CN109666064A - SALL4-RBBp4复合物阻断多肽和衍生抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents
SALL4-RBBp4复合物阻断多肽和衍生抗肿瘤多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有靶向抑制SALL4‑RBBp4复合物形成能力的多肽和抗肿瘤多肽及其应用，所述的具有靶向抑制SALL4‑RBBp4复合物形成能力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，可用于制备抗肿瘤药物；所述抗肿瘤多肽包括靶向抑制SALL4‑RBBp4复合物形成的结构域和和穿膜结构域，所述靶向抑制SALL4‑RBBp4复合物形成的结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该抗肿瘤多肽可用于制备抗肿瘤药物。本发明的抗肿瘤多肽具备显著的抗肿瘤活性，而抗肿瘤多肽的穿膜肽结构域本身没有细胞毒性。本发明的抗肿瘤多肽对正常细胞没有细胞毒性，可以单独作为抗肿瘤药物或辅助其他治疗方式进行辅助肿瘤治疗。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种具有靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成能力的多肽和一种抗肿瘤多肽及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是继心脑血管疾病之后第二种研究威胁人类健康的疾病。据世界卫生组织统计，每年全世界约700万人因恶性肿瘤失去生命，且肿瘤死亡人数将持续上升，预计到2030年全世界每年因肿瘤死亡的人数将超过1300万。
目前，针对恶性肿瘤的治疗手段主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗等。手术切除是肿瘤治疗最主要的手段之一，然而很多肿瘤发现时已无法手术切除。放疗和化疗能显著抑制肿瘤的进展，然而这些治疗手段往往会对机体正常组织造成很大的毒副作用。肿瘤靶向治疗是针对已经明确的致癌靶点设计药物，利用药物特异地选择致癌位点来相结合并发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡。通常正常组织或细胞中不存在相应的致癌靶点，靶向药物不会波及正常组织或细胞，因而靶向药物对于患者的副作用明显小于化疗药物。近年来靶向治疗是肿瘤治疗的热点手段，而设计开发特异性高、副作用小、疗效显著的靶向药物分子则是肿瘤靶向治疗成功的关键。
靶向多肽是一类根据靶标蛋白的分子表面结构、氨基酸组成以及表面电荷等因素，模拟蛋白-蛋白相互作用的模式进行设计优化的多肽分子，能够与靶标蛋白分子特异性的结合，从而影响靶标蛋白的正常功能或实现靶向递送的功能。由于此类靶向多肽分子具有高亲和力、高选择性、低毒性、易于合成等优点，使其成为了一类理想的靶向药物分子，目前科学家们也基于多肽分子开发出了能够治疗多种疾病的新型靶向多肽药物。
SALL4是维持干细胞多能性的核心因子，在胎儿细胞中特异性表达，在大多数成人组织中表达下调或缺失。SALL4与Oct4、Nanog和Sox2形成核心转录调控网络，驱动胚胎干细胞的自我更新。SALL4的转录活性对胚胎干细胞自我更新以及抑制分化相关基因的转录具有双重作用。然而研究发现，在一些恶性肿瘤中SALL4的表达又重新激活，而且常常与预后不良有关。在肝癌中的研究证明，多达55%的肝细胞癌（HCC）患者中组织中存在SALL4的过度激活，而SALL4的转录调控活性正是肝细胞癌恶性程度的关键的驱动因素。同时，研究证明SALL4可以作为肿瘤干/祖细胞的生物标记物。
核小体重塑脱乙酰酶（NuRD）复合物是染色质重塑的调节者，参与胚胎干细胞和成体细胞中很多关键调节基因的沉默。NuRD 具有ATPase和组蛋白脱乙酰酶两种独立的酶活，通过CDH3/4 ATPase亚基重新定位核小体，以便组蛋白脱乙酰酶（HDAC1/2）亚基接近靶基因在基因组上的调控位点并抑制靶基因。视网膜母细胞瘤结合蛋白4（RBBP4）是NURD的亚基。它是一种含有WD40重复序列的蛋白质，由七叶β螺旋桨结构域组成。在NuRD中，RBBp4通过将组蛋白H3和H4结合到新复制的DNA上，在核小体组装中起分子伴侣的作用。研究发现，SALL4在NuRD复合物的募集组建过程中发挥重要作用。在肿瘤细胞中，SALL4通过RBBP4的相互作用募集NuRD复合物，从而参与诸多抑癌基因如PTEN的沉默，促进肿瘤的进展。因此，设计靶向抑制SALL4-RBBp4相互作用的多肽分子，通过阻断NuRD的募集，解除抑癌基因的沉默状态，是抑制肿瘤细胞生存的极好方式。
高效的透膜效率是多肽分子抑制胞内靶点的关键条件之一，而穿膜肽则是极好的穿膜载体之一。穿膜肽是一类具备携带正电荷短肽，具有很强穿透细胞膜能力，可以直接进入细胞浆和细胞核，可作为载体携带药物进行细胞。穿膜肽对正常组织的毒副作用很小，因此利用穿膜肽携带SALL4-RBBp4靶向多肽分子进行多肽药物设计是一个极具前景的抗肿瘤靶向药物开发的方向。
发明内容
本发明设计了一种靶向抑制SALL4-RBBp4相互作用的八肽小分子，利用穿膜肽和八肽小分子进行共价键链接，获得一种十九肽药物分子，具备高效的透膜效率和抗肿瘤活性。
本发明提供了一种具有靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成能力的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了上述靶向SALL4-RBBp4复合物的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的结构域和和穿膜结构域，所述靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的结构域氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
优选地，所述穿膜结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述穿膜肽结构位于所述抗肿瘤多肽的N端，所述靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的结构域位于所述抗肿瘤多肽的C端。
本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽在多种肿瘤细胞系、肿瘤细胞系建立的CDX小鼠模型以及PDX小鼠模型中具备显著的抗肿瘤活性，而抗肿瘤多肽的穿膜肽结构域本身没有细胞毒性。本发明的抗肿瘤多肽对正常细胞没有细胞毒性，可以单独作为抗肿瘤药物或辅助其他治疗方式进行辅助肿瘤治疗。
附图说明
图1为SALL4在不同组织来源的人正常细胞和肿瘤细胞中表达的相对定量分析统计图。
图2为多肽的穿膜效率和胞内定位检测的荧光显微镜照片。
图3为多肽对于不同组织来源的人正常细胞和肿瘤细胞的细胞毒性分析统计图。
图4为多肽经腹腔注射在huh7细胞构建的CDX模型体内抗肿瘤效果分析的统计图，左为肿瘤生长曲线，右为肿瘤湿重。
图5为多肽经腹腔注射在MGC-803细胞构建的CDX模型体内抗肿瘤效果分析的统计图，左为肿瘤生长曲线，右为肿瘤湿重。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例一：多肽分子设计和合成
通过生物信息学分析预测SALL4结构，结合已知RBBp4蛋白的晶体解析结构信息，利用计算机分子对接软件分析SALL4-RBBp4的结合结构域和关键氨基酸残基，然后利用多肽-蛋白分子对接软件分析，设计能够高亲和性结合RBBp4蛋白并阻断SALL4-RBBp4相互作用的多肽分子，经筛选获得特异性靶向结合RBBp4的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，以下称靶向肽。
筛选一种穿膜肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，用于引导上述靶向肽能够高效的进入胞浆和细胞核。设计一种抗肿瘤肽，包括穿膜肽序列和靶向肽序列，其中穿膜肽位于N端，靶向肽位于C端，穿膜肽与靶向肽通过共价键链接，抗肿瘤肽序列如SEQ ID NO:3所示。
上述穿膜肽和抗肿瘤肽委托金斯瑞生物科技有限公司采用固相合成的方法进行多肽合成，纯度≥95%，C端进行异硫氰酸荧光素（FITC）标记，其中穿膜肽作为阴性对照。
实施例二：SALL4-RBBp4表达特异性验证
1.从PromoCell公司购买成人原代细胞，包括人心肌细胞、人软骨细胞、人皮肤微血管内皮细胞、人乳腺上皮细胞、人肺成纤维细胞、人肝细胞、人肺动脉平滑肌细胞、人成骨细胞、人皮肤角质形成细胞，利用相应的培养条件培养细胞。
2.复苏培养hepG2、HuH7、Ishikawa、HT29、Caco2、MGC-803、MKN45等肿瘤细胞。
3.利用Trizol法从上述细胞中提取总RNA，并反转为cDNA。
4.针对SALL4两个转录本的共有区序列设计SALL4基因的荧光定量PCR引物，序列如下：；已ACTB基因为内参基因，引物为：F：5´-GGCACTCTTCCAGCCTTCC-3´，R：5´-GAGCCGCCGATCCACAC-3´。
5.利用SYBR Green法对上述细胞中SALL4的表达进行荧光定量PCR检测，利用△△Ct法对上述成人正常组织原代细胞与肿瘤细胞中SALL4的表达进行相对定量分析，验证SALL4在恶性肿瘤细胞中的表达特异性。
检测结果如图1所示。
实施例三：多肽穿膜及细胞定位检测
1.复苏培养HuH7、HT29、Caco2、MGC-803、MKN45、人肝原代细胞。
2.将上述6株细胞按合适的细胞数接种至96孔板，每株细胞接种3复孔。
3.细胞接种6小时后，加入受试多肽，终浓度30uM。
4.在多肽处理的第0，0.5，2，4，8，24h分别记录细胞FITC荧光，评判多肽透膜效率和胞内定位。
检测结果显示多肽能够高效穿透细胞膜，胞内定位在胞浆和胞核。其中将MGC-803细胞作为代表细胞，透膜和胞内定位检测结果如图2所示。
实施例四：多肽体外抗肿瘤活性检测
1.复苏人原代细胞，包括人心肌细胞、人软骨细胞、人皮肤微血管内皮细胞、人乳腺上皮细胞、人肺成纤维细胞、人肝细胞、人肺动脉平滑肌细胞、人成骨细胞、人皮肤角质形成细胞，利用相应的培养条件培养细胞。
2.复苏培养hepG2、HuH7、Ishikawa、HT29、Caco2、MGC-803、MKN45等肿瘤细胞。
3.将上述细胞按3000 cells/孔接种至96孔板。
4.细胞接种6小时后，加入受试多肽，终浓度30uM。
5.在多肽处理的第0，4h，8h，24h，48h分别利用CCK8检测各细胞的活性，评估多肽对于正常细胞和肿瘤细胞的细胞毒性。
检测结果显示穿膜肽对照对细胞无显著毒性。抗肿瘤多肽对人正常原代细胞无显著毒性，而对SALL4表达阳性的肿瘤细胞显示出显著的细胞毒性。检测结果如图3所示。
实施例五：多肽体内抗肿瘤活性检测
1.以HuH7、MGC-803细胞作为多肽体内抗肿瘤活性验证的代表细胞系，复苏细胞，按相应培养条件，在37℃，5% CO2 培养箱培养。
2. 18-22g雌性BALB/c裸小鼠，适应性饲养1周。随机分为两批，其中一批皮下接种HuH7细胞(细胞总数107，体积100ul)，另一批接种MGC-803细胞(细胞总数107，体积100ul)，接种部位在裸鼠右后肢背部。分别构建HuH7细胞CDX模型和MGC-803细胞CDX模型。
3.每天观察肿瘤生长情况和肿瘤大小，测定肿瘤体积（V=0.5×a×b2，其中a表示肿瘤长径，b表示肿瘤短径）；当肿瘤体积≥50mm3时，将HuH7细胞CDX模型和MGC-803细胞CDX模型分别随机分为穿膜肽对照干预组和抗肿瘤肽干预组。
4.穿膜肽对照干预组利用穿膜肽按照15.6mg/kg的剂量进行腹腔注射给药，每2天给药一次，总计给药5次；抗肿瘤肽干预组利用抗肿瘤肽按照26.1mg/kg的剂量进行腹腔注射给药，每2天给药一次，总计给药5次；从首次注射病毒开始，每3天测量肿瘤体积，根据肿瘤体积大小绘制各组裸鼠肿瘤的生长曲线；最后一次给药3天后处死实验动 物，取出肿瘤组织，测量肿瘤湿重；根据肿瘤生长曲线和湿重评估多肽抗肿瘤效果。
检测结果显示穿膜肽对照无显著抗肿瘤活性，而抗肿瘤肽则显示出显著的抗肿瘤效果，肿瘤生长曲线和肿瘤湿重对比如图4-5所示。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。
<110> 上海锐赛生物技术有限公司
<120> SALL4-RBBp4复合物阻断多肽和衍生抗肿瘤多肽及其应用
<130> AJ181881
<160> 3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Phe Ala Lys Phe Gln Trp Ile
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Phe Ala Lys
1 5 10 15
Phe Gln Trp Ile
16
Claims (7)
1.一种具有靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成能力的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的具有靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成能力的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的阻断功能结构域和穿膜功能结构域，所述靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的阻断功能结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜功能结构域氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，抗肿瘤多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
6.根据权利要求3中任一项所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜功能结构域位于所述抗肿瘤多肽的N端，所述靶向抑制SALL4-RBBp4复合物形成的阻断功能结构域位于所述抗肿瘤多肽的C端。
7.权利要求3-6中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
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