CN105063196B - 蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在胆管癌治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在胆管癌治疗中的应用。近年来，磷酸酶与张力蛋白同源物PTEN及其信号通路在肿瘤预防和治疗研究领域受到越来越多的关注。本发明提供了一种以PTEN为靶标的胆管癌的个性化治疗方案，联合运用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂，可以有效地抑制PTEN缺失的胆管癌细胞和原代异种移植肿瘤的生长。本发明以PTEN检测为基础，使用小分子抑制剂和药物，提出了胆管癌的个性化治疗方案，易于临床使用推广。

Description

蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在胆管癌治疗中的 应用

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及在胆管癌中检测PTEN表达的方法，PTEN过表达非增值型腺病毒载体的构建和包装，以及蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂联合在PTEN缺失型胆管癌治疗中的运用。

背景技术：

胆管癌(carcinoma of bile duct，简称CC)指源于肝外胆管包括肝门区至胆总管下端的胆管的恶性肿瘤，是原发性肝癌中的一种，占原发性肝癌比例约为10％；在临床中表现为潜伏期长，恶性程度高，放化疗抵抗，预后差等特点；流行病学显示近年来胆管癌的发病率持续上升，给整个医疗卫生事业带来极大的挑战。随着研究的深入，人们对参与胆管癌发生发展的分子机制也有了更进一步的认识。基因组测序显示，部分CC肿瘤组织中3p,4q,6q,9p,9q,13q,14q,8p,17p,及21q发生缺失，1q和7p有增加。外显子测序显示P53，KRAS，SMAD4，IHD等是在胆管癌中常常突变或激活的基因；JAK-Stat，MAPK，TGFβ-SMAD，PDGF信号通路在胆管癌中经常被激活或放大，促进了胆管癌发生发展；这些分子机制的探索为胆管癌的诊治提供了新的思路(Ong,C.K.et al.Exome sequencing of liver fluke-associated cholangiocarcinoma.Nat Genet,2012,44,690-693)。目前，对于胆管癌的治疗除手术外，化疗是最主要的方式，使用药物有吉西他滨(GEM)和顺铂(DDP)等，但它们都缺乏明确的分子分型靶标，为肿瘤的治疗带来困难。

PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，即MMAC1)是一个重要的抑癌基因，其全称是人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物，其核苷酸Genebank ID号为5728。1997年被两个独立的课题组发现和确认，是继P53之后发现的最重要的抑癌基因，在多种肿瘤中存在突变或缺失(Li,J.et al.PTEN,a putativeprotein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostatecancer.Science,1997,275,1943-1947)。PTEN通过自身脂质磷酸酶活性，拮抗PI3K-Akt-mTOR信号通路，调控细胞多种生理进程，包括：存活，增殖，能量代谢，细胞骨架构建以及细胞间相互识别(Song,M.S.,Salmena,L.&Pandolfi,P.P.The functions and regulationof the PTEN tumour suppressor.Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13,283-296)。因此，调节PTEN表达和功能的机制，在肿瘤发生发展中尤其重要。越来越多的研究发现肿瘤中PTEN缺失与否直接关系着化疗药物的敏感性，有文章指出PTEN的缺失会导致肿瘤细胞基因组不稳定，这种不稳定性恰好适用于某些小分子抑制剂或化疗药物，从而可以实现以PTEN为基础的个性化治疗(Mason,J.M.et al.Functional characterization of CFI-400945,aPolo-like kinase 4inhibitor,as a potential anticancer agent.Cancer Cell,2014,26,163-176)。

蛋白酶体(proteasome)是在真核生物和古菌中普遍存在的结构，主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。抑制蛋白酶体的功能将引起蛋白降解的紊乱，导致细胞出现病理性变化，严重时会引起细胞死亡。目前，临床上应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib治疗多发性骨髓瘤，取得了一定的疗效(Ria,R.,Reale,A.&Vacca,A.Novel agents andnew therapeutic approaches for treatment of multiple myeloma.World JMethodol,2014,4,73-90)。

细胞自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。细胞自噬的现象在机体的生理或病理过程均能观察到，所起的作用需要进一步阐明。有研究报道mTOR(Mammalian target of rapamycin)的抑制剂Rapamycin，CC-223，AZD8055等可以激活细胞自噬，抑制HCC肿瘤细胞系增殖迁移等生物学过程，目前该类部分药物已进入二期临床试验。这提示我们干预自噬，打破细胞的稳态，可以用于疾病的治疗(Ashworth,R.E.&Wu,J.Mammalian target of rapamycin inhibition inhepatocellular carcinoma.World J Hepatol,2014,6,776-782)。

但不论是蛋白酶体的抑制剂，或是细胞自噬的调节剂，在临床上应用均较少。它们都是针对细胞最基本的生命过程，治疗的靶向性较差；已经上市的药物适应症较为单一，目前还不能广泛运用。因此，寻找新的适应症，根据分子分型进行靶向性治疗，是这一类药物急需的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种以PTEN为靶标的胆管癌个性化治疗方案；本发明的另一目的在于提供蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂新的医药用途，即联合蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂可以用于治疗PTEN缺失的胆管癌肿瘤。

为了更好地分析胆管癌的预后风险因素，本发明提供了PTEN在127例胆管癌石蜡组织切片中的免疫组化评分结果，用于评估胆管癌预后不良。本发明发现，在这127例胆管癌患者的肿瘤组织中有63例样本(50％)PTEN表达为阴性，表明PTEN在胆管癌中缺失严重。结合患者的临床统计资料，以Kaplan-Meier法比较PTEN阴性/阳性表达的术后无瘤生存时间(DFS)和总体生存时间(OS)，均体现出显著差异，PTEN阳性的患者预后存活更好。

本发明的第一方面，提供了人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)可以作为肝内胆管癌评估预后的分子标记物。

进一步地，本发明提供了PTEN在制备胆管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。

所述的试剂为检测生物样品中PTEN表达量的试剂；所述的试剂盒包含检测生物样品中PTEN表达量的试剂。

所述的检测生物样品中PTEN表达量的试剂，选自：对PTEN具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。

本发明的第二方面，提供了人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)在制备治疗胆管癌药物中的应用。

所述的药物为提高PTEN表达量的的试剂。

所述的能够提高PTEN表达量的的试剂，选自：PTEN分子、PTEN分子作为活性物质的组合物，或含有PTEN分子的载体等。

所述的PTEN分子为PTEN基因或PTEN蛋白。

所述的含有PTEN分子的载体，可以是PTEN过表达的病毒载体，例如PTEN过表达的腺病毒载体，或PTEN过表达的慢病毒载体等。

本发明提供了一种PTEN过表达腺病毒载体在制备治疗胆管癌药物中的应用；特别是针对PTEN缺失的胆管癌肿瘤。

所述的PTEN过表达腺病毒载体的构建方法为：使用限制性内切酶获得线性化载体；通过PCR扩增获得PTEN cDNA，通过酶切获得与表达载体相同的粘性末端；在连接酶的作用下，将cDNA与线性化的载体相连接，筛选连接成功的质粒并进行测序鉴定。

本发明提供了在胆管癌细胞系中过表达PTEN后的芯片分析结果，所筛选出的信号通路可以作为药物靶点，特别是PTEN缺失的胆管癌细胞系在过表达PTEN后胞内泛素-蛋白酶体信号通路下调，溶酶体-自噬信号通路下调可作为药物治疗的新的靶点。

本发明的第三方面，提供了胆管癌新的治疗方法，以PTEN为靶标，联合蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂治疗PTEN缺失的胆管癌。

本发明提供了蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在制备治疗胆管癌药物中的应用。

进一步地，本发明提供了一种联合用药物，具体的是一种治疗胆管癌的联合用药物，所述的联合用药物其活性成分为蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂。

所述的联合用药物，还可以包含一种或多种药用载体。

所述的蛋白酶体抑制剂，是能抑制蛋白酶体蛋白降解功能的物质，包括但不限于：小分子抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib等，以及其他能引起同样效应的物质例如蛋白酶体核心组分蛋白的shRNA，或调节蛋白酶体组成蛋白的microRNA等；

所述的细胞自噬激活剂，也即细胞溶酶体激活剂，是能上调自噬/溶酶体活性的物质；包括但不限于小分子药物：Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin A、Pifithrin-α等，以及其他能引起同样效应的物质例如促进溶酶体催化功能的基因表达载体，或shRNA，microRNA等。

本发明所述的联用、联合用药物，包括同时或顺序的施用有效量的蛋白酶体抑制剂和有效量的细胞自噬激活剂。所述的顺序可以是先用蛋白酶体抑制剂，再用细胞自噬激活剂；也可以是先用细胞自噬激活剂，再用蛋白酶体抑制剂。

本发明所述的药用载体，即药学上可接受的载体，是指药学领域中常用的除活性成分以外添加物，例如稀释剂(淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐类)、赋形剂等，填充剂如淀粉蔗糖、粘合剂如水、乙醇、纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠，增溶剂如聚山梨酯类和聚氧乙烯脂肪酸酯类等，吸收促进剂、表面活性剂如吐温、司盘，吸附载体、润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等。另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明所述的联合用药物，可以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包合物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、熔胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等，用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等，也可将其制成各种缓释、控释制剂。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。

在本发明的优选实施例，以蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂的给药方式包括静脉注射、口服和局部给药等。

本发明所述的联合用药物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤种类和严重程度等变化，本发明所述的有效量，可以是0.001-1000mg/kg体重，优选日剂量可以是0.01-100mg/kg体重，更优为0.1-50mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明所述的联合用药物，用于治疗胆管癌，优选用于治疗PTEN缺失的胆管癌。

可通过检测胆管癌患者肿瘤中PTEN的表达水平，联合蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂对PTEN缺失的胆管癌患者进行给药。

在本发明的优选实施例，所述的胆管癌包括肝内胆管癌、肝门胆管癌和肝外胆管癌等。

本发明经实验证实，PTEN在50％的胆管癌肿瘤组织中表达为阴性，PTEN的表达显著影响肿瘤患者的预后，PTEN表达阳性的胆管癌患者预后存活更好。

PTEN缺失的胆管癌细胞系由腺病毒回补PTEN后出现死亡，PTEN能够特异性引起细胞中泛素-蛋白酶体信号通路下调，溶酶体-自噬信号通路上调。

蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib对PTEN缺失的胆管癌细胞增殖均有抑制作用，抑制效果最好的是Bortezomib。

细胞自噬激活剂Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin A、Pifithrin-α对PTEN缺失的胆管癌细胞增殖均有抑制作用，抑制剂效果较好的有Rapamycin和Brefeldin A。

联合应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib和细胞自噬激活剂Rapamycin可以有效地抑制PTEN缺失的胆管癌细胞增殖。

联合应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib和细胞自噬激活剂Rapamycin可以有效地治疗PTEN缺失的人源异种移植胆管癌肿瘤。

本发明的有益效果是，这种联合应用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂的方法能有效抑制PTEN缺失的胆管癌细胞系生长，并能有效地治疗人源异种移植的PTEN缺失的胆管癌肿瘤，易于临床使用推广。

附图说明

图1显示在肝内胆管癌手术患者中，PTEN的表达显著肿瘤患者的预后存活。其中A,B,C显示PTEN在胆管癌中的免疫组化染色情况；D和E显示PTEN阳性组和阴性组患者的生存曲线。

图2是本发明中胆管癌细胞系PTEN表达情况检测，以及PTEN过表达腺病毒对胆管癌细胞存活的影响。其中A是四种胆管癌细胞PTEN表达的蛋白质印迹分析图，B,C,D,E显示PTEN回补后RBE和HCCC-9810细胞系增殖和凋亡情况检测。PTEN腺病毒能引起PTEN缺失的胆管癌细胞系死亡。

图3显示基因芯片分析结果，在PTEN腺病毒引起死亡的细胞中，PTEN可以特异性地抑制泛素-蛋白酶体信号通路，同时上调溶酶体功能，促进细胞自噬；A和B显示HCCC-9810中上调和下调最为显著的9条信号通路，下调的有细胞周期(cell cycle),DNA复制(DNAreplication),代谢通路(Metabolic pathway)，蛋白酶体(Proteasome),错配修复(Mismatch repair)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis),P53信号通路(P53signaling pathway)，磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)，2-氧代羧酸代谢(2-Oxocarboxylic acid metabolism)；上调的有粘附相关信号通路(Focal adhesion,CAMs,Tight junction)，内吞(Endocytosis)，细胞外基质受体相互作用(ECM-receptorinteraction)，蛋白糖基化(proteoglycans in cancer)，转录错调(transcriptionalmisregulation)，溶酶体(lysosome),Jak-Stat信号通路；图中黑色柱条显示在HCCC-9810细胞中相对于RBE细胞特异性变化的信号通路，即蛋白酶体(Proteasome),泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)下调，溶酶体(lysosome)信号通路上调。

图4显示各种蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂对胆管癌细胞系HCCC-9810增殖能力的影响。其中A是加入蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib检测细胞的增殖能力；B是加入细胞自噬激活剂Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin-A、Pifithrin-α检测细胞增殖能力。

图5显示联合应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib和细胞自噬激活Rapamycin对胆管癌细胞系的影响。A，B为CCK8细胞增殖能力检测图，C为流式检测细胞PI染色阳性率。

图6显示显示联合应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib和细胞自噬激活Rapamycin对不同PTEN背景的人源胆管癌异种移植瘤的治疗效果。两例胆管癌样品，经免疫组织化学检测PTEN表达，一例为PTEN阴性，另一例为PTEN阳性。接种到裸鼠皮下，当肿瘤长到5mm左右，联合应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib和细胞自噬激活Rapamycin，检测肿瘤生长情况。其中A和B是取裸鼠皮下生长起来肿瘤组织进行免疫组化检测PTEN表达情况图，A中PTEN表达为阳性，B中PTEN表达为阴性；C和D为两例肿瘤的生长曲线图。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib，细胞自噬激活剂Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin A、Pifithrin-α均购自Selleck公司。

pSG5L-HA-PTEN质粒购自Addgene；对照腺病毒购自上海汉恒生物公司；腺病毒载体质粒pDC316和骨架质粒pBHG购自Microbix公司，连入PTEN基因的CDS后，包装病毒。制备方法如下：

根据腺病毒载体pDC316的多酶切位点序列，我们选取EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点作为重组质粒的***位点；设计相应的引物从pSG5L-HA-PTEN质粒中将PTEN的ORF扩增出来，连入pDC316中。通过双酶切鉴定出阳性克隆后，再进行质粒表达鉴定。将鉴定正确的重组质粒pDC316-PTEN与腺病毒骨架质粒pBHG用jetPEI共转至HEK-293A细胞，至细胞出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。用适量的PBS重悬病毒沉淀，收集病毒，测定病毒滴度，分装成小管后置于-80℃保存。

PTEN抗体购自CST公司，货号9559。

胆管癌细胞系HCCC-9810、RBE、QBC939、FRH-201，购自中科院细胞所。

实施例1：通过免疫组织化学方法检测肝内胆管癌患者手术切除术后石蜡包埋的癌及癌旁正常肝组织中PTEN的表达水平。

选取127例胆管癌患者的肿瘤组织的石蜡切片(肝癌组织切片均来自东方肝胆外科医院，由2名病理科医生确诊为肝细胞癌)，采用免疫组化方法检测PTEN蛋白在肝癌组织中的表达量并计算免疫组化评分，并结合患者临床统计资料，以PTEN免疫组织化学检测分析肝内胆管癌患者预后情况。

抗原修复2分钟，一抗使用单克隆兔源PTEN抗体1:75，4℃孵育过夜，以正常兔源IgG抗体1：75作为阴性对照；生物素标记的二抗37℃孵育1小时，DAB显色。根据免疫组化的方法检测肝内胆管癌患者的癌和癌旁肝组织标本中PTEN的表达水平，进行IRS评分***(Wang Q,Tan YX,Ren YB,et al.Zinc finger protein ZBTB20expression is increasedin hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis.BMC Cancer2011；11:271)评分。方法如下：在所有标本的每张切片随机选择五哥视野，每个视野计数100个细胞；根据计数细胞的百分比，PTEN的表达被划分4个等级：1分为1-25％，2分为26-50％，3分为51-75％，4分为76％以上；再根据细胞着色的前度PTEN的表达划分为4个等级：0分为无着色，1分为浅黄色颗粒，2分为黄褐色颗粒，3分为深褐色颗粒。每张切片对应一个百分比分数和着色分数，两者相加即为该切片的最后得分。

图1ABC显示PTEN在肝管癌肿瘤组织中的染色情况，A为阴性，B和C为阳性；通过对127例胆管癌患者的肿瘤组织进行PTEN的免疫组织化学评分，发现其中有63例样本(50％)PTEN表达为阴性，这表明PTEN在胆管癌中缺失严重。结合临床统计资料，以Kaplan-Meier法比较PTEN阴性/阳性表达的术后无瘤生存时间(图1D所示)和总体生存时间(图1E所示)，均体现出显著差异，PTEN阳性的患者预后更好。这提示PTEN可以作为肝内胆管癌评估预后的重要因素，同时干预PTEN的表达也可能是治疗胆管癌的潜在靶点。

实施例2：PTEN过表达腺病毒引起缺失型胆管癌细胞系死亡

将四种胆管癌细胞系HCCC-9810，RBE，QBC939，FRH-201分别传入6孔中，待细胞生长到80％的融汇度后，用150ul的IP裂解液(碧云天，P0013)收取细胞蛋白，超声处理后12000转离心15分钟，定量后加入SDS高温变性，经SDS-PAGE电泳，转膜后用5％的BSA封闭，一抗4℃孵育过夜，再用二抗孵育，用Odyssey扫描检测。

图2A显示HCCC-9810中PTEN表达为阴性；RBE，QBC939，FRH-201中PTEN为阳性。

为进一步研究PTEN对胆管癌细胞的影响，我们将HCCC-9810和RBE传入96孔板中，每孔4000个细胞。贴壁后每种细胞分别加入PTEN腺病毒或对照GFP腺病毒，MOI为30，每组设3个副孔。6个小时后更换为正常培养基，设置为0时刻。分别在0、12、24、36、48、60、72h吸掉培养基，加入用DMEM稀释的10％的CCK8检测试剂，37℃孵箱孵育1h后检测450nm处的吸光度值。用各时间点所测的吸光度值绘制生长曲线。

用同样的方法在HCCC-9810和RBE中加入PTEN和对照腺病毒，换液后培养36h，用0.5％胰酶消化细胞，离心后用PBS洗涤细胞后，加入PI对细胞进行染色，10分钟后离心，PBS液洗涤一次后用流式细胞仪检测。

图2B显示PTEN腺病毒在感染的细胞系中有表达，HCCC-9810在过表达PTEN后PARP剪切明显，提示细胞发生凋亡。C,D,E显示PTEN腺病毒能抑制PTEN缺失的细胞系HCCC-9810的生长，促进其凋亡，而对PTEN野生型的细胞系RBE无明显影响。

实施例3：基因芯片分析肝管癌细胞系在PTEN过表达后的信号通路变化

在10cm细胞培养皿中传入胆管癌细胞HCCC-9810和RBE，达到50％融合度后分别加入PTEN及对照GFP腺病毒，6h后换液，然后继续培养30h，弃去培养基，用生理盐水轻轻冲洗一次，加入1ml Trizol，提取细胞的RNA用于表达谱基因芯片分析。使用芯片为affymetrix2.0人基因表达谱芯片，数据分析由上海其名信息技术有限公司完成。用倍数法对两种细胞的对照组和实验组进行两两差异筛选(横向和纵向)，得到差异的mRNA，对得到的差异mRNA根据2014年商业版KEGG数据库进行显著性信号通路分析，找到和实验相关的通路。

分析结果显示，在HCCC-9810细胞中，过表达PTEN后基因表达改变显著。其中，在下调的信号通路中，RBE和HCCC-9810的变化差异在于蛋白酶体(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)，在图3A中有标注；在上调的信号通路中，RBE和HCCC-9810的变化差异在于溶酶体(lysosome)，在图3B中有标注。蛋白酶体(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)，溶酶体(lysosome)这3条信号通路对细胞内蛋白水平的稳态维持至关重要，打乱它们会导致导致细胞死亡。我们推测，在PTEN之所以能引起缺失型胆管癌细胞HCCC-9810死亡，是由于下调了蛋白酶体(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)信号通路，并同时上调了溶酶体/自噬(lysosome-autophagy)信号通路。

实施例4：不同种类蛋白酶体抑制剂和自噬激活剂对胆管癌细胞的生长影响

针对实施例3筛选出的信号通路――泛素-蛋白酶体信号通路下调，溶酶体/自噬信号通路上调，我们设想运用小分子抑制剂或临床药物诱发上述过程，模拟PTEN在胆管癌细胞中引起的生物学效应，检测它们单独使用或组合运用对肿瘤细胞的影响。

将胆管癌细胞系HCCC-9810传入96孔板中，每孔4000个细胞。待细胞贴壁后分为六组，每组设3个副孔，各组分别换成含有以下蛋白酶体的培养基：

1)DMSO；

2)MG132 20μM；

3)Bortezomib 10μM；

4)Carfilzomib 100nM；

5)Oprozomib 1μM

6)Ixazomib 50nM。

同样的细胞接种方式，待细胞贴壁后分为六组，每组设3个副孔，各组分别换成含有以下细胞自噬激活的培养基：

1)DMSO；

2)Rapamycin 20μM；

3)Torin 1 250nM；

4)Pifithrin-α10μM；

5)Metformin Hcl 1mM；

6)Brefldin A 1μM。

加药处理前设置为0时刻。分别在0、24、48h吸掉培养基，加入用DMEM稀释的10％的CCK8检测试剂，37℃孵箱孵育1h后检测450nm处的吸光度值。用各时间点所测的吸光度值绘制生长曲线。

由图4可知蛋白酶体抑制剂MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib，对PTEN缺失的胆管癌细胞增殖均有抑制作用，抑制效果最好的是Bortezomib。细胞自噬激活剂Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin A、Pifithrin-α对PTEN缺失的胆管癌细胞增殖均有抑制作用，抑制剂效果较好的有Rapamycin和BrefeldinA。

实施例5：联合运用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂对胆管癌细胞系的影响

将胆管癌细胞系HCCC-9810和RBE传入96孔板中，每孔4000个细胞。待细胞贴壁后分为4组，每组设3个副孔，各组分别换成含有以下蛋白酶体的培养基：

1)DMSO；

2)Bortezomib 10μM；

3)Rapamycin 20μM；

4)Bortezomib 10μM+Rapamycin 20μM；

加药处理前设置为0时刻。分别在0、24、48h吸掉培养基，加入用DMEM稀释的10％的CCK8检测试剂，37℃孵箱孵育1h后检测450nm处的吸光度值。用各时间点所测的吸光度值绘制生长曲线。

同样的用药方法在6孔板中处理细胞，处理后用0.5％胰酶消化细胞，离心后用PBS洗涤细胞后，加入PI对细胞进行染色，10分钟后离心，PBS液洗涤一次后用流式细胞仪检测。

由图5A可知联合运用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂对PTEN缺失的胆管癌细胞系HCCC-9810生长抑制效果良好，且优于单独使用；图5B显示在RBE中Rapamycin联合Bortezomib抑制效果远低于HCCC-9810，并且与单独使用Bortezomib没有差异；图5C为各处理组中细胞的死亡率统计图，HCCC-9810中联合运用Rapamycin和Bortezomib细胞死亡率最高，而在RBE中没有差异。

实施例6：联合运用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂在体内对胆管癌肿瘤生长的影响

将胆管癌患者的原代新鲜组织切下后，放入加有青霉属、链霉素、庆大霉素的培养基中，用眼科剪剪碎成1立方厘米左右的小块，用小镊子戳入18号套管接种针管里。

6到8周龄的裸鼠(12只，二军大动物中心)，用酒精棉擦拭其表皮以消毒，在其腰侧中部剪出一个小口。将含有组织碎块的套管针从切口小心沿着皮下***，最后将组织团块推入裸鼠臀部或腹股沟。移植瘤在2-3个月后生长起来，可以的传代培养，方法同上。传到第三代时可以用于药物筛选研究。

当移植瘤长到直径0.5-1cm左右，设置为第0天，开始进行药物处理。根据裸鼠肿瘤生长情况将裸鼠分为2组，每组3只裸鼠，同时使每组肿瘤平均体积相接近。2组裸鼠分别进行如下处理：

1)Saline腹腔注射,作为对照组；

2)Bortezomib 1mg/kg+Rapamycin 8mg/kg(均为腹腔注射，每周两次)

每6天测量一次肿瘤直径，计算各组肿瘤体积后，绘制肿瘤生长曲线图。

如图6AB所示，免疫组化结果显示胆管癌样品05269为PTEN阳性，05272为PTEN阴性。图6CD显示联合应用蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂对PTEN缺失的胆管癌移植瘤有显著疗效(C)，而对PTEN野生型的移植瘤没有疗效(D)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.蛋白酶体抑制剂在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用。

2.蛋白酶体抑制剂在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂是Bortezomib。

3.蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂是MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib，或其他能抑制蛋白酶体蛋白降解功能的物质。

5.根据权利要求3或4所述的蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用，其特征在于，所述的细胞自噬激活剂是Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin 1、Brefeldin A、Pifithrin-α，或其他上调自噬或溶酶体活性的物质。

6.根据权利要求3所述的蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在制备治疗PTEN缺失的胆管癌药物中的应用，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂是Bortezomib；所述的细胞自噬激活剂选自Rapamycin或Brefeldin A。