JP6164650B2

JP6164650B2 - Ｎｋ細胞の調製方法

Info

Publication number: JP6164650B2
Application number: JP2014007481A
Authority: JP
Inventors: 米満　吉和; 吉和米満; 智齊藤; 結原田; 雄一郎矢崎; 武文石田尾
Original assignee: Kyushu University NUC; Gaia Biomedicine Inc
Current assignee: Kyushu University NUC; Gaia Biomedicine Inc
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2017-07-19
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: JP2014227418A

Description

本発明は、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで、高い細胞傷害活性を有するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を、造血前駆細胞から高い純度及び高い増幅倍率で調製する方法と、該方法によって得られるＮＫ細胞を含む医薬品組成物とに関する。

ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する正常細胞は攻撃しないで、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下及び欠損した細胞を主に攻撃する。癌細胞やウイルスに感染した細胞ではＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下するから、ＮＫ細胞はこれらの細胞を攻撃できる。そこで癌及び感染症の細胞療法に同種ＮＫ細胞を用いると、予め免疫してＮＫ細胞に攻撃対象の細胞を認識させる必要がなく、また、ＧＶＨ（Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ）病の副作用を回避できる利点がある。実際、Ｍｉｌｌｅｒら（非特許文献１）及びＲｕｂｎｉｔｚら（非特許文献２）の報告によると、癌患者をレシピエントとし、その近縁の健常者のドナーの新鮮な末梢血単核球からＮＫ細胞を濃縮したうえで移植したとき、移植されたＮＫ細胞は、レシピエントに副作用を起こすことなく、一時的に生着し、細胞傷害活性を保持した。しかし、ＮＫ細胞の移植療法の有効性を示す臨床治験の報告はまだない。その理由の１つは、ドナーからリンパ球アフェレーシスで回収できる細胞数に限度があるため、癌細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させることができないからである。例えば非特許文献２によると、ＮＫ細胞の生着期間は投与されたＮＫ細胞の数とは相関がみられず、２日ないし１８９日で、中央値は１０日にすぎなかった。すると、癌細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を、標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させるためには、ＮＫ細胞の移植が頻繁に繰り返される必要があり、これは患者に大きな負担となる。そこで、ドナーから得たＮＫ細胞をいったん試験管内で培養して、標的細胞を死滅させるのに十分なＮＫ細胞を得る技術の開発が進められている。その際、動物の血清やフィーダー細胞を用いると、調製されたＮＫ細胞に感染のリスクが生じるので、好ましくない。

臍帯血バンクにはさまざまな血液型の臍帯血が分類保存されているため、治療用ＮＫ細胞の出所として臍帯血を用いると、患者の血液型に応じて組織適合性が高く移植に伴う副作用の低い血液型の臍帯血を選択することが容易である。そこで、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで臍帯血から治療用ＮＫ細胞を調製する技術が近年注目されている。Ｓｐａｎｈｏｌｔｚら（非特許文献３）は、凍結保存された臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞から６週間で１万倍以上のＮＫ細胞調製を報告した。しかし、この報告の方法で得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性は高いとはいえない。また既存の技術では、造血前駆細胞からのＮＫ細胞調製にあたり、途中でサイトカイン組成の異なる培地への変更が必要であった。

Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０５：３０５１（２００５）Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２８：９５５（２０１０）Ｓｐａｎｈｏｌｔｚら、ＰＬｏｓＯＮＥ、５：ｅ９２２１（２０１０）

そこで、動物の血清やフィーダー細胞を用いないで、臍帯血や成体血球系組織由来の造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞等から調製される造血前駆細胞とを含む造血前駆細胞から高い細胞傷害活性を有するＮＫ細胞を高純度で調製できる技術を開発する必要がある。また、作業工程を簡略化するために、より単純な造血前駆細胞調製の培養条件を開発する必要もある。さらに、これらの造血前駆細胞からＮＫ細胞を調製するためのより単純な培養条件を開発する必要もある。

本発明はＮＫ細胞の調製方法を提供する。本発明のＮＫ細胞の調製方法は、造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む。

前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌを含む場合がある。

前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む場合がある。

前記ＮＫ細胞の調製方法において、前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップは、増幅された前記造血前駆細胞をＩＬ−２を含む培養条件下で培養することを含む場合がある。

本発明のＮＫ細胞の調製方法において、前記各ステップに用いる培地は、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンを含む場合がある。

本発明のＮＫ細胞の調製方法において、前記造血前駆細胞は、臍帯血及び／又は成体血球系組織に含まれる造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導される造血前駆細胞と、分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血前駆細胞の場合がある。

本発明のＮＫ細胞の調製方法において、造血前駆細胞と患者とは、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）又はキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）が一致しない場合がある。

本発明は、本発明の調製方法によって調製されるＮＫ細胞を含む、細胞療法のための医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、調製されたＮＫ細胞の他に、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞を含む場合がある。

本発明の医薬品組成物は、感染症及び／又は癌を治療するために用いられる場合がある。

本発明は細胞療法を提供する。本発明の細胞療法は、造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞をＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌを含む場合がある。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む場合がある。前記細胞療法において、前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップは、増幅された前記造血前駆細胞をＩＬ−２を含む培養条件下で培養することを含む場合がある。前記細胞療法において、前記各ステップに用いる培地は、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンを含む場合がある。前記細胞療法において、前記造血前駆細胞は、臍帯血及び／又は成体血球系組織に含まれる造血前駆細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導される造血前駆細胞と、分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血前駆細胞の場合がある。前記細胞療法において、前記ＮＫ細胞を患者に移植するステップは、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞等の他の細胞とともにＮＫ細胞を移植するステップの場合がある。本発明の細胞療法は、感染症及び／又は癌を治療及び／又は予防するために用いられる場合がある。

本明細書において「ＮＫ細胞」とは、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性の単核球をいい、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が少ないか、該発現が消失している細胞に対する細胞傷害活性を有する。

本明細書において「造血前駆細胞」とは、いずれかの細胞タイプの血液細胞への分化能を有するいかなる細胞をも含む。本発明の造血前駆細胞は、臍帯血と、骨髄その他の成体血球系組織由来の造血幹細胞と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から分化誘導された造血前駆細胞と、線維芽細胞その他の分化した細胞から直接変換される造血前駆細胞とを含むが、これらに限定されない。本発明の造血前駆細胞はＣＤ３４陽性細胞に含まれる。しかし、ＣＤ３４陽性細胞が実質的に含まれることを条件として、ＣＤ３４以外のマーカーを用いる方法で本発明の造血前駆細胞が調製されてもかまわない。本発明の造血前駆細胞は、当業者に知られたいかなる手順を用いて調製されてもかまわない。例えば、臍帯血から単核球を回収する際には、比重遠心法を用いることができる。また臍帯血中の造血前駆細胞は、細胞表面マーカーに対する抗体が不動化された免疫磁気ビーズを用いて臍帯血由来の単核球から選択的に回収できる。前記免疫磁気ビーズとして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されるＤｙｎａｌ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）を用いてもよいが、これらに限定されない。前記免疫磁気ビーズは抗ＣＤ３４抗体が不動化されていることが好ましい。しかし、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞が回収されることを条件として、ＣＤ３４以外の細胞表面マーカーに対する抗体その他の特異的結合パートナーが不動化された免疫磁気ビーズを用いてもかまわない。さらに前記造血前駆細胞は、細胞表面マーカーに対する特異的抗体で免疫蛍光染色を行い、フローサイトメーターを用いて単離・同定できる。本発明の増幅方法において、臍帯血から分離された単核球は、凍結保存され、患者への移植時期に応じて解凍され、ＮＫ細胞の増幅に供される場合がある。細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。前記細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。

人工多能性幹細胞、胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞から造血前駆細胞が分化誘導されるときには、例えば、Ｎｉｗａ，Ａ．ら（ＰＬｏＳＯＮＥ６（７）：ｅ２２２６１（２０１１））に報告される、フィーダー細胞及び血清を使わない培養条件を用いて、未分化の多能性幹細胞から造血前駆細胞が分化誘導される場合がある。簡潔には、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞が、未分化状態で維持するための無血清培地中でコロニーを形成され、ＢＭＰ４が添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられ、この日を第０日として第４日まで培養される。第４日に、ＢＭＰ４のかわりにＶＥＧＦ及びＳＣＦが添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられ、第６日まで培養される。その後第６日に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋白質（ＦＰ６）等が添加された分化誘導用の無血清培地に切り替えられる。第１０−１２日から造血細胞のクラスターが前記コロニーの辺縁に観察されはじめ、数日後に培養液中に浮遊しはじめる。

線維芽細胞のような分化した細胞から造血前駆細胞が直接変換（ｄｉｒｅｃｔｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）されるときには、例えば、Ｓｚａｂｏ，Ｅ．ら（Ｎａｔｕｒｅ，４６８：５２１（２０１０））に報告されるような方法が用いられる場合がある。簡潔には、ヒト線維芽細胞のような分化した細胞にＯＣＴ４タンパク質が強制発現され、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、Ｆｌｔ−３Ｌ及びＳＣＦが添加された培地で培養される。約２１日間後、ＣＤ４５陽性細胞が出現する。該ＣＤ４５陽性細胞が別の培養容器に移され、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＢＭＰ−４が添加された造血系分化用培地でさらに培養される。造血系分化用培地での培養約１６日後に得られたＣＤ４５陽性細胞の約４分の１はＣＤ３４も陽性である。かかる細胞はさらに、さまざまな血球系の細胞タイプへの分化が誘導される。

本明細書において「臍帯血」とは、分娩時の臍帯から採取された新鮮な臍帯血と、組織適合性の検査データを得たうえで凍結保存する臍帯血バンク制度を通じて入手可能な凍結状態の臍帯血とのいずれをも指す。

本明細書において、「胚性幹細胞」とは、着床前又は着床後のほ乳類胚由来の多能性幹細胞をいう。本明細書において、「成体幹細胞」とは、器官形成期以降の胚又は胎児と、その胎盤と、分娩後のいずれかの年齢の個体とから得られるいずれかの体細胞組織由来の幹細胞であって、少なくとも１種類以上の細胞タイプの細胞に分化する能力を有する細胞をいう。本明細書において、「人工多能性幹細胞」は、ＴａｋａｈａｓｈｉＫ．及びＹａｍａｎａｋａＳ．（Ｃｅｌｌ，１２６，６６３（２００６））をはじめとする、非多能性細胞から誘導された多能性幹細胞をいい、その誘導方法は、いかなるものであってもかまわない。

本発明の調製方法で得られるＮＫ細胞と、該ＮＫ細胞を含む医薬品組成物と、本発明の細胞療法とにおいて、生細胞を懸濁又は培養するための溶液は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が一般的である。前記溶液は、医薬品及び医薬部外品として薬学的に許容される担体を含む場合がある。

本発明の調製方法で得られるＮＫ細胞と、該ＮＫ細胞を含む医薬品組成物と、本発明の細胞療法とは、ＮＫ細胞に感受性を有するさまざまな疾患の治療及び／又は予防に適用することができる。前記疾患は、例えば、口腔癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、白血病等の癌及び腫瘍と、ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。本発明のＮＫ細胞を含む医薬品組成物は、本発明の方法で調製されたＮＫ細胞の他に、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞その他の細胞を含む場合がある。本発明の細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法等と組み合わせて実施される場合がある。本発明の細胞療法において、本発明の方法で増幅されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞とともに患者に移植される場合がある。本発明の細胞療法において、ＮＫ細胞は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等への投与によって移植される場合がある。

本発明の調製方法と、本発明の細胞療法とにおいて、細胞培養用培地は、ＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社）、ＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ培地（登録商標、セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、ＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ（シグマアルドリッチジャパン合同会社）、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むがこれらに限定されない培地が、単独で、あるいは、適当な配合比率でブレンドされて使用される場合がある。さらに、前記細胞培養用培地は、以下に説明する、血清、血清アルブミン、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分からなるグループから選択される少なくとも１種類の追加成分を添加して使用される場合がある。

前記培地には、被験者の自家血清、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。前記自家血清及び前記ヒトＡＢ型血清は１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましく、前記献血ヒト血清アルブミンは１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。前記被験者は、健常者と、前記疾患に罹患した患者との場合がある。

前記培地には、ＮＫ細胞を増幅する効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。前記サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び／又は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の場合がある。前記ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦｌｔ３Ｌは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ−１５は、０．１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＳＣＦは、２ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＩＬ−７は、０．５ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。Ｆｌｔ３Ｌは、１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。ＴＰＯは、１ないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度が好ましく、２０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度がより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬの濃度が特に好ましい。

本明細書において、ＩＬ−２の濃度は、国内標準単位（ＪＲＵ）及び国際単位（ＩＵ）で示される場合がある。１ＩＵは約０．６２２ＪＲＵであるから、１７５０ＪＲＵ／ｍＬは約２８１３ＩＵ／ｍＬである。ＩＬ−２は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ−２は、１００ないし２９００ＩＵ／ｍＬの濃度が好ましく、１００ないし２８１３ＩＵ／ｍＬの濃度がより好ましく、２８１３ＩＵ／ｍＬの濃度が特に好ましい。

本発明の調製方法と、本発明の細胞療法とにおいて、前記造血前駆細胞を増幅するステップでは、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌを含む培地で培養される。前記培地には、ＴＰＯをさらに含む場合がある。前記培地の交換は、所望のＮＫ細胞の細胞数が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、３−５日毎が好ましい。造血前駆細胞の増幅は、約５週間で細胞の増殖速度が急速に低下する。そこで、造血前駆細胞の増幅は、培養開始から約５週間、すなわち、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３８日間実施される。その後、増幅された造血前駆細胞からＮＫ細胞が分化誘導される。前記ＮＫ細胞を分化誘導させるステップでは、ＩＬ−２を含む培地で培養される。前記ＮＫ細胞の分化誘導は、約１週間、すなわち、５、６、７、８又は９日間実施される。ここである培養条件下でｎ日間の培養とは、培養開始日からｎ日後まで当該培養条件下で培養されることを指し、次の培養条件への移行又は細胞の回収が培養開始からｎ日後に行われることをいう。

本発明において、造血前駆細胞は、増幅される途中か、増幅が終わった後かに凍結され、患者への移植時期に応じて解凍され、患者への移植に供される場合がある。細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。前記細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。

本発明の増幅方法において、培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２及び飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。本発明の目的はＮＫ細胞を大量に調製することであるため、前記培地で培養する期間が長いほどより多くのＮＫ細胞が得られるので有利である。培養期間は、ＮＫ細胞を所望の細胞数まで増幅することを条件として、特に限定されない。

本発明の方法及び医薬品組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件（ｇｏｏｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）で実施されることが好ましい。

調製されたＮＫ細胞の細胞傷害活性は、当業者に周知の方法によって評価される。前記細胞傷害活性は、前記ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と、放射性物質、蛍光色素等で標識した標的細胞とをインキュベーションした後、放射線量又は蛍光強度を測定することによって定量されることが一般的である。前記標的細胞は、Ｋ５６２細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。増幅されたＮＫ細胞の性質は、ＲＴ−ＰＣＲ法、固相雑種形成法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫比濁法、ＦＡＣＳ、フロー・サイトメトリー法等を用いて調べられる場合がある。

本発明において、臍帯血及び／又は成体血球系組織の採取及び凍結保存と、自家血清の調製と、前記臍帯血及び／又は成体血球系組織と、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞等の多能性幹細胞から分化誘導される単核球の調製と、該単核球からの造血前駆細胞の調製と、該造血前駆細胞の培養前後の細胞数の測定と、培養前後の前記造血前駆細胞中のＮＫ細胞、Ｔ細胞その他の細胞タイプの構成比率の測定と、ＮＫ細胞の増幅倍率の算出と、測定誤差や有意性についての統計解析とは、当業者に周知のいかなる方法を使用して実施されてもかまわない。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

増幅培養用培地１を用いる１週間の増幅と、増幅培養用培地２を用いる４週間の増幅との後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第１のプロトコール（Ｉ）と、増幅培養用培地２だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第２のプロトコール（ＩＩ）と、増幅培養用培地３だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにおける臍帯血由来造血前駆細胞の増幅倍率の経時変化が比較される折れ線グラフ。第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られる、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞の割合を示す棒グラフ。第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフ。各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞のうち、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞における、ＣＤ６９、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、グランザイムＢ又はパーフォリンのそれぞれに陽性の細胞の割合を示す棒グラフ。第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞（ＫＢＭ５０１）と、それぞれのプロトコールでの分化誘導培地が、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合に得られるＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｉｌｎｅ＋ＩＬ−２：２８１３ＩＵ／ｍＬ）とのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフ。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

本実施例は、本発明の増幅方法によって、臍帯血由来の造血前駆細胞から高純度高活性のＮＫ細胞が得られることを証明するために行われた。

１．材料及び方法
ヒト臍帯血由来造血前駆細胞
ヒト臍帯血由来造血前駆細胞試料は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（タカラバイオ株式会社、Ｃ−１２９２１）又はＺｅｎＢｉｏ社（株式会社Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ、ＳＥＲ−ＣＤ３４−Ｆ）より入手された。前記試料は、免疫磁気ビーズＣＤ３４を用いて単核球細胞からＣＤ３４陽性前駆細胞が精製（ＣＤ３４陽性率：９０％以上）され、凍結されたものである。なお前記試料の採取に当っては、母親から書面による同意を得ている。また、ＨＩＶウイルス及びＢ型肝炎ウイルス検査の結果が陰性であると確認されている。

培地及び試薬
培地としてＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ（シグマアルドリッチジャパン合同会社、カタログ番号：Ｓ０１９２、ロット番号：ＳＬＢＢ３２１０）及び／又はＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社、カタログ番号：１６０２５０１５、ロット番号：Ｋ１Ｍ１２０９２４、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と、２０００ｍｇ／ｍＬ以下のヒト血清アルブミンとを含む）が使用され、最終濃度１０％のヒトＡＢ型血清（コージンバイオ株式会社、カタログ番号：１２１８１３０１、ロット番号：１２０２０１６５）が添加された。以下の実験で添加されるサイトカイン等のタンパク質は特記されない場合はすべてヒト組換えタンパク質である。

造血前駆細胞の増幅（１）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、製造者の仕様書にしたがって解凍された後、増幅培養用培地１で５×１０^５個／ｍＬになるように希釈され、６ウェルの培養プレート（１４０６７５、ｎｕｎｃ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に播種された。培地交換は培養５日目に行われた。増幅培養用培地１は、２５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２５０ｐｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ、１０ｐｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ培地であった。

造血前駆細胞の増幅（２）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地１で１週間培養された後、ＰＢＳで３回洗浄され、増幅培養用培地２で５×１０^５個／ｍＬになるように希釈され、６ウェルの培養プレート（１４０６７５、ｎｕｎｃ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に播種され、さらに４週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。培地交換に際しては細胞懸濁液が回収され、室温にて５００ｇ、５分間遠心操作で培地が除去された後、新鮮な増幅培養用培地２で５ｘ１０^５個／ｍＬになるように細胞が希釈され、６ウェルの培養プレートに播種された。増幅培養用培地２は、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ培地であった。

造血前駆細胞の増幅（３）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地２だけで５週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。

造血前駆細胞の増幅（４）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地３だけで５週間培養された。培地交換は培養３日目から４日ごとに行われた。増幅培養用培地３は、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５、２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７、２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ培地であった。

ＮＫ細胞への分化誘導（１）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地１ないし３を用いて合計３５日間増幅された後、培地が分化誘導用培地１に切り替えられて、７日間ＮＫ細胞への分化が誘導された。分化誘導用培地１は、１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたＫＢＭ５０１培地であった。

ＮＫ細胞への分化誘導（２）
前記臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞は、増幅培養用培地３を用いて合計３５日間増幅された後、培地が分化誘導用培地２に切り替えられて、７日間ＮＫ細胞への分化が誘導された。分化誘導用培地２は、１７５０ＪＲＵ／ｍＬ、すなわち、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び１０％ヒトＡＢ型血清が添加されたが添加されたＳＴＥＭＬＩＮＥＩＩ培地であった。

細胞数及び細胞表面マーカーの解析
前記造血前駆細胞の細胞数は血球計算盤を用いて生細胞数を計測することにより決定された。前記細胞の細胞表面マーカーは、抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３１７３０８）、抗ＣＤ５６抗体（３１８３２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３０４６０７）、抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３１０９０５）、抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３３１９０７）、抗ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３２５２０７）、抗ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３２０８０５）、抗グランザイムＢ抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号：５６０２１１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）及び抗パーフォリン抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＪａｐａｎ株式会社、カタログ番号：３０８１１１）を用いて、フロー・サイトメトリー法で解析された。

増幅されたＮＫ細胞の細胞傷害活性
ＮＫ細胞は、本実施例で説明された方法にしたがって増幅及び分化誘導され、エフェクター細胞として用いられた。慢性骨髄性白血病細胞のＫ５６２細胞は、当業者に周知の方法で培養され、標的細胞として用いられた。増幅されたＮＫ細胞と、増幅されていないＮＫ細胞（以下、「非増幅ＮＫ細胞」という。）との細胞傷害活性が、当業者に周知の方法で定量された。簡潔には、前記標的細胞は、終濃度：０．０１ｍＭの３−３’−ジオクタデシロキサカルボシアニン（シグマアルドリッチジャパン合同会社、カタログ番号Ｄ４２９２）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で１０分間培養することによって標識された。前記標的細胞は、標識後、ＰＢＳ（−）及びＲＰＭＩ培地を用いて３回洗浄された。前記エフェクター細胞と、前記標的細胞とは、丸底の９６ウェルの培養プレートに播種され、ＲＰＭＩ培地で４時間共培養された。エフェクター細胞と標的細胞との比（Ｅ：Ｔ比）は、２対１に調整された。細胞傷害活性（％）は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（シグマアルドリッチジャパン合同会社、Ａ９４００）を用いてフロー・サイトメトリー法によって定量された。

２．結果
臍帯血由来造血前駆細胞の増幅
図１は、増幅培養用培地１を用いる１週間の増幅と、増幅培養用培地２を用いる４週間の増幅との後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第１のプロトコール（白塗り菱形（◇）でプロットされたグラフ、Ｉ）と、増幅培養用培地２だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第２のプロトコール（白塗り四角（□）でプロットされたグラフ、ＩＩ）と、増幅培養用培地３だけを用いる５週間の増幅の後、分化誘導用培地１に切り替えて１週間培養される第３のプロトコール（黒塗り三角（▲）でプロットされたグラフ、ＩＩＩ）とにおける臍帯血由来造血前駆細胞の増幅倍率の経時変化が比較される折れ線グラフである。横軸は、臍帯血から調製された造血前駆細胞の培養開始からの日数を表す。縦軸は、培養開始時の細胞数を１倍とする増幅倍率を表す。図１に示されるとおり、臍帯血由来造血前駆細胞は、培養３０日頃から増殖速度が非常に低下した。第１及び３のプロトコールにより得られる細胞はともに増幅倍率が約１０，０００倍であったが、第２のプロトコールにより得られる細胞は増幅倍率が約１，０００倍で、第１及び３のプロトコールに比べて１０分の１しか増えなかった。なお、４２日まで増幅培養用培地で培養しても、３５日目と細胞数はほとんど変わらなかった（図示されない）。

図２は、第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞に含まれる、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞の割合を示す棒グラフである。図２に示されるとおり、第２のプロトコールで増幅及び分化誘導された細胞は、ＮＫ細胞の割合が約９０％であるのに対し、第１及び３のプロトコールで増幅及び分化誘導された細胞は、ＮＫ細胞の割合は約８０％しかなかった。しかし図１に示すとおり、第２のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率は第１及び３のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率の１０分の１しかない。そのため、第３のプロトコールで得られる細胞はより多くのＮＫ細胞を含むことが証明された。

図３は、第１のプロトコール（Ｉ）と、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフである。縦軸は、エフェクター細胞：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）が２：１となるように混合されて４時間共培養されたときに溶解を起こした標的細胞Ｋ５６２細胞の百分率である。ここでエフェクター細胞は、各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞が、ＮＫ細胞をさらに精製することなく、そのまま用いられた。図３に示すとおり、第２のプロトコールにより得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性は細胞溶解率約１００％で、非常に活性が高かったが、第３のプロトコールにより得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性も細胞溶解率が約９５％であった。図１に示すとおり、第２のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率は第１及び３のプロトコールで得られる細胞の増幅倍率の１０分の１しかなかった。そのため、第３のプロトコールで得られる細胞は第２のプロトコールで得られる細胞より細胞傷害活性の高い細胞を多く含むことがわかった。非特許文献３の報告では、Ｋ５６２細胞を標的とする細胞傷害活性は、同じ共培養条件下で約４０％しかなかった。したがって、本発明の方法で得られたＮＫ細胞は従来技術の臍帯血由来のＮＫ細胞と比較して、増幅倍率はほぼ同等でありながら、細胞傷害活性ははるかに高いことが証明された。

図４は、各プロトコールによる増幅及び分化誘導処理が施された臍帯血由来造血前駆細胞のうち、ＣＤ３陰性かつＣＤ５６陽性のＮＫ細胞における、ＣＤ６９、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、グランザイムＢ又はパーフォリンのそれぞれに陽性の細胞の割合を示す棒グラフである。いずれのプロトコールで増幅及び分化誘導処理が施されて得られたＮＫ細胞でも、ＣＤ６９、ＣＤ３３５及びＣＤ３３７を発現する細胞はほぼ１００％の細胞で発現が見られた。ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）を発現する細胞と、グランザイムＢ又はパーフォリンを発現する細胞との割合は、どのプロトコールで増幅及び分化誘導処理が施されて得られたＮＫ細胞でも大きな違いは見られなかった。

図５は、第２のプロトコール（ＩＩ）と、第３のプロトコール（ＩＩＩ）とにより得られるＮＫ細胞（ＫＢＭ５０１）と、それぞれのプロトコールでの分化誘導培地が、２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合に得られるＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｉｌｎｅ＋ＩＬ−２：２８１３ＩＵ／ｍＬ）とのＫ５６２細胞に対する細胞傷害活性を示す棒グラフである。分化誘導培地が２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２が添加されたＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地にＫＢＭ５０１から置換された場合には、細胞傷害活性は７０％に下がるが、それでも、非特許文献３の報告における細胞傷害活性（約４０％）よりはるかに高かった。よって、基礎培地の組成のいかんに関わらず、ＩＬ−２を含む分化誘導培地を用いることによって本発明の作用効果を奏することが証明された。

Claims

造血前駆細胞を、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７及びＦｌｔ３Ｌを含む単一の培養条件で増幅するステップと、前記増幅するステップで得られた細胞を、ＩＬ−２を含む培養条件下５、６、７、８又は９日間でＮＫ細胞に分化誘導させるステップとを含む、ＮＫ細胞の調製方法によって調製されるＮＫ細胞を含む、細胞療法のための医薬品組成物。
感染症及び／又は癌を治療するために用いられる、請求項１に記載の医薬品組成物。
前記造血前駆細胞を単一の培養条件で増幅するステップに用いる培地は、ＴＰＯをさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。