为:潜在的DNA编码化合物反应完成后补水至300uL,加入30uL NaCl(5M),涡旋混匀,离心后添加900uL-80℃冷乙醇,放至-80℃冰箱冷藏1h,4000g离心30min,吸取上清液后使用离心浓缩仪干燥样品,得到的产物DNA编码化合物为干粉状态。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(1)中还包括:将前述步骤得到的干粉态DNA编码化合物重溶于水中,离心后吸取上清溶液,重复此步骤三次,利用分光光度计测定产物OD值,低于200ng/uL可认为清洗产物完毕,可直接用于液相色谱-质谱仪(liquidChromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)鉴定。更优选的,该步骤具体为:干粉态DNA编码化合物重溶于100uL双蒸水中,4000g离心5min后吸取上清溶液,重复此步骤三次,利用分光光度计测定产物OD值,低于200ng/uL可认为清洗产物完毕,可直接用于液相色谱-质谱仪(liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)鉴定。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(1)中还包括液相色谱-质谱仪鉴定的具体方法为:设置LC-MS进样体系,根据色谱出峰位置,确定样品中每一产物的保留时间、质荷比数值以及产物丰度,生成样品报告用以确定潜在DNA编码化合物反应路线中的主产物,副产物与中间产物的具体信息。
作为本发明优选的技术方案,所述LC-MS进样体系成分为流动相A:含0.0144mol/L三乙胺(Triethylamine,TEA)、0.38mol/L六氟异丙醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)的双蒸水溶液;流动相B:含0.0108mol/L三乙胺(Triethylamine,TEA)、0.285mol/L六氟异丙醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)的体积比为1:1的双蒸水与甲醇混合溶液。LC流速为0.55mL/min,自0-2.5分钟流动相B以40%--70%的比例梯度上升,至2.5分钟转换为100%流动相B,4分钟后流动相转为40%至检测结束。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(1)中还包括:将LC-MS检测后的样品进行脱盐处理,使用7K的脱盐板上样,收集过滤后的溶液并利用分光光度计进行OD值的检测并记录。定量后的样品利用冻干机干燥以获得干粉态产物。将干粉态产物重溶于双蒸水中并使得其终浓度为50μM。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(2)中具体包括:配制潜在DNA编码苗头化合物亲和筛选参照组与实验组样品。其中,参照组为溶解于亲和缓冲液终浓度为2μM的潜在DNA编码苗头化合物,实验组包括靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组。在靶点蛋白孵育组中,靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物共同孵育。优选的,靶点蛋白孵育组中,靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物的终浓度均为2μM。在无靶点蛋白孵育组中,潜在DNA编码苗头化合物单独配制。优选的,无靶点蛋白孵育组中,潜在DNA编码苗头化合物终浓度为2μM。
作为本发明优选的技术方案,所述清洗缓冲液与亲和筛选缓冲液(AffinitySelection buffer)成分均为1*PBS缓冲液,pH 7.4,0.05%v/v Tween20,每次实验前配制新鲜亲和筛选缓冲液。每个样品需用700μL。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(2)中具体包括:将实验组样品放置于室温进行孵育,混匀仪设置垂直旋转速度为60rpm/min,靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组均各自混合一小时。期间用清洗缓冲液清洗靶点蛋白标签对应的免疫磁珠三次,每次分别利用磁力架亲和吸附磁珠后弃上清;将靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组溶液分别加入至各自对应的免疫磁珠中重悬;室温垂直旋转孵育30分钟,转速为60rpm/min;用亲和筛选缓冲液清洗靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组结合后的免疫磁珠三次,每次均轻轻吹打重悬,放置在磁力架上沉淀磁珠后弃上清。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(2)中具体包括:清洗完毕后,分别向结合靶点蛋白-潜在DNA编码化合物组(靶点蛋白孵育组)与单独潜在DNA编码化合物组(无靶点蛋白孵育组)中加入去离子水,95℃加热10分钟,洗脱有结合的潜在DNA编码苗头化合物并设置为靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组与无靶点蛋白组孵育洗脱组。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(3)中具体包括:设定高分辨液相色谱-质谱鉴定体系,具体包括:设定液相色谱的进样体积为10μL,检测时长5分钟,质谱设定全扫描模式。进样顺序设置为无靶点蛋白组孵育洗脱组、靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组以及潜在DNA编码苗头化合物参照组。
作为本发明优选的技术方案,所述高分辨液相色谱-质谱的进样体系成分为:流动相A:包含0.0144mol/L三乙胺(Triethylamine,TEA)、0.38mol/L六氟异丙醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)的双蒸水溶液;流动相B:包含包含0.0108mol/L三乙胺(Triethylamine,TEA)、0.285mol/L六氟异丙醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)的双蒸水与甲醇体积比为1:1的混合溶液。LC流速为0.55mL/min,自0-2.5分钟流动相B以40%--70%的比例梯度上升,至2.5分钟时转换为100%流动相B,至4分钟时流动相转为40%至检测结束。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(3)中具体包括:根据潜在苗头化合物合成完毕的产物报告,确定合成终产物中所包含的反应中间产物、副产物与最终产物的分子量信息。针对所有终产物的分子量信息,分别在无靶点蛋白组孵育洗脱组、靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育洗脱组、潜在DNA编码苗头化合物参照组中依照同一产物的分子量分别提取单分子峰并进行对比与统计。
作为本发明优选的技术方案,在步骤(3)中具体包括:根据同一潜在DNA编码苗头化合物产物的合成路径所包含的所有分子的分子量信息,分别在无靶点蛋白孵育洗脱组、靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育洗脱组、潜在DNA编码苗头化合物参照组中衡量并统计单分子峰高度并积分生成单分子峰面积进行对比。靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育洗脱组中分子峰面积除以潜在DNA编码苗头化合物参照组分子峰面积大于等于1%,且无靶点蛋白组孵育洗脱组分子峰面积除以潜在DNA编码苗头化合物参照组分子峰面积小于等于0.1%,可判断为该分子为靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物。
本发明中DNA编码苗头化合物的合成是根据筛选后数据分析得到的DNA编码苗头化合物,遵循DNA编码化合物库分子合成的策略进行重新合成,重合成的DNA编码苗头化合物与靶点亲和孵育后,利用高分辨质谱***对于洗脱产物进行分子量鉴定,从而达到发现准确结合分子的目的。DNA编码苗头化合物的合成策略用于获得指定反应路线的所有DNA编码化合物产物;DNA编码苗头化合物与靶点亲和孵育方法通用于DNA编码化合物库与靶点亲和筛选及富集产物的洗脱与收集;高分辨质谱鉴定***可直接对于产物给予精准分子量的测定,从而推算出与靶点结合的真实分子信息。
本发明开发的基于液质联用技术验证的DNA编码苗头化合物的鉴定方法可以以数据分析结果作为基础,重合成潜在DNA编码苗头化合物作为手段,依靠质谱精确测定分子量的优势,直接定位与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物。为精确鉴定靶点蛋白结合DEL分子提供了有效的技术方法,为后续去除DNA的纯化学小分子合成直接提供了苗头化合物的信息结构,填补了DNA编码苗头化合物从DNA标记状态向DNA去除状态的空白。本发明利用质谱精确测定分子量的特点,能够有效地降低阴性结合化合物的干扰,提高DNA苗头化合物鉴定的成功率。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提供了一种有效的鉴定与靶点蛋白结合的潜在DNA编码苗头化合物的方法。利用液相色谱-质谱联用技术,通过模拟亲和筛选的流程,洗脱结合产物并进行鉴定,可直接获得与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物信息,避免了直接合成纯化学分子所带来的假阳性结果,同时提供了高可信度的与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物的理化性质,有利于进一步分析靶点蛋白与结合分子的相互作用模式,扩大了DNA编码苗头化合物库筛选向先导化合物改造的应用,提高筛选的适用范畴,降低纯化学合成分子的成本。相对于传统的高通量筛选方法,此方法与DNA编码化合物库筛选方法进行串联,可极大的促进药物筛选的通量,从<1000万种化合物增加到>100亿种化合物;提高筛选的化合物鉴定效率,从12个月的时间,减少到3-6个月;同时可降低筛选成本,包括人力成本与物料成本。目前尚未见有文献报道聚焦于此项技术的开发,因此本方法具有较大的潜在市场空间与应用价值。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
图2是本发明实施例1的洗脱产物质谱鉴定结果示意图。
图3是本发明实施例1的质谱鉴定的数据分析结果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:对FXR进行亲和筛选串联质谱鉴定以确认方法的可行性
一、背景:胆汁酸核受体FXR在胆汁酸与糖脂代谢中发挥重要的调节作用,此例中用购买的His标签的FXR作为靶点蛋白以验证方法。
二、实施方法:
实验流程如如图1所示,该方法具体包括如下步骤:
1.筛选缓冲液(Selection buffer)准备
10×PBS(Thermo fisher,美国),100%Tween-20(Sigma-Aldrich,美国),1MImidazole(Sigma-Aldrich,美国),100%DMSO(Sigma-Aldrich,美国);
配制1×Selection buffer(亲和缓冲液/清洗缓冲液):1×PBS,0.05%Tween-20,10mM Imidazole,1%DMSO。
2.磁珠准备
将HisPur Ni-NTA磁珠(Thermo fisher,美国)放在涡旋振荡器(ScientificIndustries,美国)上振荡30秒,用移液枪吸取20μL到1.5ml低吸附离心管(Eppendorf,德国)中,将离心管放置于磁力架(Thermo fisher,美国)上吸附磁珠,用移液枪吸走上清液。用100μL 1×selection buffer(筛选缓冲液)清洗磁珠三次,彻底去除磁珠储存缓冲液(stocking buffer)。
3.蛋白固定
将100pmol的FXR蛋白以50μL的筛选缓冲液稀释,加入清洗后的磁珠,室温条件下,倒转振荡孵育30分钟。接着,将离心管放置于磁力架上,用移液枪吸走上清液,得“磁珠-蛋白”复合物。
4.On-DNA compound孵育
用200μL筛选缓冲液清洗“磁珠-蛋白”复合物一次,洗去未结合到磁珠上的FXR蛋白,弃去上清。
将数据分析得到的按照DEL合成路径所获得的on-DNA compound取出200pmol,均分至两个1.5ml低吸附离心管并稀释至50μL的1×selection buffer中(100pmol/管,2μM/管),其中第一管加入至清洗好的“磁珠-蛋白”复合物中,第二管单独为“磁珠-on-DNAcompound”,室温倒转孵育1小时后,收集保存50μL的流穿液(flow-through)于96孔半裙边板(Axygen,美国)中。经孵育后,第一管中得到“磁珠-蛋白-on-DNA compound”复合物,第二管中仍是“磁珠-on-DNA compound”复合物。
5.参照组准备
将100pmol on-DNA compound稀释到50μL ddH2O中,配制成阳性对照(参照组,Input),并将阳性对照保存于96孔半裙边板(Axygen,美国)中。
6.清洗
使用200μL筛选缓冲液分别清洗“磁珠-蛋白-on-DNA compound”复合物与“磁珠-on-DNA compound”复合物3次,彻底洗去未与蛋白结合的on-DNA compound,得到清洗后的“磁珠-蛋白-on-DNA compound”与“磁珠-on-DNA compound”。每次均涡旋混匀静置1分钟后,置于磁力架上,使用移液枪彻底吸走上清液。
7.洗脱
在清洗后的“磁珠-蛋白-on-DNA compound”与“磁珠-on-DNA compound”中,分别加入50μL的双蒸水,放置于95℃金属浴(Eppendorf,德国)上,加热洗脱10分钟,洗脱与蛋白结合的on-DNA compound,并将洗脱液保存于96孔半裙边板中;由“磁珠-蛋白-on-DNAcompound”收集到的洗脱液即为靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育洗脱组,由“磁珠-on-DNA compound”收集到的洗脱液即为无靶点蛋白孵育洗脱组。
8.检测
经历过一轮筛选后的产物使用XevoG2-XS TOF(Waters,美国)液相质谱联用仪检测on-DNA compound的富集程度,同时检测参照组。
如图2和图3所示,一轮筛选后,加入FXR蛋白的一轮筛选后的洗脱液中的on-DNAcompound质谱峰面积,除以参照组中的同一个on-DNA compound质谱峰面积1.56E+06,比值应该大于等于1%,并且NTC组除以参照组中的同一个on-DNA compound质谱峰面积,比值小于等于0.1%。实验结果说明,所鉴定的on-DNA compound分子量为5610.1843,为合成路线的副产物,其m/z解卷积参数均可在洗脱液产物中被鉴定出(图2中箭头标识)。洗脱液中on-DNA compound质谱峰面积为3.79E+05,参照组中同一个on-DNA compound质谱峰面积为1.56E+06,两者比值为24.32%;而NTC组无质谱峰被鉴定到,其面积为0。因此验证此on-DNAcompound分子为FXR阳性结合分子。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种基于液质联用技术验证的DNA编码苗头化合物的鉴定方法,其特征在于,
(1)DNA编码苗头化合物的合成:针对靶点蛋白DNA筛选数据分析的结果,确定与靶点蛋白结合的富集DNA编码化合物,按照其富集计算值由高到低进行排序,确定潜在的DNA编码苗头化合物的分子序列信息及合成路径,并获得所述合成路径的所有潜在的DNA编码苗头化合物产物;
(2)实验组和参照组的制备:配制潜在的DNA编码苗头化合物亲和筛选实验组与参照组样品;其中,实验组包括靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组;在靶点蛋白孵育组中,靶点蛋白与潜在的DNA编码苗头化合物共同孵育;在无靶点蛋白孵育组中,潜在的DNA编码苗头化合物不与靶点蛋白共同孵育,是单独配制;然后将靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组分别清洗,弃去上清液;清洗完毕后,将靶点蛋白孵育组与无靶点蛋白孵育组分别进行洗脱,洗脱与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物,分别收集洗脱液,即得靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组与无靶点蛋白组孵育洗脱组;参照组为溶解于亲和缓冲液中的潜在的DNA编码苗头化合物;
(3)液质联用检测与结果判断:采用液质联用直接对产物进行分子量的测定,所述产物包括靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组、无靶点蛋白组孵育洗脱组以及参照组;依照同一产物的分子量分别提取三个质谱中单分子峰数据并进行对比;若靶点蛋白孵育组中分子峰面积除以参照组中分子峰面积大于等于1%,且无靶点蛋白孵育组中分子峰面积除以参照组分子峰面积小于等于0.1%,则判断为该分子为与靶点蛋白结合的DNA编码苗头化合物。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中潜在DNA编码苗头化合物重合成的具体步骤包括:根据该化合物在库分子合成时所遵循的合成路线,准备原料并依次将各个反应砌块与DNA链进行连接反应,直至所有反应路径的砌块均完成连接反应;其中每一反应结束后不做产物纯化处理,依靠质谱鉴定其中所含反应产物分子质量,并将所有反应产物直接投入下一个反应循环中。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中还包括:根据潜在DNA编码苗头化合物合成完毕后的质谱检测验证报告,确定该反应路线所包含的所有中间产物,副产物与主产物的分子量与纯度信息。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中合成完毕后的潜在DNA编码苗头化合物质谱检测后脱盐,定量,冻干。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中具体包括:以亲和筛选缓冲液溶解靶点蛋白溶液与潜在DNA编码苗头化合物溶液,使得其混合终浓度为2μM;靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物在室温旋转孵育1小时,随后加入至靶点蛋白亲和偶联免疫磁珠中进行孵育,设置为靶点蛋白孵育组。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中具体包括:以亲和筛选缓冲液单独溶解潜在DNA编码苗头化合物溶液并设置为无靶点蛋白孵育组,使得其混合终浓度为2μM;潜在DNA编码苗头化合物在室温旋转孵育1小时,随后加入至靶点蛋白亲和偶联免疫磁珠中进行孵育。
7.如权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述亲和筛选缓冲液成分为1*PBS缓冲液,pH 7.4,0.05%v/v Tween20;每次实验前配制新鲜亲和筛选缓冲液,每个样品需用100μL。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中具体包括:用清洗缓冲液清洗免疫磁珠三次,放置在磁力架亲和吸附后弃上清;将靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育后溶液与单独潜在DNA编码苗头化合物孵育溶液分别加入至各自对应的免疫磁珠中重悬;室温旋转孵育30分钟;用亲和筛选缓冲液清洗结合后的免疫磁珠三次,放置在磁力架上亲和吸附后弃上清。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中洗脱过程具体为:用亲和筛选缓冲液清洗结合靶点蛋白与潜在DNA编码苗头化合物孵育产物三次,每次均放置在磁力架上沉淀后弃上清,轻轻吹打重悬;之后向结合物中加入去离子水,95摄氏度加热10分钟洗脱有结合的潜在DNA编码苗头化合物并设置为靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中洗脱过程具体为:用亲和筛选缓冲液清洗单独潜在DNA编码苗头化合物孵育产物三次,每次均放置在磁力架上沉淀后弃上清,轻轻吹打重悬;之后向结合物中加入去离子水,95摄氏度加热10分钟洗脱可能非特异结合的潜在DNA编码苗头化合物并设置为无靶点蛋白组孵育洗脱组。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中所述高分辨液相色谱-质谱鉴定***具体包括:设定液相色谱的进样体积为10μL,检测时长5分钟,质谱设定全扫描模式。按照无靶点蛋白组孵育洗脱组,靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组,潜在DNA编码苗头化合物参照组的顺序进行进样设置。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中所述精确分子量测定具体包括:根据潜在苗头化合物遵循合成路线的产物信息,确定合成终产物中所包含的所有化合物的分子量信息,其中包括了合成中所生成的反应中间产物,反应副产物与反应最终产物;按照所有分子量的信息,分别在无靶点蛋白组孵育洗脱组,靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组,潜在DNA编码苗头化合物参照组中依照分子量提取单分子峰。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中推算出与靶点结合的真实分子信息具体包括:针对同一产物的分子量信息,分别在无靶点蛋白孵育洗脱组、靶点蛋白与潜在DNA编码化合物孵育洗脱组、参照组中衡量单分子峰高度并积分生成单分子峰面积进行对比。
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