CN112979482B - 一种高纯度l-缬氨酸及其制备方法和其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高纯度L‑缬氨酸的制备方法，包括如下步骤：(1)将待纯化L‑缬氨酸溶液过滤，收集滤液，其中，待纯化L‑缬氨酸溶液的浓度不低于50g/L；(2)调节滤液pH至酸性后，置于弱酸性阳离子树脂中分离，将收集的流出液经脱色、浓缩、降温、析晶、分离、洗涤、干燥，即得。本发明将L‑缬氨酸和杂氨基酸有效分离，产物中单一杂氨基酸含量不高于0.01％，L‑缬氨酸晶体纯度不低于99.9％。且采用纯水作为洗脱剂，环保无污染，有利于后续废水处理。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高纯度L-缬氨酸及其制备方法和其应用。
背景技术
缬氨酸为机体必需氨基酸和营养物质，被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域，被广泛用作食品添加剂、饲料添加剂、营养增补剂、风味剂、化妆品添加剂、药物(如抗生素、除草剂等)的制备前体等方面，市场需求巨大。
L-缬氨酸是机体必须氨基酸和生糖氨基酸，具有保持神经***机能正常运转、增强免疫能力、促进肝脏再生等功效，并被广泛用作营养增补剂或用于制备药物(如缬沙坦、利托那韦和洛匹那韦等)的关键前体。但L-缬氨酸纯度难以满足医药级缬氨酸(纯度不低于99％)的相关要求。
微生物发酵制备L-缬氨酸的方法具有生物基原料、高效率转化、反应温和、环保经济等优点，而被行业广泛运用。该方法以葡萄糖为原料，经微生物发酵获得L-缬氨酸发酵液。发酵液经除菌、脱色、浓缩、结晶、分离等处理，得到L-缬氨酸晶体和L-缬氨酸结晶母液。发酵液中的蛋白质、色素、糖、杂氨基酸(如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)等杂质成分及其含量成为影响L-缬氨酸纯度的关键因素。
L-缬氨酸的纯化方法包括重结晶法、助剂法和离子交换法。因杂氨基酸(如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)的结构和分子量与L-缬氨酸相接近，重结晶法难以有效去除杂氨基酸，且能耗高。采用助剂(对-异丙基苯磺酸或N-苯甲酰-L-丙氨酸)纯化的方法中形成助剂-L-缬氨酸复合物，经分解获得L-缬氨酸，但有机物助剂回收困难，且有机物残留影响产品安全性。离子交换法存在树脂消耗大，洗脱过程中造成污水多等环保问题。为此，需要研究提纯效率更高、绿色环保的L-缬氨酸纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度L-缬氨酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将待纯化L-缬氨酸溶液过滤，收集滤液，其中，待纯化L-缬氨酸溶液的浓度不低于50g/L；
(2)调节滤液pH至酸性后，置于弱酸性阳离子树脂柱中分离，将收集的流出液经脱色、浓缩、降温、析晶、分离、洗涤、干燥，即得。
本发明的优选技术方案，所述待纯化的L-缬氨酸溶液为待纯化的L-缬氨酸配制而成，所述待纯化的L-缬氨酸的纯度不高于98％。
本发明的优选技术方案，步骤(1)中的过滤选自普通过滤、纳滤、超滤中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中调节滤液pH的酸碱物质选自硫酸、磷酸、乙酸、盐酸、硝酸中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中滤液pH 1-6，优选pH 2-5，更优选pH 3-4。
本发明的优选技术方案，所述步骤(2)中，所述弱酸性阳离子树脂具有羧酸基团或磷酸基团，优选为JK110、HD-2、DK110、D152、D113、HZD-2、HD-1、DOWEXTMMAC-3、DOWEXTMUPCORE MAC-3中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中的弱酸性阳离子树脂柱至少1根，优选为2-6个树脂柱串联，更优选为3-4根树脂柱串联。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中的树脂的工作温度为15-50℃，优选为25-30℃。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中的树脂的高径比为(3-10):1，优选为(5-6):1。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中的待纯化的L-缬氨酸溶液流速为1-4柱体积/h。
本发明的优选技术方案，步骤(2)中树脂的洗脱剂为纯水，流速为1-4柱体积/h。
本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中，所述脱色为活性炭脱色，活性炭的使用量为0.1-5％，优选使用量为0.2-1％。
本发明的优选技术方案，所述步骤(3)中，所述脱色温度为30-80℃，优选为40-60℃。
本发明的优选技术方案，所述脱色时间为0.1-2小时，优选为0.5-1.5小时。
本发明的优选技术方案，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述浓缩温度为40-90℃，优选为50-80℃，最优选为60-70℃。
本发明的优选技术方案，所述浓缩至浓缩液中的L-缬氨酸浓度≥400g/L。
本发明的优选技术方案，所述析晶选自自然冷却降温析晶、强制冷却降温析晶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述析晶温度为10-15℃，结晶时间为1-2小时。
本发明的优选技术方案，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述洗涤溶剂为纯水。
本发明的优选技术方案，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种或其组合，干燥温度不低于120℃。
本发明的优选技术方案中，制得的L-缬氨酸晶体的纯度不低于99.9％，单一杂氨基酸含量不高于0.01％。
本发明的目的在于高纯度L-缬氨酸用于制备药品、医药中间体、医药原料、营养增补剂、氨基酸类药的任一种中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
本发明中的树脂体积即弱酸性阳离子树脂的装填量，单位为BV。
除非另有说明，本发明采用如下检测方法：
1.L-缬氨酸晶体纯度
采用文献1(何晨光等，用高效液相色谱定量分析分支链氨基酸，生物技术通讯，2009年第20卷第4期)公开的高效液相色谱法检测。
2.杂氨基酸量
仪器以及试剂：岛津LC-16液相色谱仪，C18色谱组，衍生剂为5％的邻苯二甲醛乙醇水溶液、30％甲醇流动相，缬氨酸标准品为西格玛分析标准品，杂氨基酸为市售的含量99％的其它氨基酸。
实验步骤：产物稀释至0.5-2g/L后，过滤，加衍生剂衍生2分钟，衍生后进样，波长234nm，进样量10ul，通过标准品峰面积计算样品中氨基酸浓度。
杂氨基酸量＝杂氨基酸标准品峰面积/杂氨基酸峰面积*杂氨基酸标准品浓度。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明将L-缬氨酸和杂氨基酸有效分离，L-缬氨酸晶体纯度不低于99.9％，单一杂氨基酸含量不高于0.01％。
2、本发明采用纯水作为洗脱剂，环保无污染，有利于后续废水处理。
3、本发明采用连续化操作，树脂利用率高，分离效率高，具有工业化生产的技术前景。
附图说明
图1实施例1-4和对比例1的L-缬氨酸晶体纯度
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
(1)将纯度为98％的L-缬氨酸1200g，加水溶解，将其制成浓度为60g/L的溶液20L，将溶液加热至35-40℃后，过800分子量纳滤膜，过膜进口压力1.5Mpa，收集清液；
(2)清液加85％磷酸调节pH为2.5后，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号树脂柱、2号树脂柱、3号树脂柱、4号树脂柱，所述树脂柱内填充JK110型弱酸性阳离子树脂，树脂柱工作温度为40℃，树脂柱的高径比为4：1，收集流出液；
(3)向收集的流出液中加入0.5％活性炭，在50℃下搅拌脱色60分钟，过滤，收集脱色液，将其置于65℃下减压浓缩至浓度为L-缬氨酸≥400g/L的浓缩液；
(4)将浓缩液降温至10-15℃，析晶1.5小时，将结晶溶液进行离心处理，离心收集晶体用水淋洗，收集晶体经干燥，制得L-缬氨酸晶体967.8g(纯度见图1，单一杂氨基酸≤0.01％)。
实施例2
(1)将纯度为98％的L-缬氨酸1200g，加水溶解，将其制成浓度为60g/L的溶液20L，将溶液加热至35-40℃后，过800分子量纳滤膜，过膜进口压力1.5Mpa，收集清液；
(2)清液加85％磷酸调节pH为3后，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号树脂柱、2号树脂柱、3号树脂柱、4号树脂柱，所述树脂柱内填充DK110型弱酸性阳离子树脂，树脂柱工作温度为40℃，树脂柱的高径比为4：1，收集流出液；
(3)向收集的流出液中加入0.5％活性炭，在50℃下搅拌脱色60分钟，过滤，收集脱色液，将其置于65℃下减压浓缩至浓度为L-缬氨酸≥400g/L的浓缩液；
(4)将浓缩液降温至10-15℃，析晶1.5小时，将结晶溶液进行离心处理，离心收集晶体用水淋洗，收集晶体经干燥，制得L-缬氨酸晶体955.4g(纯度见图1，单一杂氨基酸≤0.01％)。
实施例3
(1)将纯度为98％的L-缬氨酸1200g，加水溶解，将其制成浓度为60g/L的溶液20L，将溶液加热至35-40℃后，过800分子量纳滤膜，过膜进口压力1.5Mpa，收集清液；
(2)清液加85％磷酸调节pH为4后，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号树脂柱、2号树脂柱、3号树脂柱、4号树脂柱，所述树脂柱内填充DOWEXTMMAC-3型弱酸性阳离子树脂，树脂柱工作温度为40℃，树脂柱的高径比为4：1，收集流出液；
(3)向收集的流出液中加入0.5％活性炭，在50℃下搅拌脱色60分钟，过滤，收集脱色液，将其置于65℃下减压浓缩至浓度为L-缬氨酸≥400g/L的浓缩液；
(4)将浓缩液降温至10-15℃，析晶1.5小时，将结晶溶液进行离心处理，离心收集晶体用水淋洗，收集晶体经干燥，制得L-缬氨酸晶体929.1g(纯度见图1，单一杂氨基酸≤0.01％)。
实施例4
(1)将纯度为98％的L-缬氨酸1200g，加水溶解，将其制成浓度为60g/L的溶液20L，将溶液加热至35-40℃后，过800分子量纳滤膜，过膜进口压力1.5Mpa，收集清液；
(2)清液加乙酸调节pH＝3后，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号树脂柱、2号树脂柱、3号树脂柱、4号树脂柱，所述树脂柱内填充HD-1型弱酸性阳离子树脂，树脂柱工作温度为40℃，树脂柱的高径比为4：1，收集流出液；
(3)向收集的流出液中加入0.5％活性炭，在50℃下搅拌脱色60分钟，过滤，收集脱色液，将其置于65℃下减压浓缩至浓度为L-缬氨酸≥400g/L的浓缩液；
(4)将浓缩液降温至10-15℃，析晶1.5小时，将结晶溶液进行离心处理，离心收集晶体用水淋洗，收集晶体经干燥，制得L-缬氨酸晶体965.2g(纯度见图1，单一杂氨基酸≤0.01％)。
对比例1
(1)将纯度为98％的L-缬氨酸1200g，加水溶解，将其制成浓度为60g/L的溶液20L，将溶液加热至35-40℃后，过800分子量纳滤膜，过膜进口压力1.5Mpa，收集清液；
(2)清液加85％磷酸调节pH＝4，以4柱体积/h的流速，进入依次串联的1号树脂柱、2号树脂柱、3号树脂柱、4号树脂柱，所述树脂柱内填充HD-8型强酸性阳离子树脂，树脂柱工作温度为40℃，树脂柱的高径比为4：1，收集流出液；
(3)向收集的流出液中加入0.5％活性炭，在50℃下搅拌脱色60分钟，过滤，收集脱色液，将其置于65℃下减压浓缩至浓度为L-缬氨酸≥400g/L的浓缩液；
(4)将浓缩液降温至10-15℃，析晶1.5小时，将结晶溶液进行离心处理，离心收集晶体用水淋洗，收集晶体经干燥，制得L-缬氨酸晶体921.1g(纯度见图1，单一杂氨基酸≤0.01％)。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (18)
1.一种高纯度L-缬氨酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待纯化L-缬氨酸溶液过滤，收集滤液，其中，待纯化L-缬氨酸溶液的浓度不低于50g/L；
(2)调节滤液pH至3-4后，置于弱酸性阳离子树脂中分离，待纯化的L-缬氨酸溶液流速为1-4柱体积/h，树脂的工作温度为15-50℃，树脂的高径比为3-10：1，将收集的流出液经脱色、浓缩、降温、析晶、分离、洗涤、干燥，即得；
所述弱酸性阳离子树脂为JK110、DK110、DOWEXTMMAC-3、HD-1中任一种或其组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待纯化的L-缬氨酸溶液为待纯化的L-缬氨酸配制而成，所述待纯化的L-缬氨酸的纯度不高于98％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的过滤选自普通过滤、纳滤、超滤中的任一种或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中调节滤液pH的酸碱物质选自硫酸、磷酸、乙酸、盐酸、硝酸中的任一种或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的弱酸性阳离子树脂为2-6个树脂柱串联。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中树脂的洗脱剂为纯水，流速为1-4柱体积/h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述脱色为活性炭脱色，活性炭的使用量为0.1-5％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述脱色温度为30-80℃。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱色时间为0.1-2小时。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种或其组合。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩温度为40-90℃。
12.如权利要求1述的方法，其特征在于，所述浓缩至浓缩液中的L-缬氨酸浓度≥400g/L。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述析晶选自自然冷却降温析晶、强制冷却降温析晶的任一种或其组合。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述析晶温度为10-15℃，结晶时间为1-2小时。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种或其组合。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤溶剂为纯水。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种或其组合，干燥温度≥120℃。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制得的L-缬氨酸晶体的纯度不低于99.9％，单一杂氨基酸不高于0.01％。
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