KR101997166B1 - 헴프시드 추출물을 포함하는 항여드름, 여드름 흉터개선, 주름 및 탄력 개선, 피부재생, 피지억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 헴프시드 추출물은 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 우수한 항균 활성이 있으며, 피지를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 헴프시드 추출물을 유효성분으로 함유하여 여드름 증상 개선 및 예방할 수 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

헴프시드 추출물을 포함하는 항여드름, 여드름 흉터개선, 주름 및 탄력 개선, 피부재생, 피지억제용 조성물{Composition for anti-acne, reducing scar, skin-lifting, anti-wrinkle and suppressing sebum containing a hemp seed extract}

본 발명은 헴프시드의 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

여드름은 난포에 붙어 있던 피지선이 염증을 일으키는 원인이 되는 질병으로, 청소년의 85%에서 관찰되고 있다. 여드름은 피부 중 가장 잘 보이는 부위, 특히 얼굴, 가슴, 등, 목 등에 나타나며, 여드름에 의한 피부 손상이 심하면, 이로 인해 우울증이나 대인관계 기피 등 정신적 피해를 준다.

여드름의 발병 원인은 아직도 명확히 규명되어 있지 않으나, 피지의 과잉분비, 모낭의 각질화, 여드름 균의 증식 등 세가지가 여드름을 생성하는 큰 요인으로 인정되고 있다. 대표적인 여드름 균으로 프로피오닉박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P. acnes)가 있다. 상기 P. acnes는 모낭 내에 상주하는 혐기성 세균으로 정상인에서는 이 균이 피부에 존재하더라고 문제가 되지 않으나, 모낭이 막혀 피지가 모낭 안에 쌓이게 되면 피지를 먹고 빠르게 증식한다. 피지선 내의 P. acnes가 증식됨에 따라 피지선의 지질 구성이 변화되고, 여드름 생성을 촉진하며 염증을 유발한다.

이러한 여드름을 치료하기 위하여 피지생성의 억제제, 항염제, 항균제, 각질용해제 및 항생제를 치료제로 사용 중이다. 그러나 최근 항생제에 대한 내성이 여드름 치료에 커다란 문제가 되고 있으며, P. acnes의 항생제 내성율은 과거와는 다르게 62-70%로 크게 증가하였다. 또한 종래의 여드름 치료제는 위장장애, 간 및 신장 장애, 임산부에게는 기형아를 낳는 등 신체부작용을 동반하는 문제가 있다.

헴프(Cannabis sativa L.)는 세계에서 가장 초기에 재배된 식물 중 하나이다. 고고학 및 역사적 발견에 따르면 헴프가 5,000년 전에 재배되었다는 증거가 있으며, 역사적으로, 헴프는 식이 보조제, 피부 제품, 의류 및 의약품에 사용되는 중요한 식물이다. 산업용 헴프의 줄기에서 얻은 섬유는 로프, 직물 및 종이로 만들어졌으며 씨앗은 다양한 식품과 화장품으로 가공되었다. 헴프의 잎(대마초)는 류마티스 통증, 변비, 여성 생식 기관 장애, 말라리아 및 기타의 치료를 위한 약물로 사용되었으며, 고대 중국을 비롯하여 전 세계적으로 수천 년 동안 약용식물로써 사용하였다. 그러나 환각 효과로 인해 대마초는 20 세기 초반부터 거의 모든 국가에서 법적으로 사용을 제한했다. 미국, 영국 및 대부분의 유럽 국가들이 대마초를 불법 마약류로 지정함에 따라 대마초의 사용은 20 세기 중반에 거의 완전히 사라졌다.

현재 전 세계적으로, 부분적인 의약품으로써의 사용을 허용하고 있는 일부 국가를 제외하고는 대부분의 국가에서 대마초 사용이 불법이며, 한국도 흡연은 물론이고 재배 및 유통에 이르기까지 엄격하게 통제되고 있다. 대마초는 460 가지가 넘는 화학 물질로 구성되어 있으며, 그 중 테트라히드로카나비놀(Tetrahydrocannabinol, THC)이 주요 향정 성분이므로 소량으로도 강한 환각을 일으킬 수 있다. THC의 과다 복용은 환각 및 편집증 같은 심각한 정신 부작용을 유발할 수 있다. 반면에, 헴프시드에는 어떤 향정신성 화학 성분도 없는 것으로 알려져 있다.

대한민국 등록특허 제10-1196745호

본 발명의 하나의 목적은 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적은 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하기 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로 헴프시드 추출물을 포함한다.

본 발명에서 상기 헴프(Cannabis sativa L.)는, 삼, 마 또는 대마로 불리는 삼과의 한해살이 풀의 일종이다. 본 발명의 헴프시드는 상기 헴프의 씨앗을 의미한다. 헴프시드는 타원형에 길이는 약 5㎜ 정도로 겉껍질은 갈색이다. 겉껍질을 제거하면 크림색 또는 초록빛이 도는 크림색을 띈다. 겉껍질을 벗긴 헴프시드는 식품, 화장품으로 활용되며, 국내에서는 환각성분인 테트라히드로카나비놀(Tetrahydrocannabinol, THC) 검사를 거쳐서 안정성이 확인된 후에 유통된다.

본 발명에서 용어, "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 식물로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄는 이후 추출과정에서 식물의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄하면 족하며 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.

본 발명에서 헴프시드를 추출하는 데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 추출물은 물; C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜을 포함하는 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄을 포함하는 탄화수소계 용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 용매로 추출하여 수득될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 건조된 헴프(Cannabis sativa L.) 시드 500g 중량 대비 3배 부피비(w/v)의 에탄올 및 헥산 혼합용액에 침지하여 상온(25℃)에서 하루 동안 정치시킨 후 그 과정을 세 번 반복하였다. 상기 에탄올 헥산 혼합 용액은 1;1의 부피비로 혼합되었다. 나일론 멤브레인(Nylon membrane)으로 여과하여 헴프시드 추출원액을 제조하였다. 회전감압농축기를 이용하여 상기 헴프시드 추출원액을 35℃에서 감압 농축하여 농축액을 얻었고, 상기 농축액을 에탄올에 충분히 녹인 후 여과하여 추출물을 제조하였다.

따라서 본 발명의 추출물은 구체적으로, 추출용매를 헥산(hexane), 에탄올 또는 이들 혼합용액으로 추출한 것일 수 있다.

상기 추출은 상기 헴프시드 건조물의 중량 또는 부피를 기준으로 1 내지 20배 중량(w/v) 또는 부피(v/v), 구체적으로는 1 내지 15배에 달하는 중량(w/v) 또는 부피(v/v)의 용매를 이용하여, 10 내지 80, 구체적으로는 15 내지 50의 추출 온도에서 2시간 내지 30일, 구체적으로는 12시간 내지 18일의 추출 시간 동안 추출하는 방법을 적용할 수 있으며, 상기 건조 및 파쇄물을 포함하여 1회 내지 5회 연속하여 추출하여 액상의 조추출물을 수득하는 과정을 포함할 수 있다.

본 발명에서 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론, 여과지 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용할 수 있다.

상기 액상의 조추출물은 감압여과 등의 방법으로 식물의 건조파쇄물과 분리된 후 농축 또는 건조의 과정을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 액상의 조추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃에서 감압 농축한 농축액일 수 있고, 상기 액상의 추출물을 건조하여 분말화된 추출물을 얻을 수도 있다. 이렇게 농축 또는 분말화된 추출물은 필요에 따라 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 다이메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 또는 이들의 혼합용매에 가용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "여드름"은 피지가 나오다 막혀 모공내 각질비후현상(retention hyperkeratosis)으로 인해 생성되는 질환으로서, 환자의 70-80%는 11-25세의 연령층에 집중되며, 경미한 여드름은 피부병이라기보다는 성장기의 피부특징의 하나라고 할 수 있다. 이러한 여드름의 발생 원인은 크게 피지의 과잉분비, 모낭의 각질화, 여드름 균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)의 증식이 여드름을 생성하는 주요 요인으로 알려져 있다. 또한 피지선의 비대증식, 모낭공의 각화항진, 세균의 영향 등이 복잡하게 작용하여 여드름을 악화시키며, 각자가 단독으로도 여드름을 만들어 내기도 한다. 그 외에 여드름이 생기기 쉬운 체질인 유전적 요인, 계절, 기후 등의 외적인 요인, 음식물에 의한 영향, 피로와 스트레스도 여드름에 관여한다. 여드름의 발병원인은 아직도 명확히 규명되어 있지 않지만, 유전적인 요인과 환경적 요인을 배제한다면, 상기 세 가지의 중요한 원인이 여드름 발병에 직접적으로 관여한다는 것이 지금까지의 연구보고를 통하여 확인이 되고 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "여드름"은 당업계에서 여드름으로 통칭되는 모든 피부 질환 또는 여드름과 유사한 기전을 통해 발명되는 모든 피부 질환을 포함한다. 예컨대, 집합성 여드름, 브롬화물에 의한 여드름, 일반적 여드름, 응괴 여드름(congoblate acne), 화장품 사용에 의한 여드름, 디터지칸 여드름(acne dtergicans), 청춘기 여드름, 섬광모양의 여드름(acne fulminans), 절성 여드름(acne furunculoid), 할로겐에 의한 여드름, 경결성 여드름, 켈로이드성 여드름, 물리적 자극에 의한 여드름(mechanical acne), 약물성 여드름, 괴사성 여드름, 속립성 여드름, 신생아 여드름(acne neonatorum), 지성 여드름(acne oil), 구진성 여드름, 적창(pomade acne), 월경전 여드름, 주사 여드름(acne rosacea), 모창성 여드름, 열대성 여드름(tropical acne), 중독성 여드름(acne venenata), 및 심상성 여드름 등을 포함한다.

본 발명의 실시예에서 헴프시드 추출물이 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes, P. acnes)에 대한 항균효과 및 항염효과가 우수함을 확인하였다(실험예 1, 2, 3, 4).

따라서 본 발명의 조성물은 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 항균효과 및/또는 항염효과를 가지며, 이들 균에 의해 유발되는 여드름 증상을 개선 또는 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 헴프시드 추출물이 사람 피지선 세포주에서 인슐린 유사 성장인자-1로 자극된 지질 합성 시그널 단백질의 발현을 현저히 억제하는 것을 확인하여 피지억제효과를 가짐을 확인하였다(실험예 8, 9). 그리고 전 염증성 지질인 류코트리엔-B4(leukotriene, (LT)-B4)의 방출을 유도하는 5-lipoxygenase의 발현을 억제함을 확인하여 염증과 피지를 억제함을 확인하였다(실험예 10).

본 발명의 헴프시드 추출물이 피지세포에서 지질의 합성을 억제하여 피지를 억제함을 확인하였으며, 염증성 지질의 분비를 억제하고 염증을 억제함을 확인하였는바, 본 발명의 조성물은 피지 및 염증성 지질로 인한 염증을 억제하여 여드름 증상을 개선 또는 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에서 헴프시드 추출물이 콜라겐 합성을 촉진시키고 콜라겐 분해효소인 MMP-9의 활성을 저해하는 것을 확인하였다(실험예 5, 6).

따라서 본 발명의 조성물은 콜라겐 합성을 촉진하고, 콜라겐의 분해를 저해하여, 피부의 탄력 또는 주름을 개선할 수 있다. 또한 여드름균에 의해 유도되는 콜라겐 감소를 억제하여 여드름으로 인한 흉터 감소효과를 가짐을 확인하였다.

본 발명에서 “탄력 또는 주름 개선”은 콜라겐 또는 엘라스틴을 분해하는 효소를 저해하거나, 콜라겐의 합성을 촉진시켜 피부층의 탄력 또는 주름을 개선시키는 것을 의미한다. 상기 콜라겐 및 엘라스틴은 피부 진피층을 구성하여, 상기 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 또는 변형이 주름 생성과 피부탄력 저하에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 실시예에서 헴프시드 추출물을 처리한 섬유아세포의 증식이 비처리한 대조군과 비교하여 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 헴프시드 추출물이 피부세포의 증식 촉진 효과를 가진다(실험예 7).

따라서, 본 발명의 조성물은 세포의 증식을 촉진하여 피부재생 또는 흉터 개선할 수 있다. 구체적으로 여드름균에 의해 유도되는 콜라겐 분해로 인해 생기는 상처 또는 흉터의 세포재생을 촉진하여 피부를 재생시키거나 또는 흉터를 개선하는 것일 수 있다.

본 발명에서 “피부재생”은 피부세포의 증식을 향상시키거나, 손상된 피부를 회복을 촉진시키는 것을 의미한다. 피부재생은 내외부 원인에 의해 발생된 피부 또는 세포의 손상에 대한 피부 조직의 회복과정으로, 자외선뿐만 아니라 창상, 상청, 세균감염 등이 손상의 원인이 될 수 있다. 세포증식 촉진을 통해 외부 또는 내부 요인에 의해 손상된 피부를 재생할 수 있다.

본 발명에서 “흉터”는 손상된 피부가 치유된 흔적이다. “흉터 개선”은 흉터부위의 피부세포의 증식을 촉진시켜 형성된 흉터를 감소 또는 개선시키거나, 손상된 피부의 세포증식을 촉진하여, 흉터의 생성을 감소 또는 개선하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 조성물 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 구체적으로는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량%로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은, 제형에 제한이 있는 것은 아니나, 용액 현탁액, 유탁액, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 바디워시, 클렌징 및 스프레이 중에서 선택된 제형을 갖도록 제조될 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, 헴프시드, 추출물, 여드름은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 발명의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 양태로 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어, 헴프시드, 추출물, 여드름은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "외용제"는 외용으로 제공되는 제제이고, 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 경고제, 좌제 등이 있으며, 본 발명의 피부 외용제는 특히 피부 외용에 작용하는 제제는 제한없이 포함한다.

본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

각 제형에 의한 피부 외용제 조성물은 본 발명의 추출물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 총 조성물의 중량 대비 추출물을 0.0001 내지 30%(w/v)로 포함할 수 있다. 만약, 0.0001%(w/v) 미만으로 포함되면, 여드름 개선 효과를 실질적으로 기대할 수 없다. 반면, 30%(w/v)을 초과하며 포함할 경우에는 용제로의 용해성 등 조성물의 전체적인 가공성이 떨어져 제형 등 각종 용도로의 사용이 제한될 수 있다.

본 발명의 조성물은 여드름 균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 우수한 항균 활성 가지고 피지생성을 억제하는 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하는 바, 여드름 증상 개선 및 예방에 유효하다.

도 1은 헴프시드 추출물의 P. acnes에 대한 항균력 분석결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 2는 헴프시드 추출물이 iNOS, COX-2 및 IL-1β 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 3은 헴프시드 추출물이 염증성 사이토카인(cytokine) IL-8 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 4는 헴프시드 추출물이 NF-κB 시그널 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 5는 헴프시드 추출물에 의한 Hs68 세포의 콜라겐 합성량 증가량을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 6은 헴프시드 추출물의 MMP-9 활성 저해능 분석결과이다.(*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 7은 헴프시드 추출물의 세포증식 촉진효과를 분석한 결과이다.
도 8은 헴프시드 추출물이 AMPK 시그널 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 9는 헴프시드 추출물이 AKT/FoxO1 시그널 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)
도 10은 헴프시드 추출물이 5-lipoxygenase 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (*P<0.05, 헴프시드 추출물 처리군과 음성 대조군 사이의 유의성, Duncan’s test)

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

<실험방법>

실시예 1. 헴프시드 추출물의 제조

건조된 헴프(Cannabis sativa L.) 시드 중량 500g의 3배(w/v)인 에탄올: 헥산 (1: 1) 1.5 L에 침지하여 상온(25℃)에서 하루 동안 정치시킨 후 그 과정을 세 번 반복하였다. 나일론 멤브레인(Nylon membrane)으로 여과하여 헴프시드 추출원액을 제조하였다. 회전감압농축기를 이용하여 상기 헴프시드 추출원액을 35℃에서 감압 농축하여 농축액을 얻었고, 상기 농축액을 에탄올에 충분히 녹인 후 여과하여 추출물을 제조하였다. 세포 실험시 상기 추출물을 다이메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 필요한 적정 농도로 희석하여 사용하였다.

실시예 2. 세포 배양

인간 각질세포 세포주인 HaCaT 세포와 인간 섬유아세포 세포주인 Hs68 세포는 페니실린(penicillin) 100 units/㎖/ 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖과 10% FBS가 함유된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Thermo, USA) 배지를 사용하였고, 인간 피지선세포(Sebocyte)는 항생제가 포함된 인간 피지선세포 성장 배지(M36079-015, celprogen사)를 이용하여 37℃, 5%, CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다.

실시예 3. 헴프시드 추출물의 항균력 측정

여드름균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes, P. acnes)를 사용하여 헴프시드 추출물의 항균효과를 측정하였다. 여드름균(P. acnes)에 대한 항균력 시험은 스프레딩(spreading) 방법으로 하였다. 멸균한 액체 RCM 배지에 균수를 일정하게 맞추어 미리 준비한 시료와 함께 30분 동안 배양시켰다. 균과 시료의 혼합물을 일정량 취하여 멸균한 고체 RCM 배지에 스프레딩(spreading)하여 72시간 동안 배양시켰다. 자란 균의 콜로니(colony) 수를 세어 항균력을 확인하였다.

실시예 4. 여드름균으로 유도된 염증성 in vitro 모델에서 헴프시드 추출물의 항염증 효능 측정

4.1. 여드름균으로 유도된 염증성 in vitro 모델

배양한 P. acnes 균액을 McFarland 4 standard를 이용하여 600㎚에서 흡광도를 측정하고 흡광계수가 0.6 내지 0.66이 되게 균의 탁도를 조정하였다. 정량한 P. acnes 균액을 1 X PBS와 섞어 4,500 rpm에서 15분간 원심분리 하여 한 번 세척해준 다음, 혈청이 포함되지 않은(serum free) 배지로 현탁하고 1.2 X 10⁹ CFU/㎖로 소분하여 -20℃에 보관하였다. 소분한 P. acnes 균액은 사용하기 전에 80℃의 항온수조에서 heat-killed 시킨 다음 실험에 사용하였다.

4.2. 염증관련 사이토카인(cytokine)의 발현 측정

헴프시드 추출물이 항염증 관련 Cytokine의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, P. acnes으로 염증이 유도된 HaCaT 세포에 헴프시드 추출물을 농도별로 처리 후, 실험군과 대조군의 상등액을 회수하였다. 각각 IL-8에 대한 ELISA 키트를 이용하여 ELISA 마이크로플레이트 리더기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

4.3. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

HaCaT 세포의 P. acnes에 의한 염증 유도 정도와 염증이 유도된 HaCaT 세포에서의 헴프시드 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 수거한 세포에서 분리한 단백질은 브래드포드법으로 정량하였으며, 일련의 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis) 과정을 거쳤다. 각각의 일차 항체(iNOS, IL-1β, COX-2, IKKα, IKKβ, p-IKKα/β, IκBα, p-IκBα, NFκB p65, p-NFκB p65, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK 그리고 p-JNK)와 그에 맞는 이차 항체로 반응 시키고 이후 현상된 이미지를 비교 분석하였다.

실시예 5. 헴프시드 추출물의 세포재생 및 콜라겐 합성 촉진 효능 측정

5.1. 헴프시드 추출물의 시험관 내(in vitro) 콜라겐 합성 촉진 효능 측정

Hs68 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포로 분주 한 후 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 혈청제거 배지에 P. acnes를 희석하여 24시간 동안 배양하여 염증반응을 유도하였다.

배양 후, 배지를 제거하고 혈청제거 배지에 헴프시드 추출물을 넣은 시료를 세포에 넣어 24시간 동안 배양하였다. 음성대조군은 P. acnes와 헴프시드 추출물 모두 처리하지 않았고, 양성대조군은 P. acnes만을 처리 한 후 혈청제거 배지만을 넣어 배양하였다. 헴프시드 추출물 처리 후 상등액을 모아 시르콜(Sircol) 콜라겐 어세이 키트를 사용하여 실험하였다. 세포배양액에 콜라겐 분리 & 농축 용액을 넣어 4℃에서 12 시간 이상 반응시켜 콜라겐(collagen)을 분리 농축하였다. 13,000 rpm에서 원심분리 하여 collagen을 모아 세척용액으로 세척 후 sircol 염료를 사용하여 상온에서 30분 동안 기계적으로 인벌팅(inverting)하며 염색하였다. 세척용액으로 남은 sircol dye를 제거 후 알카리 시약(alkali reagent)로 염색된 collagen을 녹여 570 ㎚ 파장을 사용해 흡광도를 측정하였으며, collagen 양은 collagen 표준 곡선에 대입하여 환산하였다.

5.2. 젤라틴 자이모그래피(Gelatin zymography)를 이용한 MMPs 활성 저해능 측정

Hs68 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포로 분주 한 후 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 혈청제거 배지에 P. acnes를 희석하여 24시간 동안 배양을 통해 염증반응을 유도하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 혈청제거 배지에 헴프시드 추출물을 넣은 시료를 세포에 넣어 24시간 동안 배양하였다. 음성대조군은 P. acnes와 헴프시드 추출물 모두 처리하지 않았고, 양성대조군은 P. acnes만을 처리 한 후 혈청제거 배지만을 넣어 배양하였다. 헴프시드 추출물 처리 후 상등액을 모아 실험에 사용하였다. 0.1% gelatin이 함유된 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 사용하여 세포배양액을 1차원 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 3차 증류수에 세척한 후 2.5% Triton X-100 용액에 세척 한 후, 현상 버퍼(developing buffer) [50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM NaCl, 0.05% Brij35, pH 7.6]에 넣고 37℃에서 12 시간 이상 반응시켰다. 그 후, 코마시브릴리언트블루(coomassie brilliant blue) 염색용액으로 염색 후 탈색였다. 그 후 단백질 분해활성(proteolytic activity)이 일어난 투명밴드를 정량하여 MMP-9의 활성을 측정하였다.

5.3. 헴프시드 추출물의 시험관 내(in vitro) 세포재생 효능 측정

헴프시드 추출물의 세포재생 효능을 측정하고자, 섬유아세포에서 헴프시드 추출물의 세포증식 촉진 효과를 평가하였다. Hs68 섬유아세포는 10% FBS(Fetal bovien serum)가 첨가된 DMED(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 계대배양 하였다. Hs68 세포를 1×10⁴ 세포로 분주 한 후 24시간 동안 안정화시켰다. 그 후 기존의 배지를 제거하고, 헴프시드 추출물을 처리하여 48시간동안 배양하면서 세포수의 증가 정도를 측정하였다.

실시예 6. 피지분비세포에서 헴프시드 추출물의 지질대사 조절 효능 측정

6.1. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

피지선세포(Sebocyte)의 인슐린 유사 성장인자-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)에 의한 지질합성 정도와 지질합성이 유도된 Sebocyte 세포에서의 헴프시드 추출물의 피지분비 억제 효과를 확인하기 위해 수거한 세포에서 분리한 단백질은 Bradford법으로 정량하고 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 각각의 일차 항체(AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, PPARγ, FAS, AMPKα, p-AMPKα, FoxO1, p-FoxO1 그리고 SREBP1)와 그에 맞는 이차 항체로 반응 시키고 이후 현상된 이미지를 비교 분석 하였다.

6.2. 5-Lipoxygenase 저해능 측정

IGF-1으로 지질합성이 유도된 피지선세포(Sebocyte)에서 전 염증성 지질인 류코트리엔-B4(leukotriene-B4, LT-B4)의 방출을 유도하는 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase)의 농도를 측정하기 위해 헴프시드 추출물을 농도별로 처리 후 실험군과 대조군의 상등액을 회수하였다. 각각 5-lipoxygenase에 대한 ELISA 키트를 이용하여 ELISA 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

<실험결과>

실험예 1. 헴프시드 추출물의 항균 효과

도 1은 헴프시드 추출물의 P. acnes에 대한 항균력을 나타낸다. 0, 15, 20, 25%(v/v)의 헴프시드 추출물을 P. acnes에 처리하였다. 양성대조군으로 에리트로마이신(erythromycin) 3ppm(0.0003%)을 처리하였다. 헴프시드 추출물의 15%(v/v) 농도와 에리트로마이신(erythromycin) 농도 3ppm에서의 항균 활성은 각각 61%와 69%를 나타냈으며, 헴프시드 추출물은 농도가 증가할수록 강한 항균 효과를 나타냈다.

실험예 2. 여드름균에 의해 유도된 염증 억제 효과

도 2는 헴프시드 추출물의 염증성 단백질인 iNOS, COX-2 및 IL-1β 발현에 미치는 영향을 나타낸다. HaCaT 세포에 heat-killed된 P. acnes 처리 후 0, 0.15, 0.3, 0.6 %(v/v)의 헴프시드 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. P.acnes에 의해 증가한 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현은 헴프시드 추출물에 의해 유의하게 감소되었다. 특히, iNOS와 IL-1β는 P.acnes 군과 비교하여 헴프시드 추출물을 처리였을 때 발현이 유의하게 감소하였으며, COX-2는 0.6%의 농도로 처리하였을 때 유의한 발현의 감소를 보였다. 따라서, 여드름균인 P.acnes에 의해 자극 된 HaCaT 세포에서 염증성 단백질인 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현이 유의하게 억제함을 확인하였는바, 헴프시드 추출물이 여드름균에 의해 유발되는 염증을 억제함을 확인하였다.

실험예 3. 여드름균으로 유도된 염증성 in vitro 모델에서 염증성 cytokine 발현 측정

도 3은 헴프시드 추출물이 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-8 발현에 미치는 영향을 나타낸다. HaCaT 세포에 heat-killed된 P. acnes 처리 후 0, 0.15, 0.3, 0.6%의 헴프시드 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. P.acnes에 의해 증가한 IL-8의 발현은 헴프시드 추출물에 의해 유의하게 감소되었다. 특히, P.acnes 만 처리한 군에 비해 헴프시드 추출물 0.6%를 처리한 세포에서 IL-8의 발현이 약 68 %가 저해되었다.

따라서, P.acnes에 의해 자극 된 HaCaT 세포에서 염증성 cytokine인 IL-8의 분비가 유의하게 억제함을 확인하였는바, 헴프시드 추출물에 여드름균에 의한 염증을 억제함을 확인하였다.

실험예 4. NF-κB 시그널 관련 단백질 발현 조절

도 4는 헴프시드 추출물이 염증 관련 시그널인 NF-κB 시그널 관련 단백질 발현(p-IKKα/β, p-IκBα 및 p-NFκB)에 미치는 영향을 나타낸다. HaCaT 세포에 heat-killed된 P. acnes 처리 후 0, 0.15, 0.3, 0.6%의 헴프시드 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

P.acnes에 의해 p-IKKα/β/IKKα, p-IKKα/β/IKKβ, p-IκBα/IκBα 및 p-NFκB/NFκB의 상대적 발현비가 증가하여 상기 시그널의 활성이 증가함을 확인하였으며, 헴프시드 추출물을 처리할 경우 여드름균에 의해 유발된 p-IKKα/β/IKKα, p-IKKα/β/IKKβ, p-IκBα/IκBα 및 p-NFκB/NFκB 상대적 발현비가 감소하여 상기 시그널의 활성이 유의하게 감소되었다. 특히, NF-κB의 상위 시그널에 관여하는 p-IKKα/β의 발현이 헴프시드 추출물 모든 농도에서 매우 유의적인 감소를 보였다.

따라서, 헴프시드 추출물이 HaCaT 세포에서 P.acnes에 의해 유발되는 염증성 시그널인 NF-κB 시그널을 억제하여 항염증 활성을 보임을 확인하였다.

실험예 5. in vitro 콜라겐 합성 촉진 효능 측정

도 5는 헴프시드 추출물이 섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 나타낸다. 헴프시드 추출물이 콜라겐 생산 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 Hs68 세포에 P. acnes를 24시간 동안 감염시켰다. 그 후, 0, 0.15, 0.3, 0.6%의 헴프시드 추출물을 24시간 동안 처리하고 상등액을 사용하여 P.acnes에 의해 손상된 Hs68 세포에서 콜라겐 합성이 감소하는 것을 확인하였으며, 헴프시드 추출물 처리 농도가 증가함에 따라 콜라겐 함량이 증가함을 확인하였다.

즉, 헴프시드 추출물이 P. acnes로 유도된 사람 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진시킴을 확인하였다. 따라서 헴프시드 추출물이 여드름균에 의해 유도되는 콜라겐 감소를 억제하여 여드름으로 인한 흉터 감소효과를 가짐을 확인하였다. 또한, 콜라겐 감소가 억제되어 주름 및 피부 탄력을 개선시킴을 확인하였다.

실험예 6. 헴프시드 추출물의 MMP-9 활성 저해능 측정

도 6은 헴프시드 추출물의 겔라티나아제(gelatinase)인 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 나타낸다. 헴프시드 추출물의 MMP-9 활성 저해능을 알아보기 위해 Hs68 세포에 P. acnes를 24 시간 동안 감염시켰다. 그 후, 0, 0.15, 0.6%의 헴프시드 추출물을 24 시간 동안 처리하고 상등액을 사용하여 자이모그래피(zymography)로 분석하여 MMP-9 활성 저해능을 확인하였다. P.acnes에 의해 MMP-9 활성이 증가하였으며, 헴프시드 추출물을 처리함에 따라 감소하였다. 특히, 0.6%에서 MMP-9의 활성이 유의적으로 감소하였다. 결과적으로, 헴프시드 추출물이 P. acnes로 유도된 사람 섬유아세포에서 MMP-9 활성을 억제시키는 효능을 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 헴프시드 추출물이 여드름균에 의해 유도되는 콜라겐 분해를 억제하여 피부 탄력 및 피부 주름 개선효과를 가지며, 또한 여드름으로 인한 흉터 감소효과 가짐을 확인하였다.

실험예 7. 헴프시드 추출물의 세포증식 촉진 효과 평가

도 7은 헴프시드 추출물의 세포재생 효과를 평가한 결과이다. Hs68 섬유아세포에 0.6% 헴프시드 추출물을 처리하여 48시간동안 배양하면서 세포수의 증가 정도를 측정하였다. 그 결과 헴프시드 추출물을 처리한 경우, 미처리 대조군보다 세포수가 현저히 증가하였다. 즉, 헴프시드 추출물이 세포증식을 촉진하여 피부를 재생시킴을 확인하였다.

실험예 8. 지질합성 억제 효과- AMPK 시그널 관련 단백질 발현 조절

도 8은 헴프시드 추출물의 지질합성 관련 시그널인 AMPK 시그널 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸다. Sebocyte 세포에 피지분비를 유도하기 위해 IGF-1을 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 0, 0.05, 0.15, 0.3%의 헴프시드 추출물을 처리하여 22시간 동안 배양하였다. IGF-1에 의해 SREBP1, p-mTOR, FAS 및 PPARγ의 발현이 증가하였으며, 헴프시드 추출물을 처리한 군에서 IGF-1에 의해 증가한 SREBP1, p-mTOR, FAS 및 PPARγ의 발현이 유의하게 감소되었다.

상위 시그널인 p-AMPKα의 발현은 IGF-1에 의해 감소하였다가 헴프시드 추출물을 처리함으로써 유의하게 증가하였다. 따라서, IGF-1에 의해 자극된 Sebocyte 세포에서 지질합성 시그널인 AMPK 시그널 조절하여 헴프시드 추출물이 피지세포에서 지질합성 저해활성을 나타내어 피지억제 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 9. 지질합성 억제 효과- AKT/FoxO1 시그널 관련 단백질 발현 조절

도 9는 헴프시드 추출물의 지질합성 관련 시그널인 AKT/FoxO1 시그널 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸다. Sebocyte 세포에 피지분비를 유도하기 위해 IGF-1을 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 0, 0.05, 0.15, 0.3%의 헴프시드 추출물을 처리하여 22시간 동안 배양하였다. IGF-1에 의해 p-AKT 그리고 p-FoxO1의 발현이 증가하였으며, 헴프시드 추출물의 처리에 의해 p-AKT 그리고 p-FoxO1의 발현이 유의하게 감소되었다. 특히, 0.6% 농도에서 두 단백질 모두 IGF-1 처리군에 비해 발현이 유의적으로 감소하였다. 따라서, IGF-1에 의해 자극된 Sebocyte 세포에서 지질합성 시그널인 AKT/FoxO1 시그널 조절을 통해 헴프시드 추출물이 피지세포에서 지질합성 저해 활성을 나타냄을 알 수 있다. 즉, 헴프시드 추출물이 피지를 억제함을 확인하였다.

실험예 10. 5-lipoxygenase 발현 억제 효능

도 10은 헴프시드 추출물의 전 염증성 지질인 류코트리엔-B4(leukotriene, (LT)-B4)의 방출을 유도하는 5-lipoxygenase의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. Sebocyte 세포에 피지분비를 유도하기 위해 IGF-1을 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 0, 0.05, 0.15, 0.3%의 헴프시드 추출물을 처리하여 22시간 동안 배양하였다. IGF-1에 의해 증가한 5-lipoxygenase의 발현은 헴프시드 추출물에 의해 유의하게 감소되었다. 특히, 0.6% 농도에서 IGF-1 처리군에 비해 그 발현이 유의적으로 감소하였다. 따라서, IGF-1에 의해 자극된 Sebocyte 세포에서 전 염증성 지질인 leukotriene(LT)-B4의 방출을 유도하는 5-lipoxygenase의 발현 조절을 감소시켜, 피지세포에서 염증성 지질합성을 저해하여 피지와 염증을 억제함을 확인하였다.

상기의 결과들로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 헴프시드 추출물이 여드름균에 항균활성을 가지고, 여드름 유도 각질세포 및 섬유아세포에서 항염증을 비롯하여 콜라겐 합성능력을 가지며, 피지세포에서 지질합성 단백질 억제와 염증성 지질합성 저해 활성을 가지며, 피부재생 효과 역시 우수하다. 따라서 피지 억제, 피부재생과 더불어 P.acnes 균에 의한 여드름 치료에 활용할 수 있다.

Claims (9)

1. 헥산과 에탄올의 혼합 용액으로 추출한 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하며,
   프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성을 가지는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 혼합 용액은 헥산과 에탄올이 1:1의 부피비로 혼합된 것인, 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 헴프시드 추출물은 피지를 억제하는 것인, 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 헴프시드 추출물은 항염 활성을 가지는 것인, 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 헴프시드 추출물은 추가로 피부의 탄력 또는 주름을 개선하기 위해 사용되는 것인, 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 헴프시드 추출물은 추가로 피부재생 또는 흉터를 개선하기 위해 사용되는 것인, 조성물.
8. 헥산과 에탄올의 혼합 용액으로 추출한 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하며,
   프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성을 가지는, 여드름 개선 또는 예방용 의약외품 조성물.
9. 헥산과 에탄올의 혼합 용액으로 추출한 헴프시드 추출물을 유효성분으로 포함하며,
   프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)에 대한 항균활성을 가지는, 여드름 개선 또는 예방용 피부 외용제 조성물.

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