CN112979490B - 一种化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用 - Google Patents

一种化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用。所述的化合物，其具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构。所述的组合物包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物。研究表明式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物具有优异的抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性；可以用于制备具有抗氧化或抗炎作用的化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。

Description

一种化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种化合物、组合物及其在制备具有抗氧化或抗炎作用的产品中的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，主要分为表皮、真皮和皮下脂肪组织三层，其主要作用是充当物理屏障，将人体与外界环境隔绝开来，保护我们的身体免受外界生物或有毒物质的潜在攻击；同时，皮肤还驻留有免疫细胞，当皮肤发生感染或受到组织损伤时，驻留在皮肤中的免疫细胞可以与周围浸润的免疫细胞相互作用，形成复杂的防御网络。
皮肤表面的酸碱度对于人体保护功能无法忽视，人体皮肤的pH值在5.4和5.9之间，这使得大多数病原体无法在人体皮肤表面生存，而当皮肤的pH值改变后，不仅会导致病原体更容易定植在皮肤表面，还会导致炎症的发生，同时有研究表明，特应性皮炎、鱼鳞病等多种皮肤病患者的皮肤pH值均发生了改变，因此维持皮肤的酸碱平衡至关重要。皮肤具有很强的酸碱缓冲功能，但洗涤剂等会降低局部皮肤的缓冲功能，当洗涤剂的pH值与皮肤相差较大时，则会导致皮肤pH值的改变，从而可能导致皮肤细胞氧化及炎性损伤。
然而，引起皮肤氧化和炎性损伤的因素有很多，现有的抗氧化以及抗炎药物不一定能够治疗或预防酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和炎性损伤。因此，开发一种具有抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化损伤和炎性损伤活性的化合物，对于开发具有针对性的抗氧化以及抗炎产品，具有重要的应用价值。
发明内容
鉴于此，本发明首先提供一种全新结构的化合物，经进一步研究表明，所述的酰胺类化合物具有抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤作用。
本发明的详细技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种酰胺类化合物，其具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：
Figure BDA0002960331780000021
在本发明中，上述式Ⅰ所示结构的化合物命名为双歧杆菌酰胺衍生物-1简写为SH-1；式Ⅱ所示结构的化合物命名为马齿苋酰胺衍生物-1简写为MD-1。
本发明的第二方面，提供一种组合物，其包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物。
发明人在经大量的实验研究中发现，含式Ⅰ所示结构的化合物和式Ⅱ所示结构的化合物组合后，表现出协同抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性；然而并不是所有的化合物进行组合都能体现出协同抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤作用；这是本发明的另一重大研究成果。
优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1～10:1～10。
进一步优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1～3:1～3。
最优选地，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1:1。
优选地，所述的组合物还包含载体，其中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物在组合物中的所占的质量分数为10％～85％。
进一步优选地，所述的载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种。
进一步优选地，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其它非水性溶剂。
进一步优选地，所述聚合物可以但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶。
进一步优选地，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。进一步可选的，所述载体还包括稀释剂和赋形剂中的一种或多种。
本发明的第三方面，提供上述化合物或组合物在制备具有抗氧化和/或抗炎作用的产品中的应用。
优选地，所述的抗氧化具体是指抗酸和/或碱性物质导致的皮肤细胞氧化。
进一步优选地，所述的抗炎具体是指抗酸和/或碱性物质导致的皮肤细胞炎性损伤。
优选地，所述的产品为化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。
进一步优选地，所述化妆品或护肤品包括乳液、霜膏、凝胶、水剂、油剂、粉剂或面膜。
进一步优选地，所述食品、保健品或药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
本发明的第四方面，提供上述式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的制备方法，其中，式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物可以通过人工合成方法制备得到；式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物的具体合成方法见实施例。
有益效果：(1)本发明提供了一种全新结构的化合物，研究表明所述的双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1具有优异的抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性；(2)进一步研究表明，将双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1组合后，其抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性大于双歧杆菌酰胺衍生物-1或马齿苋酰胺衍生物-1单独使用的活性，这说明将双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1组合后具有协同抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性；(3)由于双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1及其组合具有抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤活性；因此，可以将双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1及其组合用于制备具有抗氧化或抗炎作用的化妆品、护肤品、食品、保健品或药物，尤其是可以用于制备具有抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤作用的化妆品、护肤品、食品、保健品或药物；(4)本发明所述的双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1的制备工艺简单、操作方便，制得的化合物纯度高，有利于其在食品、药品、保健品和化妆品中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)的1H NMR及13C NMR谱图。
图2是马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)的1H NMR及13C NMR谱图。
图3是MD-1、SH-1及其组合减轻酸、碱暴露对HaCaT细胞的损伤实验结果图。
图4是MD-1、SH-1及其组合减轻酸、碱暴露对HaCaT细胞的ΔΨm变化、ROS含量、SOD活性、MDA含量以及细胞凋亡的影响实验结果图。
图5是MD-1、SH-1及其组合减轻酸、碱暴露诱导的HaCaT细胞的MMP-1、MMP-9分泌及基因转录影响实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1双歧杆菌酰胺衍生物-1以及马齿苋酰胺衍生物-1的合成
Figure BDA0002960331780000041
称取反应底物3,4,5-三甲氧基苯甲酸(2.12g)于200mL干净的圆底烧瓶中，放入磁子，加入50mL无水二氯甲烷，搅拌下加入缬氨酸甲酯(1.57g),三乙胺(2.7mL)，5分钟后加入HATU(4.56g)。加料结束后，于室温下继续反应4小时，TLC监测反应原料消失。停止搅拌，将反应体系减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(200-300目)，纯化得白色固体3.0g，经鉴定为(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)缬氨酸甲酯。
Figure BDA0002960331780000042
将(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)缬氨酸甲酯(2.9g)加入到200mL圆底烧瓶中，放入磁子，取甲醇：水(4:1)30mL倒入反应瓶中，室温搅拌下加入氢氧化锂(0.61g)，接着在室温下搅3小时，TLC监测直至反应转化完全。将反应体系甲醇减压蒸除，调节PH至6-7，有白色固体析出，过滤干燥得双歧杆菌酰胺衍生物-1(化学名称为：(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)缬氨酸)2.7g.
Figure BDA0002960331780000051
称取反应原料(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)缬氨酸(1.0g)于200mL干净的圆底烧瓶中，放入磁子，加入35mL干燥的二氯甲烷，搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(734mg),1-羟基苯并***(519mg)及N,N-二异丙基乙胺(1.24g)。加料结束后，反应体系置于室温下搅10分钟，接着加入另一底物苯丙氨酸甲酯盐酸盐(820mg)，并于室温下继续反应4小时，TLC监测反应原料消失停止搅拌，将反应体系减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析(200-300目)，纯化得白色固体1.18g，经鉴定为马齿苋酰胺衍生物-1。
双歧杆菌酰胺衍生物-1(式Ⅰ所示结构)的氢谱及碳谱数据如下(见图1)：1H NMR(600MHz,DMSO)δ:8.42(d,2H),7.23(s,2H),4.30(t,1H),3.84(s,6H),3.71(s,3H),2.19(m,1H),0.97(m,6H)13C NMR(151MHz,DMSO)δ:173.67,166.58,152.94,140.55,129.67,105.68,60.54,58.93,56.50,30.07,19.85,19.45.
马齿苋酰胺衍生物-1(式Ⅱ所示结构)的氢谱及碳谱数据如下(见图2)：1H NMR(600MHz,DMSO)δ:8.52(t,1H),8.21(d,2H),7.21(dd,1H),4.52(m,1H),4.35(m,1H),3.84(d,6H),3.71(d,3H),3.62(d,2H),3.56(d,1H),3.05(m,1H),2.92(m,1H),2.07(m,1H),0.91(td,3H),0.74(dd,3H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ：172.42,172.24,171.75,171.59,166.15,166.06,152.94,152.92,140.52,140.47,137.62,137.54,129.92,129.84,129.65,129.60,129.52,128.64,128.60,128.58,126.95,126.93,105.62,105.60,60.55,59.13,56.53,56.50,54.11,53.97,52.37,52.16,37.11,37.03,30.79,30.68,19.64,19.60,19.40,19.03.
实验例
为了评估本发明上述方法制备得到的双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)、马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)及其组合物MS-1(MS-1为MD-1及SH-1的等摩尔比的组合物)的抗酸和/或碱性物质导致的皮肤氧化和/或炎性损伤效果，进行如下试验：
永生化角质形成细胞系HaCaT细胞培养于细胞培养箱中，37℃、5％CO2(DMEM培养基)。酸、碱性物质暴露刺激5min。然后，吸去各组培养细胞培养液，PBS冲洗2次，重新加入DMEM培养基或含SH-1(5μM)、MD-1(5μM)或MS-1(5μM)培养基继续培养12h。CCK8方法检测细胞活力，收集细胞和培养液。
实验分为：正常对照组(Control)；酸性物质暴露组；MD-1组(酸性物质暴露+MD-110μM)；SH-1组(酸性物质暴露+SH-1 10μM)；MS-1组(酸性物质暴露+MS-1 10μM)。每个处理条件3个复孔，重复实验3次。正常对照组不接受酸性物质暴露刺激，酸性物质暴露刺激组、MD-1组、MS-1及SH-1组则分别接受酸性物质暴露刺激。
或正常对照组(Control)；碱性物质暴露组；MD-1组(碱性物质暴露+MD-110μM)；SH-1组(碱性物质暴露+SH-1 10μM)；MS-1组(碱性物质暴露+MS-110μM)。每个处理条件3个复孔，重复实验3次。正常对照组不接受碱性物质暴露刺激，碱性物质暴露刺激组、MD-1组、MS-1及SH-1组则分别接受碱性物质暴露刺激。
HaCaT细胞按实验设计处理后，收集细胞培养液；参考ELISA试剂盒操作说明书检测IL-1β、NO、TNF-α、ROS、MMP-1、MMP-9、SOD、MDA的含量变化。
HaCaT细胞按实验设计处理后，收集细胞，在室温下于2000g离心3min。细胞在预冷1×PBS中悬浮，2000g离心3min，洗涤细胞。Annexin V-FITC/PI双染色实验按照制造商的说明进行。流式细胞仪检测细胞凋亡，所有实验至少重复3次。
HaCaT细胞按实验设计处理后，收集细胞，用预冷的PBS洗2次，加入50μL细胞裂解液，4℃静置30min。10000r/min离心15min，取上清提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5％脱脂奶粉室温封闭2h。随后加入一抗，4℃轻摇过夜，用TBST洗3次，加入相应的二抗，室温孵育1h，漂洗3次。
实验结果如下：
MD-1及SH-1的细胞毒性结果显示MD-1、SH-1及其组合在2.5mM浓度时对HaCaT细胞无显著细胞毒性(图3A)。进一步的实验结果显示(见图3B)，MD-1及SH-1均能抑制酸、碱性物质导致的细胞活力降低。尤其是，其组合物MS-1其对酸、碱性物质导致的细胞活力降低的抑制作用要大于MD-1或SH-1；这说明双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)组合后具有协同抑制酸、碱性物质导致的细胞活力降低的作用。
与Control组相比，酸、碱性物质暴露刺激使HaCaT细胞内ROS含量增加，而MD-1、SH-1及其组合物MS-1使酸、碱性物质暴露刺激诱发的ROS过量产生显著抑制，其中MS-1的抑制作用明显大于单独使用MD-1或SH-1的抑制作用(图4B)。ROS水平升高会进一步导致HaCaT细胞凋亡，线粒体介导的凋亡途径可由多种因素触发，如线粒体功能障碍，SOD活性降低，MDA含量升高等。与Control组相比，酸、碱性物质暴露刺激使HaCaT细胞ΔΨm下降增加(图4A)；SOD活性降低(图4C)，而MDA含量升高(图4D)，进而诱发HaCaT细胞凋亡增加(图4E，F)，说明酸、碱性物质暴露刺激导致HaCaT细胞氧化损伤，进而诱发细胞凋亡。而MD-1、SH-1及其组合物MS-1抑制了酸、碱性物质暴露刺激诱发的HaCaT细胞ROS过量产生，及Ψm下降增加；同时，MD-1、SH-1及其组合物MS-1抑制了酸、碱性物质暴露刺激导致的SOD活性降低，MDA含量升高，从而发挥保护作用，最终使酸、碱性物质暴露导致的HaCaT细胞凋亡被显著抑制。同样，从图4A以及图4C～F中可以看出，MS-1的抑制作用明显大于单独使用MD-1或SH-1的抑制作用。上述实验结果说明，双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)具有显著的抑制酸、碱性物质导致的细胞氧化损伤作用；尤其是，双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)的组合物MS-1，其对酸、碱性物质导致的细胞氧化损伤的抑制作用均大于单独使用双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)或马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)，这说明双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)组合后产生了协同的抑制酸、碱性物质导致的细胞氧化损伤作用。
酸、碱性物质暴露刺激使HaCaT细胞IL-1β、NO、TNF-α分泌增加，说明酸、碱性物质暴露刺激诱发HaCaT细胞严重的炎症反应。MD-1、SH-1及其组合物MS-1可显著降低酸、碱性物质暴露刺激诱发的HaCaT细胞炎性细胞因子分泌。这表明双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)及其组合物MS-1具有抗酸和/或碱性物质导致的皮肤炎性损伤作用。进一步研究表明，组合物MS-1对酸、碱性物质暴露刺激诱发的HaCaT细胞炎性细胞因子分泌的抑制作用均大于MD-1和SH-1，这说明双歧杆菌酰胺衍生物-1(SH-1)以及马齿苋酰胺衍生物-1(MD-1)组合后具有协同抗酸和/或碱性物质导致的皮肤炎性损伤作用。
不合适的酸、碱性洗涤剂会损伤肌肤细胞，导致皮肤老化。其特征性组织学变化是弹性组织变性物质的沉积和胶原蛋白的嗜碱性变性，伴有I和III型前胶原大降解。其中，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)增高导致纤维***的降解是引起老化的重要机制之一。为了研究MD-1、SH-1及其组合对酸、碱性物质诱导的MMPs表达的影响，我们检测了MD-1、SH-1及其组合对酸、碱性物质诱导的MMPs分泌的影响。ELISA检测结果显示，酸、碱性物质暴露刺激使HaCaT细胞MMP-1、MMP-3分泌均显著增加，而MD-1、SH-1及其组合可抑制酸、碱性物质诱导的MMP-1和MMP-3分泌(图5A)。ELISA结果与RT-PCR结果类似，酸、碱性物质暴露刺激HaCaT细胞后，MMP-1和-3基因转录增加。而MD-1、SH-1及其组合降低酸、碱性物质暴露刺激诱导的HaCaT细胞MMP-1和-3基因转录(图5B)。

Claims (6)

1.组合物在制备具有抗氧化和/或抗炎作用的产品中的应用；
所述的抗氧化具体是指抗酸和/或碱性物质导致的皮肤细胞氧化；
所述的抗炎具体是指抗酸和/或碱性物质导致的皮肤细胞炎性损伤；
所述的组合物，包含式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 283459DEST_PATH_IMAGE002
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，组合物中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1~10:1~10。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，组合物中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1~3:1~3。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，组合物中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物还包含载体，
其中，式Ⅰ和式Ⅱ所示结构的化合物在组合物中的所占的质量分数为10%~85%。
6.根据权利要求1~5任一项所述的应用，其特征在于，所述的产品为护肤品、食品或药物。
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