CN109020854A - 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法 - Google Patents

一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109020854A
CN109020854A CN201811209771.6A CN201811209771A CN109020854A CN 109020854 A CN109020854 A CN 109020854A CN 201811209771 A CN201811209771 A CN 201811209771A CN 109020854 A CN109020854 A CN 109020854A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methionine
fermentation liquid
extracted
added
obtains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811209771.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109020854B (zh
Inventor
柳志强
熊能
陈涛
余茹
薛亚平
郑裕国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN201811209771.6A priority Critical patent/CN109020854B/zh
Publication of CN109020854A publication Critical patent/CN109020854A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109020854B publication Critical patent/CN109020854B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/26—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C319/28—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中提取L‑蛋氨酸的方法，将含L‑蛋氨酸的发酵液调节pH至1.5‑4后，过滤，取滤液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，将含L‑蛋氨酸的洗脱液用活性炭脱色后减压浓缩，取浓缩液加入异丙醇搅拌结晶，取晶体用超纯水洗涤至无醇，干燥，得到L‑蛋氨酸。本发明首次采用离子交换树脂从发酵液中分离蛋氨酸，大大降低了分离的成本，收率和纯度也都能达到工业生产的水平；本发明方法操作简单、步骤短，所用试剂成本低、易得，具有较好的工业化前景。整个过程获得产品的收率高，最后得到的产品质量好，纯度高达99％，质量收率高达85％。

Description

一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生化工程领域，特别是一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法。
背景技术
蛋氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。因其不能在体内自身生成，所以必须由外部获得。
目前工业生产蛋氨酸的方法主要是化学法。化学法工艺是以丙烯醛、甲硫醇为原料生产甲硫基丙醛(TPMA)，TPMA再与***或氰氢酸合成海因(Hydantoin)，海因经碱水解，再用酸(或CO2)酸化，生产固体蛋氨酸，但是化学法通常只能生产DL-蛋氨酸。专利CN104755625A报道了一种化学法生产L-蛋氨酸的方法，O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-蛋氨酸和H3PO4，但是这种方法成本较高，不适合大规模工业生产。专利CN1894417A提供了一种从发酵液中分离L-蛋氨酸的方法，该工艺采用先加热提高甲硫氨酸的溶解度，然后进行蒸发冷却结晶的方法生产蛋氨酸。该方法里面需要将发酵液加热到很高的温度，大大增加了能耗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从L-蛋氨酸发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，操作简单，成本也较低，能对发酵液中L-蛋氨酸的分离达到很好的效果。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，所述方法为：
(1)发酵液的预处理：对发酵法产生的含有L-蛋氨酸发酵液调pH至1.5-4(优选1.5-3)后，使一些盐离子沉淀下来，再使用陶瓷膜过滤，得到L-蛋氨酸滤液以及菌体蛋白，取滤液，即为预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得预处理液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，依次用去离子水和0.5-5mol/L氨水洗脱，根据茚三酮显色反应收集含L-蛋氨酸的洗脱液，不显紫色时停止收集；
(3)脱色：将步骤(2)含L-蛋氨酸的洗脱液用活性炭在35℃-80℃(优选40-65℃)水浴摇床里进行脱色，过滤，取滤液，即为含L-蛋氨酸的脱色液；
(4)结晶：将步骤(3)中的含L-蛋氨酸的脱色液减压浓缩至原体积的5-10％，取浓缩液加入异丙醇，在0℃-20℃(优选0℃)条件下搅拌结晶，取晶体用去离子水洗涤至无醇，干燥(优选0℃真空干燥或喷雾干燥)，得到L-蛋氨酸。
进一步，步骤(1)陶瓷膜孔径40-70nm，优选50nm。
进一步，步骤(2)强酸型阳离子交换树脂为氢型，优选为下列型号之一：001x7、D296、D072、D061、D301或D001cc，更优选D061。
进一步，步骤(2)所述柱层析所用离子交换柱高径比为5-20:1，优选15:1，上样流速为0.5-2.0BV/h，优选1.0-2.0BV/h，最优选1BV/h。
进一步，步骤(2)所述洗脱方法为：先用超纯水冲洗3.0-4.0BV(优选3.0BV)，再用0.5-5.0mol/L(优选2.0-3.0mol/L)氨水以0.5-2.0BV/h(优选1.0-2.0BV/h，最优选1BV/h)流速洗脱，收集含L-蛋氨酸的洗脱液。
进一步，步骤(3)活性炭的用量以洗脱液体积计为1.0g/L-10.0g/L，优选6.0-10.0g/L。
进一步，步骤(4)所述减压浓缩条件：温度40-80℃、100rpm，更优选50-65℃。
进一步，步骤(4)所述异丙醇的体积用量以浓缩液体积计为2％-10％，优选10％。
进一步，所述L-蛋氨酸发酵液中含5.0-30.0g/L(优选10-20g/L)的L-蛋氨酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明的优点是首次采用离子交换树脂进行分离蛋氨酸，大大降低了分离的成本，收率和纯度也都能达到工业生产的水平。
(2)本发明方法操作简单、步骤短，所用试剂成本低、易得，具有较好的工业化前景。
(3)整个过程获得产品的收率高，最后得到的产品质量好，纯度高达99％，质量收率高达85％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
本发明所述去离子水是用去离子纯水机除去水中的离子态杂质而得到的近于纯净的水。2％茚三酮溶液配制方法为：将2.0g茚三酮与0.08g氯化亚锡溶于100mL蒸馏水中，然后搅拌过滤，取滤液避光保存。本发明所述收率均为质量百分收率。
实施例1
1、蛋氨酸发酵液
步骤1：将大肠杆菌E.coliW3110中metJ、metI基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建成E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH(Jiangfeng Huang etal.2016.Metabolic engineering of Escherichia coli for microbial production ofL-methionine.Biotechnology and Bioengineering.114:843-851)。将E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH菌株先接种到100mL LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm摇床上过夜培养。
步骤2：再将步骤1中的100mL培养液接种到有3.0L MS培养基的发酵罐中培养，在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h。得到3.0L发酵液，液相检测L-蛋氨酸含量16.4g/L。
LB培养基：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母提取物，10.0g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20.0g/L、(NH4)2SO4 16.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、酵母提取物2.0g/L、CaCO3 10.0g/L(单独灭菌)，1.0mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1.0mL/L微量元素溶液组成：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/LCuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去一些菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(等体积1.0mol/L HCl浸泡2h后用蒸馏水洗到中性，再用等体积的1.0mol/LNaOH浸泡2h后用蒸馏水洗到中性，最后用等体积的1.0mol/LHCl浸泡2h，然后用蒸馏水洗到中性待用。)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液300mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液300mL。
步骤4：将300mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到成品L-蛋氨酸1.39g，纯度99.3％，收率85％。
实施例2
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝1.5，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液310mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液310mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液310mL。
步骤4：将310mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入2.8mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.389g，纯度98.9％，收率83.8％。
实施例3
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型001x7阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液280mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液280mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液280mL。
步骤4：将280mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到25mL浓缩液。
步骤5：向25mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.21g，纯度94％，收率74％。
实施例4
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为0.5BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液310mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液310mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液310mL。
步骤4：将310mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.39g，纯度99％，收率85％。
实施例5
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为2.5BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上中的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液210mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液210mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液210mL。
步骤4：将210mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向20mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃水浴条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.004g，纯度98.4％，收率61％。
实施例6
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用0.5mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液390mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液390mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液390mL。
步骤4：将390mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.37g，纯度99.3％，收率83.6％。
实施例7
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用5.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液300mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液300mL。
步骤4：将300mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.38g，纯度98.6％，收率84.3％。
实施例8
1，蛋氨酸发酵液，同实施例1
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以0.5BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液240mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液240mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液。
步骤4：将240mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向20mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到成品L-蛋氨酸1.39g，纯度98.9％，收率85％。
对比例1
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝1.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去发酵液中的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液150mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液150mL中加入5.0g活性炭(80目)，在60℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液150mL。
步骤4：将150mL脱色液加入旋蒸仪中以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到15mL浓缩液。
步骤5：向15mL浓缩液中加入1..0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品0.18g，纯度98.5％，收率为11％。
对比例2
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝5.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用3.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液200mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液200mL中加入2.0g活性炭(80目)，在80℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液。
步骤4：将200mL脱色液加入旋蒸仪中以80℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向浓缩液20mL中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用30mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品0.91g，纯度99.5％，收率达到55％。
对比例3
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝9.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液100mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液100mL中加入2.0g活性炭(80目)，在60℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤4：将100mL脱色液加入旋蒸仪中以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品0.098g，纯度98.5％，收率为6％。
对比例4
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D101阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液120mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液100mL中加入5.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤4：将120mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.118g，纯度83％，收率7.2％。
对比例5
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型201x7阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液120mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液120mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液120mL。
步骤4：将120mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.092g，纯度87％，收率5.6％。
对比例6
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为3.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液160mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液160mL中加入8.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液160mL。
步骤4：将160mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.52g，纯度99％，收率32％。
对比例7
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：将300mL洗脱液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤4：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.41g，纯度87％，收率85.9％。
对比例8
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入10.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤3：将100mL洗脱液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤4：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.54g，纯度68.3％，收率93.9％。

Claims (10)

1.一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于所述方法为：
(1)发酵液的预处理：将含L-蛋氨酸的发酵液调节pH至1.5-4后，陶瓷膜过滤，取滤液，即为预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得预处理滤液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，依次用超纯水和0.5-5.0mol/L氨水洗脱，收集含L-蛋氨酸的流出液；
(3)脱色：将步骤(2)含L-蛋氨酸的洗脱液用活性炭在35℃-80℃水浴条件下脱色，过滤，取滤液，即为含L-蛋氨酸的脱色液；
(4)结晶：将步骤(3)含L-蛋氨酸的脱色液减压浓缩至原体积的5-10％，取浓缩液加入异丙醇，在0℃-20℃下搅拌结晶，取晶体用去离子水洗涤至无醇，干燥，得到L-蛋氨酸。
2.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(1)所述发酵液中含5-30g/L的L-蛋氨酸。
3.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(1)陶瓷膜孔径为30-90nm。
4.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(2)柱层析所用离子交换柱高径比为2-30:1，上样流速为0.5-2.0BV/h。
5.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(2)所述洗脱的方法为：先用超纯水冲洗3-4BV，再用0.5-5.0mol/L氨水以0.5-2.0BV/h流速洗脱，收集含L-蛋氨酸的流出液。
6.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(2)所述强酸型阳离子交换树脂型号为下列之一：001x7、D296、D072、D061、D301或D001cc。
7.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(3)活性炭的用量以洗脱液体积计为1.0g/L-10.0g/L。
8.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中减压浓缩条件为40-80℃、100rpm。
9.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)所述异丙醇的体积用量以浓缩液体积计为2％-10％。
10.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)所述干燥方法为真空干燥或喷雾干燥。
CN201811209771.6A 2018-10-17 2018-10-17 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法 Active CN109020854B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811209771.6A CN109020854B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811209771.6A CN109020854B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109020854A true CN109020854A (zh) 2018-12-18
CN109020854B CN109020854B (zh) 2020-10-27

Family

ID=64613170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811209771.6A Active CN109020854B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109020854B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112979482A (zh) * 2020-12-25 2021-06-18 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种高纯度l-缬氨酸及其制备方法和其应用
CN113891876A (zh) * 2019-09-10 2022-01-04 Cj第一制糖株式会社 L-高丝氨酸的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4463094A (en) * 1980-03-21 1984-07-31 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Fermentation production of L-threonine
CN1894417A (zh) * 2003-12-18 2007-01-10 巴斯福股份公司 从发酵液中分离甲硫氨酸的方法
US20120201951A1 (en) * 2009-10-14 2012-08-09 Roquette Freres Methionine-rich composition for feeding animals
CN104093704A (zh) * 2011-12-08 2014-10-08 罗盖特公司 用于动物饲料的蛋氨酸组合物
CN107893089A (zh) * 2016-10-03 2018-04-10 味之素株式会社 用于生产l‑氨基酸的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4463094A (en) * 1980-03-21 1984-07-31 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Fermentation production of L-threonine
CN1894417A (zh) * 2003-12-18 2007-01-10 巴斯福股份公司 从发酵液中分离甲硫氨酸的方法
US20120201951A1 (en) * 2009-10-14 2012-08-09 Roquette Freres Methionine-rich composition for feeding animals
CN104093704A (zh) * 2011-12-08 2014-10-08 罗盖特公司 用于动物饲料的蛋氨酸组合物
CN107893089A (zh) * 2016-10-03 2018-04-10 味之素株式会社 用于生产l‑氨基酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN-FENG HUANG 等: "Metabolic Engineering of Escherichia coli for Microbial Production of L-Methionine", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
SWAPAN KUMAR RAY: "STUDIES OF EXTRACELLULAR METHIONINE PRODUCTION BY BACILLUS MEGATERIUM ISOLATED FROM SOIL", 《THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY ( SCIENCE ) OF THE UNIVERSITY OF CALCUTTA》 *
郝利平 主编: "《食品添加剂》", 30 June 2004, 中国农业出版社出版 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113891876A (zh) * 2019-09-10 2022-01-04 Cj第一制糖株式会社 L-高丝氨酸的制备方法
US11840496B2 (en) 2019-09-10 2023-12-12 Cj Cheiljedang Corporation Method of preparing L-homoserine
CN113891876B (zh) * 2019-09-10 2024-05-28 Cj第一制糖株式会社 L-高丝氨酸的制备方法
CN112979482A (zh) * 2020-12-25 2021-06-18 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种高纯度l-缬氨酸及其制备方法和其应用
CN112979482B (zh) * 2020-12-25 2024-02-02 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种高纯度l-缬氨酸及其制备方法和其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109020854B (zh) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104774881B (zh) 一种生物催化生产L-α-氨基丁酸的方法
CN109020854A (zh) 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法
EP1927586B1 (en) Process for producing 5-aminolevulinic acid hydrochloride
CN106831894A (zh) 一种脱乙酰基耦合吸附分离d‑氨基葡萄糖盐酸盐的方法
CN109628518B (zh) 一种生产和提取l-谷氨酰胺的方法
CN104478746B (zh) 一种dl-赖氨酸的制备方法
CN101445466B (zh) 生物催化法生产2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的提纯方法
CN109666051A (zh) 一种春雷霉素的纯化方法
CN107522629A (zh) 一种门冬氨酸鸟氨酸的制备方法
CN112645357B (zh) 一种硫酸钠母液的后处理方法
CN100509757C (zh) 15n-l-精氨酸的分离提纯方法
CN1935825A (zh) S－腺苷－l－甲硫氨酸硫酸盐的制备方法
CN108752224B (zh) 一种醋酸赖氨酸原料药的制备方法
CN113881725A (zh) 一种电渗析制备1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐的方法
CN104313071A (zh) 高纯L-α-氨基酸的生物合成方法
CN111718287A (zh) 一种n-乙酰-l-半胱氨酸的电渗析提取方法
CN112409426A (zh) 一种硫酸西索米星的制备方法
CN106381316B (zh) 一种α-酮戊二酸钠的制备方法及提纯方法
CN101139382A (zh) 一种五区模拟移动床色谱法分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法
CN108315375A (zh) 一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法
CN116621920B (zh) 一种还原型谷胱甘肽的制备方法
CN115894311B (zh) (2s,3r)-2-氨基-3-羟基-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)丙酸乙酯的制备
CN115074293B (zh) 一种甘油葡糖苷提纯工艺
CN106946765B (zh) 重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法
CN113912508A (zh) 一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant