CN101248072A - 2-吲哚基咪唑并[4,5-d]菲咯啉衍生物及其在癌症治疗中的用途 - Google Patents

2-吲哚基咪唑并[4,5-d]菲咯啉衍生物及其在癌症治疗中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供式I的2－吲哚基咪唑并[4，5－d]菲咯啉化合物，其能够在细胞内螯合过渡金属并能够在癌细胞中发挥抗增殖作用，其起到细胞生长抑制和/或细胞毒作用。式I的化合物也能够诱导癌细胞中的细胞凋亡，因而能够对癌细胞发挥细胞毒作用。式I的化合物也能够选择性地抑制***癌细胞、结肠癌细胞、非小肺癌细胞和白血病细胞中的一种或多种的增殖。式I的化合物也能够增加锌调控的肿瘤抑制剂KLF4的表达，因而可用于抑制癌细胞的增殖，其中KLF4用作肿瘤抑制剂，包括但不限于膀胱癌、胃肠道癌症和各种白血病。

Description

2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉衍生物及其在癌症治疗中的用途
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域，尤其涉及2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉衍生物在治疗癌症中的用途。
背景技术
已经研发了金属螯合剂用于治疗金属超载造成的疾病。然而，近年来，正在研究能够螯合铁的化合物作为潜在的抗癌治疗剂，因为铁在能量代谢、呼吸和DNA合成所涉及的各种蛋白的活性位点中具有重要作用。一种这类蛋白即核糖核酸还原酶(RR)是对于使核糖核酸转化成用于DNA合成的脱氧核糖核酸至为关键的含铁蛋白，并因此成为抗癌治疗剂的靶向物。许多铁螯合剂由于具有结合铁的能力而是有效的RR抑制剂(Richardson，D.R.(2002)Crit Rev Oncol Hematol 42(3)：267-81.)。例如，铁螯合剂去铁胺(DFO)，已经被核准在临床上用于治疗铁超载疾病，包括β-地中海贫血症(Buss，J.L.，B.T.Greene，J.Turner，F.M.Torti和S.V.Torti(2004)Curr Top Med Chem4(15)：1623-35)，已经证明其是RR的抑制剂。此外，一些侵袭性肿瘤已经显示出对DFO的铁螯合作用敏感。然而，使用DFO成本昂贵，需要长期皮下给药，并且该化合物表现出较短的半衰期。除了DFO之外，具有抗增殖活性的其他铁螯合剂也在研发中，包括Triapine(现用于II期)、311、tachpyridine和O-Trensox(Richardson，同前)。然而，Triapine作为抗癌治疗剂的用途会受到限制，因为它在水中的溶解度低。
美国专利No.6,589,966记载了一种新金属螯合剂家族，其特征在于其是结合铁并对肿瘤细胞具有抗增殖活性的六齿化合物。此外，美国专利申请No.2002/0119955记载了基于3-AP(与Triapine结构上相关)的其他化合物，其在治疗包括癌症在内的瘤形成的治疗中表现出充分的治疗用途。
锌的螯合也很重要，但是相对于铁螯合剂的生物效应，其还未研究确定。例如，铁螯合剂tachpyridine在临床前研究中作为潜在的抗癌剂，除了铁之外还可螯合锌，这可在细胞毒性中起作用(Zhao，R.等人(2004)Biochem Pharmacol 67(9)：1677-88.)。在DNA-蛋白或蛋白-蛋白相互作用中所涉及的数百种锌相关的酶和蛋白的锌指结构基元中，锌具有催化和结构作用。因此，锌的缺乏以及超载会对哺乳动物的代谢造成各种变化。在体外锌的缺失显示出使细胞凋亡(McCabe，M.J.，Jr.，S.A.Jiang和S.Orrenius(1993)Lab Invest 69(1)：101-10)，使结肠癌HT-29细胞的细胞增殖显著下降(Kindermann，B.，F.Doring，M.Pfaffl和H.Daniel(2004)J Nutr134(1)：57-62)，并改变细胞周期进程(Chen，X.等人(2001)J Biol Chem276(32)：30423-8)。
可选择地，其他金属螯合剂通过形成细胞毒螯合配合物可以发挥抗瘤作用。这主要是使用氧化还原活性的金属铁和铜。例如，博莱霉素(bleomycin)是一种具有抗肿瘤活性的糖肽抗生素家族。它们在临床上与化疗一起使用对抗淋巴瘤、鳞状细胞癌和生殖细胞肿瘤。它们含有DNA结合域和结合Fe(II)或Cu(I)的金属结合域。氧和还原剂的存在使得通过形成自由基中间体而使DNA断裂(Chen，J.和J.Stubbe(2005)Nat Rev Cancer 5(2)：102-12)。铁螯合剂Triapine通过螯合铁而抑制RR，并通过经形成铁配合物产生自由基还可能损坏RR和其他重要分子(Chaston，T.B.等人(2003)Clin Cancer Res 9(1)：402-14)。博莱霉素结合物作为针对身体肿瘤的靶向化合物的用途记载在美国专利No.4,758,421中。
金属螯合剂1，10-菲咯啉(OP)的细胞毒性归因于其同时作为螯合剂和螯合物类别的能力。作为螯合剂，其已经表现出可以结合锌或铁，从而抑制需要锌或铁以发挥活性的酶。可选择地，据报道1，10-菲咯啉与二价金属离子的螯合配合物具有细胞毒性(Shulman，A.和G.A.Laycock(1977)Chem Biol Interact 16(1)：89-99.)，并且铜螯合物促进了DNA的降解(Downey，K.M.，B.G.Que和A.G.So(1980).Biochem Biophys Res Commun 93(1)：264-70)。铜-OP的配合物可以非共价地结合至DNA小沟槽，并在过氧化氢和还原剂存在下催化核酸的单链断裂(Sigman，D.S.等人(1979)J Biol Chem 254(24)：12269-72)。
铜-OP配合物经常用作化学核酸酶，并通过连接至序列特异性的DNA结合蛋白已经产生了高度特异性的DNA断裂剂(Pan，C.Q.，R.Landgraf和D.S.Sigman(1994)Mol Microbiol 12(3)：335-42.)。OP也广泛地用作基质金属蛋白酶的抑制剂(Springman，E.B.等人(1995)Biochemistry 34(48)：15713-20)，并且已经显示出通过螯合锌可抑制糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的合成(Mann，K.J.和D.Sevlever(2001)Biochemistry 40(5)：1205-13)。
在癌症的进展中已观察到肿瘤抑制基因异常，但是这些肿瘤抑制基因在癌症进展中的精确作用尚不清楚。Krüppel-样因子(KLF)的基因家族是一种在细胞生长、增殖、分化和胚胎发生中具有不同的调控作用并含有转录因子的进化保守的锌指家族(Ghaleb，A.M.等人(2005)Cell Res15(2)：92-6)。KLF可以用作转录激活因子或抑制因子或同时用作这两种因子，这取决于它们通过特异性氨基端结构域与共激活因子或共抑制因子的相互作用、它们结合的启动子和它们起作用的细胞环境(Kaczynski，J.，T.Cook和R.Urrutia(2003)Genome Biol 4(2)：206)。KLF家族的几种成员被认为是肿瘤抑制剂，并涉及到致癌作用。例如，在结肠癌中发现KLF4下调(Dang DT等人(2000)FEBS Lett，476：203-7)，在乳腺癌中出现KLF5和KLF10下调(Chen C等人(2002)Oncogene，21：6567-72；Subramaniam M等人(1998)J Cell Biochem，68：226-36)。KLF6也已被认为是在染色***置10p15的候选肿瘤抑制基因，在***癌中观察到频繁的突变。此外，KLF6也显示出反式激活WAF1，其通过p53-非依赖性途径编码细胞周期的周期素依赖性激酶抑制剂(Narla G等人(2001)Science，294：2563-6)。
在体外和体内，KLF4的异常与结肠癌之外的癌症相关，这表明KLF4具有肿瘤抑制作用。在结肠直肠癌中，与正常相配组织相比，KLF4mRNA的水平降低(Dang等人(2000)，同前)，并且KLF4在结肠直肠癌细胞系中的重新表达会降低肿瘤发生(Dang，D.T.等人(2003)Oncogene 22(22)：3424-30)。在膀胱癌(Ohnishi，S.等人(2003)Biochem Biophys Res Commun308(2)：251-6.)、胃癌(Wei，D.等人(2005)Cancer Res 65(7)：2746-54.)、食管癌(Wang，N.等人(2002).World J Gastroenterol 8(6)：966-70)和成人T-细胞白血病(Yasunaga，J.等人(2004).Cancer Res 64(17)：6002-9)也记载了KLF4的相似下调和生长抑制作用。据报道，与KLF4的肿瘤抑制作用相比，KLF4在乳腺癌(Foster，K.W.等人(2000).Cancer Res60(22)：6488-95.)和口腔的鳞状细胞癌(Foster，K.W.等人(1999).Cell Growth Differ 10(6)：423-34.)的进展中表达增加。此外，KLF4在早期浸润性乳腺导管癌中已被认为是侵袭性表型的标记物(Pandya，A.Y.等人(2004).Clin Cancer Res10(8)：2709-19.)。因此，尽管KLF4可能在胃肠癌和白血病中起肿瘤抑制作用，但是KLF4在其他类型癌症进展中的作用尚不清楚。
KLF4的表达受锌的负调控。使用人寡核苷酸阵列研究缺锌对在结肠癌HT-29细胞中基因表达的影响，表明KLF4基因表达在测试的～10,000种靶基因中是上调最显著的一种。因此，已经假设认为，KLF4可以在细胞锌状态和生长抑制之间直接关联(Kindermann，B.，F.Doring，M.Pfaffl和H.Daniel(2004).J Nutr 134(1)：57-62.)。在后续的研究中，发现在过表达金属转录因子-1(MTF-1)的细胞中KLF4的表达增加(Kindermann，B.，F.Doring，J.Budczies和H.Daniel(2005).Biochem Cell Biol 83(2)：221-9.)。MTF-1是一种具有六个锌指的对锌敏感的转录激活因子，其结合靶基因的金属应答元件(MRE)，并且KLF4的启动子也具有3个MRE。MTF-1在缺锌细胞中经常被上调，并且观察到MTF-1在缺锌HT-29细胞中表达增加(Kindermann等人2004，同前)。因此，KLF4在HT-29中的锌响应性至少部分地受MTF-1介导(Kindermann等人2005，同前)。KLF4的表达主要与诸如内脏、皮肤和胸腺等器官的上皮细胞的末期分化状态相关(Kaczynski等人2003，同前)。
如上所述，1，10-菲咯啉(OP)是公知的金属螯合剂。近期研究了1，10-菲咯啉的衍生物和它们螯合各种金属的能力。例如，Chao等人已经合成了1，3-双([1，10])菲咯啉-[5，6-d]咪唑-2-基)苯(mbpibH2)和它的(bpy)2Ru2+配合物，并研究了它们的电化学性质和光谱性质(Polyhedron，2000，1975-1983)。Liu等人使用2-(2-羟基苯基)咪唑并[4，5-f][1，10]菲咯啉(HPIP)制备了钌配合物，并研究了这些配合物对小牛胸腺DNA的结合行为(JBIC，2000，5，119-128)。相似地，Xu等人公开了2-(4-甲基苯基)咪唑[4，5-f]1，10-菲咯啉和其Ru(II)配合物的合成，并记载了制得的配合物对小牛胸腺DNA的结合(New J.Chem.，2003，27，1255-1263)。
国际专利申请No.PCT/IB04/052433(WO 2005/047266)记载了很宽类别的2，4，5-三取代的咪唑化合物，包括一些1，10-菲咯啉取代的化合物，以及它们在治疗癌症中的用途。
上述背景信息用于使申请人认为的已知信息成为与本发明可能相关的信息。上述信息不意图被承认为、也不应被解释为构成针对本发明的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉衍生物和其在治疗癌症中的用途。根据本发明的一个方面，提供具有结构式I的化合物或其盐在抑制癌细胞增殖中的用途：
Figure A20068002337700381
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基。
根据本发明另一方面，提供具有结构式I的化合物或其盐诱导癌细胞中的细胞凋亡的用途。
根据本发明另一方面，提供具有结构式I的化合物或其盐螯合细胞中的过渡金属离子的用途。
根据本发明另一方面，提供具有结构式I的化合物或其盐增加Krüppel-样因子4(KLF4)在癌细胞和/或肿瘤中的表达的用途。
根据本发明另一方面，提供具有结构式I的化合物或其盐在制备治疗癌症的药物中的用途。
根据本发明另一方面，提供具有结构式I的化合物或其盐，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或多环烷基。
根据本发明另一方面，具有结构式I的化合物或其盐，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
附图说明
在以下参考附图的详细说明中将更清楚本发明的这些特征和其他特征，在附图中：
图1示出化合物2和化合物3在多种癌细胞系中体外增殖的平均GI50值和中间GI50值。
图2示出化合物3对多种癌细胞系体外增殖的影响。
图3示出金属离子对化合物3和化合物13体外抑制HT-29细胞生长的能力的影响。
图4示出铜离子对化合物3体外抑制HT-29细胞生长的能力的影响。
图5示出金属离子对化合物3体外抑制HT-29细胞生长的能力的影响。(A)锌离子的影响；(B)铜离子的影响；(C)铁(II)离子的影响；(D)铁(III)离子的影响；(E)镁离子的影响；和(F)钙离子的影响。
图6示出铜离子或锌离子对化合物5(A)和化合物7(B)体外抑制HT-29细胞生长的能力的影响。
图7示出化合物3对金属硫蛋白基因mRNA在HT-29细胞中的表达的体外影响。
图8示出化合物3对KLF4mRNA在HT-29细胞中的表达的体外影响。
图9示出化合物3对KLF4蛋白在HT-29细胞中的表达的体外影响。
图10示出化合物3对p21mRNA在HT-29细胞中的表达的体外影响。
图11示出化合物3在HT-29细胞中(A)和CCRF-CEM细胞中(B)体外阻断细胞周期进程的能力。
图12示出化合物3体外诱导CCRF-CEM细胞中的细胞凋亡的能力。
图13示出化合物3降低结肠腺癌异种移植模型中的肿瘤大小(A)和肿瘤重量(B)的能力。
图14示出化合物3降低大细胞肺癌异种移植模型中肿瘤大小(A)和肿瘤重量(B)的能力。
图15示出化合物3、5和7降低结肠腺癌异种移植模型中的肿瘤大小(A)和肿瘤重量(B)的能力。
图16示出化合物3、5和7降低肺癌异种移植模型中肿瘤大小(A)和肿瘤重量(B)的能力。
图17示出化合物3对KLF4mRNA在结肠腺癌异种移植模型的肿瘤中的水平的体内影响。
图18示出化合物3对p21mRNA在结肠腺癌异种移植模型的肿瘤中的水平的体内影响。
图19示出化合物3对周期素D1 mRNA在结肠腺癌异种移植模型的肿瘤中的水平的体内影响。
图20示出化合物3对KLF4、p21和周期素D1 mRNA在结肠腺癌异种移植模型中水平的影响的比较。
图21示出化合物3在HT-29细胞中的体外亚细胞定位。(A)用化合物3处理细胞5分钟；(B)和(C)处理细胞4小时。对于(A)和(B)，用荧光图像覆盖微分干涉差图像。(B)和(C)是同一图像。
图22示出化合物3和13切割DNA的能力：(A)在没有金属离子存在下；(B)在铜离子、锌离子或铁(II)离子存在下；和(C)在不同量的铜离子存在下。
图23示出化合物3、5、7、9、12和13切割DNA的能力。
图24示出式I化合物的产生。
图25示出化合物3和7抑制非小细胞肺癌异种移植模型中(A)和结肠腺癌异种移植模型中(B)肿瘤生长的能力，化合物7抑制非小细胞肺癌异种移植模型中(C)肿瘤生长的能力，以及化合物7、63、64、69、72、73、74、18和78抑制非小细胞肺癌异种移植模型(D)中肿瘤细胞生长的能力。
图26示出补充金属离子对化合物3介导的细胞生长抑制的影响，Zn+2、Cu+2和Fe+2(A)，Fe+3、Ca+2和Mg+2(B)。
图27示出用化合物3(A)和化合物7(B)处理的HT-29细胞中的细胞周期分析。
图28示出在ZnCl2(A)、CuCl2(B)和FeCl2(C)存在下，化合物3和化合物7的体外金属螯合性能。
图29示出金属敏感性基因锌敏感性基因金属硫蛋白1A(A)、铜敏感性铜转运子1(B)和铁敏感性转铁蛋白受体-1(C)在用化合物3、化合物7或各种金属特异性螯合剂处理的HT-29细胞中的表达变化。
图30示出在周期素D1基因启动子中的结合MTF-1的DNA序列(A)以及在用化合物3(B)和化合物7(C)处理的HT-29结肠癌异种移植组织中MTF-1和周期素D1的表达水平。
图31示出在用化合物3处理HT-29细胞后，通过RT-PCR测量的MTF-1(A)和周期素D1(B)的表达，以及在siRNA使MTF-1基因抑制后MTF-1的表达(C)和周期素D1的表达(D)。
图32示出KLF4基因启动子上的转录因子结合位点(A)，以及在用化合物3处理的HT-29细胞中，Sp1(B)和KLF4(C)的DNA结合活性。
图33示出周期素D1基因启动子上的转录因子结合位点(A)，以及通过染色质免疫沉淀分析，化合物3处理HT-29细胞后，体内结合周期素D1启动子的KLF4和Sp1(B)。
图34示出在HT-29细胞中，化合物3和siRNA使KLF4基因抑制对RT-PCR测量的KLF4基因表达(A)和对细胞增殖(B)的影响。
图35示出化合物7、41、42、50、52、53、54、55和4在大细胞肺癌异种移植模型中抑制肿瘤细胞生长的能力。
图36示出使用锌敏感性染料Zinquin，化合物3体外螯合锌离子的能力。
图37示出在预加载有ZnCl2(A)或未预加载ZnCl2(B)(内源锌离子)的HT-29细胞中，化合物3体外螯合锌离子的能力。
图38示出化合物3对金属敏感性基因锌敏感性基因金属硫蛋白1A在HT-29细胞中的表达随时间变化(A)和补锌处理后(B)的体外影响。
图39示出化合物3对金属敏感性肿瘤抑制剂KLF4在HT-29细胞中的表达随时间变化(A)和补锌处理后(B)的体外影响。
图40示出化合物3对结合锌敏感性金属应答元件(MRE)的转录因子1(MTF-1)在HT-29细胞中的表达随时间变化的体外影响。
图41示出siRNA处理使MTF-1基因抑制对MTF-1、KLF5和KLF4在HT-29细胞中表达的体外影响(A)和化合物3处理对KLF5在HT-29细胞中表达随时间变化的体外影响(B)。
图42示出化合物3对细胞周期调控性蛋白p21在HT-29细胞中的表达随时间变化的体外影响，mRNA水平(A)和蛋白水平(B)。
图43示出化合物3对周期素D1在HT-29细胞中的表达随时间变化的体外影响，mRNA水平(A)和蛋白水平(B)。
图44示出化合物3对肿瘤抑制基因早期生长反应蛋白(EGR-1)在HT-29细胞中的表达随时间变化(A)和补锌处理后(B)的体外影响。
图45示出化合物3和化合物7对MT1A、MTF-1、KLF4、KLF5、p21、周期素D1和Erg-1在HT-29细胞中的基因表达水平的体外影响。
图46示出化合物3对KLF4和周期素D1在小鼠的HT-29结肠癌异体移植组织中的基因表达水平的体内影响。
图47示出化合物3从锌保存蛋白金属硫蛋白1(MT-1)体外螯合锌的能力。
图48示出用化合物3处理后，锌活化的MTF-1的DNA-结合活性的体外失活(A)和化合物3造成的MTF-1的DNA-结合活性在HT-29细胞中的体外失活(B)。
图49示出通过染色质免疫沉淀分析(ChIP)，化合物3降低HT-29细胞中MTF-1结合至周期素D1启动子区的DNA-结合活性的能力。
图50示出化合物3和补锌对周期素D1在HT-29细胞中的基因表达的体外影响(A)以及化合物3对周期素D1和其他周期素的蛋白水平的影响(B)。
图51示出化合物3和补锌对MTF-1在HT-29细胞中的表达的体外影响(A)，补锌对周期素D1的表达的体外影响(B)，以及补锌和siRNA使MTF-1基因抑制对周期素D1的表达的体外影响(C)。
图52示出化合物3和siRNA使MTF-1基因抑制对KLF4在HT-29细胞中的表达的体外影响。
图53示出KLF4、KLF2和KLF6在H-460癌细胞中的基因表达水平的体外比较(A)以及化合物3和化合物7对KLF4、KLF2和KLF6在H-460癌细胞中的表达的体外影响(B)。
图54示出化合物3降低结肠腺癌异种移植模型中的肿瘤大小的能力(A)以及对结肠腺癌异种移植模型的肿瘤中MTF-1、周期素D1和KLF4mRNA水平的体内影响(B)。
图55示出化合物3、化合物7和补锌对HT-29细胞中的mRNA水平的体外影响，MT1A(A)、MTF-1(B)、周期素D1(C)和KLF4(D)。
图56示出在ZnCl2(A)、CuCl2(B)和FeCl2(C)存在下，化合物3和化合物64的体外金属螯合性能。
图57示出化合物3、化合物64和补锌对HT-29细胞中的mRNA水平的体外影响，MT1A(A)、MTF-1(B)、周期素D1(C)和KLF4(D)。
具体实施方式
本发明涉及式I的2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉化合物。经本发明证实，式I的化合物能够在细胞内螯合过渡金属并能够在一种或多种癌细胞中发挥抗增殖作用，其起到细胞生长抑制和/或细胞毒作用。因此，本发明的一个实施方案提供式I化合物抑制癌细胞增殖的用途。本发明还提供式I化合物在治疗癌症中的方法和用途。
程序性细胞死亡(细胞凋亡)的诱导是治疗癌症的有用方法。经本发明证实，在本发明的一个实施方案中，式I的化合物能够诱导癌细胞中的细胞凋亡并因而发挥细胞毒作用。因此，本发明还提供式I化合物诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法和用途。在另一个实施方案中，提供式I化合物诱导细胞凋亡以用于治疗各种白血病的用途。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物能够选择性地抑制***癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞和白血病细胞中的一种或多种的增殖。因此，在该实施方案中，本发明提供式I化合物选择性地抑制***癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞和白血病细胞中的一种或多种的增殖的用途。式I化合物选择性地抑制***癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞和白血病细胞中的一种或多种的增殖的能力，进一步提供了式I化合物治疗选自***癌、结肠癌、非小细胞肺癌和白血病的癌症的方法和用途。
如上所述，式I的化合物能够螯合细胞环境中的过渡金属离子。因此，本发明还提供式I的化合物体内或体外螯合过渡金属离子的方法和用途。在本发明的一个实施方案中，式I的化合物能够通过螯合过渡金属改变癌细胞中受过渡金属调控的基因的表达。例如，在一个实施方案中，式I的化合物能够增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达。肿瘤抑制基因的功能经常与细胞增殖的调控相关，因此，通过增加起到调控细胞增殖功能的过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达，式I的化合物能够抑制癌细胞的增殖。在具体实施方案中，式I的化合物能够增加锌调控的肿瘤抑制剂KLF4的表达，因而可用于抑制癌细胞的增殖，其中KLF4用作肿瘤抑制剂，包括但不限于膀胱癌、胃肠道癌症和各种白血病。
本发明还提供式I化合物的金属螯合配合物，例如式I化合物的铜配合物，以及这些配合物在治疗癌症中的用途。
本发明还预期式I化合物在治疗需要螯合过渡金属的疾病或紊乱中的治疗性应用，以及在各种需要螯合过渡金属的非治疗情况中的应用。
定义
除非另有说明，本说明书中使用的所有技术和科技术语具有和本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
各术语的定义如下：
在本发明的一个实施方案中，可以使用癌细胞系组(包括在NCI/NIHDevelopmental Therapeutics Program体外筛选中使用的60个癌细胞系中的至少50个)(下表1示出)来测定本说明书中使用的关于式I化合物的抗癌活性的“选择性抑制”，其中所述组包括列出的***癌细胞系和其他列出的癌症的至少4个细胞系。当化合物抑制所选癌症的细胞系的增殖时，其中平均GI50比乳腺癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌和肾癌的各细胞系抑制的平均GI50低至少10％，则认为所述化合物对所选癌症(即***癌、结肠癌、非小细胞肺癌和/或白血病)表现出选择性抑制。
表1：NCI/NIH Developmental Therapeutics Program体外筛选中使用的癌细胞系
  癌症类型   细胞系
  乳腺   MCF7               MDA-MB-435NCI/ADR-RES        MDA-NMDA-MB-231/ATCC    BT-549HS 578T            T-47D
  CNS   SF-268             SNB-19SF-295             SNB-75SF-539             U251
  结肠   COLO 205           HT29HCC-2998           KM12HCT-116            SW-620HCT-15
  白血病   CCRF-CEM           MOLT-4HL-60(TB)          RPMI-8226K-562              SR
  黑素瘤   LOX IMVI           SK-MEL-28MALME-3M           SK-MEL-5M14                UACC-257SK-MEL-2           UACC-62
  非小细胞肺   A549/ATCC          NCI-H23EKVX               NCI-H322MHOP-62             NCI-H460HOP-92             NCI-H522NCI-H226
  卵巢   IGR-OV1            OVCAR-5OVCAR-3            OVCAR-8OVCAR-4            SK-OV-3
  ***   PC-3DU-145
  肾   786-0              RXF 393A498               SN12CACHN               TK-10CAKI-1             UO-31
本说明书中，关于过渡金属肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达的术语“下调”指基因在癌细胞中没有过表达，即与正常细胞相比，所述细胞表现出下降的基因表达水平或基本上相同的基因表达水平。举例来说，与正常结肠细胞相比，结肠癌细胞表现出KLF4基因的表达下降，而与正常***癌细胞相比，***癌细胞表现出相同水平的KLF4表达，但表达水平比乳腺癌细胞中低，乳腺癌细胞过表达KLF4。
术语“卤素”指氟、溴、氯和碘原子。
术语“羟基”指基团-OH。
术语“巯基”指基团-SH和-S(O)0-2。
术语“低级烷基”指1～8个碳原子的直链或支链或环状烷基。
术语“取代的低级烷基”指包括例如下述一个或多个基团的低级烷基：羟基、巯基、烷基巯基、卤素、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、环杂烷基、取代的环杂烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、杂芳基、取代的杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷基链烯基、烷基炔基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、氰基。这些基团可与低级烷基部分的任何碳原子连接。
术语“低级链烯基”指2～8个碳原子的具有至少一个碳碳双键的直链或支链烃。
术语“取代的低级链烯基”指包括例如下述一个或多个基团的低级链烯基：羟基、巯基、烷基巯基、卤素、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、环杂烷基、取代的环杂烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、杂芳基、取代的杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷基、链烯基、炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、氰基。这些基团可与任何碳原子连接生成稳定的化合物。
术语“低级炔基”指2～8个碳原子的具有至少一个碳碳三键的直链或支链烃。
术语“取代的低级炔基”指包括例如下述一个或多个基团的低级炔基：羟基、巯基、烷基巯基、卤素、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、环杂烷基、取代的环杂烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、杂芳基、取代的杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷基、链烯基、炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、氰基。这些基团可与任何碳原子连接生成稳定的化合物。
术语“烷氧基”指基团-OR，其中R是低级烷基、取代的低级烷基、如下述定义的酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、杂芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。
术语“烷硫基”指基团-SR、-S(O)n＝1-2-R，其中R是低级烷基、取代的低级烷基、如下述定义的芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
术语“酰基”指基团-C(O)R，其中R是氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基。
术语“芳氧基”指基团-OAr，其中Ar是如下述定义的芳基、取代的芳基、杂芳基、或取代的杂芳基。
术语“氨基”指基团NRR′，其中R和R′可以独立地是氢、低级烷基、取代的低级烷基、如下述定义的芳基、取代的芳基、杂芳基、环烷基、取代的环烷基或取代的杂芳基或酰基。
术语“酰氨基”指基团-C(O)NRR′，其中R和R′可独立地是氢、低级烷基、取代的低级烷基、如下述定义的环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基。
术语“羧基”指基团-C(O)OR，其中R可独立地是氢、低级烷基、取代的低级烷基、如下述定义的芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基等。
术语“芳基”或“Ar”指具有至少一个芳香环(例如，苯基或二苯基)或多个稠环的芳香碳环基团，在多个稠环中至少一个环是芳香环(例如，1，2，3，4-四氢萘基、萘基、蒽基、菲基、9-芴基等)。
术语“取代的芳基”指任选被一个或多个官能团取代的芳基，所述官能团例如有卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、三氟甲基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、杂烷基、取代的杂烷基、环烷基、取代的环烷基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、磺酰氨基、氰基或-N＝CRR′，其中R和R′独立地选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基或取代的杂芳基。
术语“杂环基”指具有单环(例如，吗啉基、吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，萘基吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、吲嗪基、茚满基或苯并[b]噻吩基)并且在环内含有至少一个杂原子如N、O或S的饱和、不饱和或芳香的碳环基团。
术语“取代的杂环基”指任选地被下述基团取代的杂环基：卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、三氟甲基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、杂烷基、取代的杂烷基、环烷基、取代的环烷基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、磺酰氨基或氰基等。
术语“杂芳基”指至少一个杂环是芳香环的杂环基。
术语“取代的杂芳基”指任选被一个或多个官能团取代的单取代或多取代的杂环基，所述官能团例如有卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、三氟甲基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、杂烷基、取代的杂烷基、环烷基、取代的环烷基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、磺酰氨基或氰基等。
术语“环烷基”指含有3～15个碳原子的环烷基或多环烷基。对于多环烷基而言，可以是多个稠环，其中末端的环之一可以是芳香环(例如四氢化萘等)。
术语“取代的环烷基”指包括一个或多个取代基的环烷基，所述取代基例如有卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、三氟甲基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷基链烯基、烷基炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、烷基环烷基、烷基环杂烷基、硝基、磺酰氨基或氰基等。
术语“治疗(therapy)”和“治疗(treatment)”可以交换使用，指意图减轻与疾病、紊乱或病症相关的症状、防止其发展或改变其病理而进行的干预。因此，术语治疗以最广含义使用，包括预防、缓解、控制、减轻或治愈各种阶段的疾病、紊乱或病症。这些术语还包括疾病、紊乱或病症的进展的预防或减轻。这些术语还包括使活着的受试者的生理和/或生物化学发生变化的干预。需要治疗的受试者包括已患有疾病、紊乱或病症的受试者、倾向于或有发展疾病、紊乱或病症危险的受试者以及将要预防疾病、紊乱或病症的受试者。因此，本发明化合物的治疗应用指本说明书定义的治疗。
本说明书中，术语“受试者”或“患者”指需要治疗的动物，包括人和其他哺乳动物。
将本发明的化合物与一种或多种其他治疗剂“组合”给予意图包括同时(共同)给予和连续给予。连续给予意图包括将治疗剂和本发明的化合物以各种顺序给予受试者。
本说明书中，术语“辅助治疗”指用于增强主要治疗效果的治疗。在癌症中，辅助治疗经常指手术(主要治疗)后的化疗、激素治疗或放射治疗，用于增大杀死所有癌细胞的可能性。
本说明书中，术语“新辅助治疗”指主要治疗之前进行的治疗。新辅助治疗的例子包括化疗、放射治疗和激素治疗。
本说明书中，术语“约”指距标称值+/-10％的变化。应该理解，在任何给定值中总是存在这种变化，不管是否具体指出。
I.2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉化合物
本发明提供通式I的化合物或其盐：
Figure A20068002337700501
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基。
在本发明另一个实施方案中，在式I的化合物中，R1、R3、R4、R5和R7是H，R2和R6按上述定义的。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或多环烷基。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C5-C6环烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基或金刚烷基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
在本发明另一个实施方案中，式I的化合物是如下的那些，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；或C5-C6杂环烷基；以及
R7是H。
本发明的化合物包括但不限于以下的示例性化合物：
Figure A20068002337700531
Figure A20068002337700541
Figure A20068002337700551
Figure A20068002337700561
本发明包括式I定义的化合物的各种盐，包括药学可接受的盐。本发明的化合物可具有充分酸性的官能团、充分碱性的官能团或同时具有酸性和碱性的官能团，因此与许多有机和无机碱、有机和无机酸反应而形成药学可接受的盐。
本说明书中使用的术语“药学可接受的盐”指式I化合物的盐，其对活的生物体基本上无毒。典型的药学可接受的盐包括通过使本发明的化合物与药学可接受的无机酸或有机酸或者有机碱或无机碱反应制备的那些盐。这些盐被称为酸加成盐和碱加成盐。
用于形成酸加成盐的酸是无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。这样的药学可接受的盐的例子是硫酸盐、焦硫酸盐、重硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、盐酸盐、二盐酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。优选的药学可接受的酸加成盐是与无机酸如盐酸和氢溴酸形成的那些盐以及与有机酸如马来酸和甲磺酸形成的那些盐。
胺基盐还可包括季铵盐，其中氨基的氮带有适宜的有机基团，如烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基或芳烷基部分。
碱加成盐包括衍生于无机碱的那些盐，如铵或碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。因此，在制备本发明的盐中有用的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、碳酸钙等。
本领域技术人员可以理解，只要本发明的盐作为总体是药学可接受的并且只要抗衡离子对盐总体不产生不利的性质，则形成本发明盐的一部分的特定抗衡离子通常不具有关键性质。本发明还包括式I化合物的药学可接受的溶剂化物。式I的许多化合物能够与溶剂如水、甲醇、乙醇和乙腈形成药学可接受的溶剂化物，如相应的水合物、甲醇化物、乙醇化物和乙腈化物。
本发明的化合物可以具有多个不对称(手性)中心。由于存在这些手性中心，本发明的化合物以外消旋体、对映体的混合物和以单一的对映体、非对映体和非对映体的混合物存在。所有的不对称形式、单一的异构体和它们的混合物都包括在本发明的范围内。
本领域技术人员容易理解，如果式I的化合物的立体化学对它的活性非常重要，那么在合成过程中应尽早确定化合物的相对立体化学以避免后续的立体异构体分离问题。此外，应使用立体专一性的方法处理分子以保持所需的手性。
II.式I化合物的制备
本领域中已知的是，可以通过多种标准工艺来制备本发明的化合物。因此，式I的化合物可以通过几种一般的合成方法来制备，例如，Grimmett所述的方法(Grimmett，M.R.，Comprehensive Heterocyclic Chemistry：TheStructure，Reaction，Synthesis and Uses of Heterocyclic Compounds，A.R.Katrizky和C.W.Rees，eds.，Vol.5，Pergamon Press.Oxford，1984，pp.457-498；Grimmett，M.R.，Imidazole and Benzimidazole Synthesis，Academic Press，San Diego CA，1997)。
在本发明的一个实施方案中，通过溶液或固相合成制备式I的化合物，包括在乙酸铵存在下，在乙酸中使式II的二酮与醛(III)反应(参见例如，Krieg等人，Naturforsch.1967，22b，132；Sarshar等人，Tetrahedron Lett.1996，37，835-838；Bian等人，Synthetic communications 2003，33，3477-3482；Hong Xu等人，J.Chem.Soc.，Dalton Trans.，2003，11，2260-2268；Hong Xu等人，Inorg.Chem.Commun.，2003，6，766-768；Bian等人，Polyhedron 2002，21，313-319；Chao等人，J.Chem.Soc.，DaltonTrans.，2001，12，1920-1926。
Figure A20068002337700591
式(II)和(III)的化合物可以市售得到或可以使用相关领域技术人员已知的标准方法制备。可以通过几种一般的合成方法制备式(II)的化合物，例如，下述文献所记载的：Fischer等人(J.Am.Chem.Soc.1961，83，4208-4210)；Guijarro等人(J.Am.Chem.Soc.1999，121，4155-4157)；Chi等人(Synth.Comm.1994，24(15)，2119-2122)和Armesto等人(Synthesis，1988，799-801)；Yamada等人(Bull.Soc Chem.Jpn.，1990，63(9)，2710-2712)；Hiort等人(J.Am.Chem.Soc.1993，115，3448-3454；和Tetrahedron Letters 2004，45(33)，6361-6363)。可以通过Vilsmeier等人(Chem.Ber.1958，91，850-861和Synthesis 1985，8，641-645)记载的通用合成方法制备式(III)的化合物。例如，可以按下述通过在二甲基甲酰胺(DMF)中使式(IV)的化合物与POCl3反应制备式(III)的化合物：
Figure A20068002337700601
通常基于产物(1)形成水溶性盐的性能对其进行分离和纯化。在用水稀释反应介质后，使用非极性溶剂从得到的溶液萃取出杂质，使水层碱化，分离出咪唑并[4，5-d]菲咯啉(1)，过滤，并用适合的溶剂重结晶。
测试式I的化合物
如上所述，预期用于本发明方法中的式I的化合物能够螯合过渡金属并抑制癌细胞的增殖。此外，在本发明的一个实施方案中，式I的化合物能够增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因如KLF4在癌细胞中的表达。在本发明的另一个实施方案中，式I的化合物诱导癌细胞中的细胞凋亡并对癌细胞起到细胞毒作用。
可以使用本领域中已知的标准技术测试候选的式I化合物体外和体内螯合过渡金属和抑制肿瘤性细胞增殖的能力。相似地，可以使用标准技术测试化合物增加肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达和/或诱导癌细胞中的细胞凋亡的能力。在下面以及实施例中提供测试候选的式I化合物的示例性方法。本领域技术人员应该理解，测试化合物的其他方法是本领域中已知的，并也适于测试候选化合物。
在体外和/或体内与各种已知的化疗法组合对表现出抑制活性的式I化合物进一步进行测试，以评价它们在组合治疗中的潜在用途。
式I化合物的金属螯合配合物也包括在本发明中。可以使用下述方法测试这种螯合配合物。
A.金属螯合能力
根据本发明，式I的化合物能够螯合细胞环境中的过渡金属离子。在一个实施方案中，式I的化合物能够螯合铁、锌、铜、钌和钴离子。在另一个实施方案中，式I的化合物能够螯合第一排过渡金属离子。在另一个实施方案中，式I的化合物能够螯合铁、锌和铜离子。在本发明另一个实施方案中，式I的化合物能够螯合锌离子。在另一个实施方案中，式I的化合物能够螯合铜离子。
可以使用本领域中已知的各种技术测定式I化合物的金属螯合性能，包括但不限于X-射线晶体学、NMR谱、荧光光谱、原子吸收光谱(AAS)、电子顺磁共振谱、高效液相色谱(HPLC)、联用的液相色谱/质谱和电位滴定。
例如，过乙酸(PAA)在金属离子如锰、铁或铜存在下快速分解。可以分析螯合化合物在金属离子存在下稳定PAA溶液的效率，以确定化合物的金属螯合能力。简言之，可以制备含有金属离子的水溶液，并将适量的候选的式I化合物加到溶液中，然后进行pH和温度调节。然后通过碘量滴定法测定含有式I化合物的PAA溶液的稳定性。测定金属螯合能力的其他测试可以包括例如使用金属离子选择电极测量含有金属离子和螯合化合物的溶液中的未螯合的金属离子。简言之，用含有螯合化合物的溶液滴定含有金属离子的溶液，然后用金属选择电极测量，以测定未螯合的金属离子的量，从而提供式I化合物的金属螯合能力的指示。
还可以通过分光光度法，利用体外4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)金属结合分析，分析式I化合物的金属螯合性能。PAR是市售的染料，其作为三齿或二齿配体，在特定pH值下与Mg、Al、Ca、Sr、Ba、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Y、Zr、Nb、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Hf、Ta、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Th、U、Np和镧系元素的阳离子形成可溶或不溶的有色配合物，最大吸光度在500nm附近。为确定式I化合物的金属螯合性能，可以通过分光光度法在约500nm下测量在金属离子存在下形成的PAR-金属离子配合物，并可以在含有式I化合物的样品和对照样品中形成的PAR-金属离子配合物之间作比较，对照样品例如是含有已知的螯合剂的样品和/或不含有式I的化合物但含有对照载体的样品。
可以利用本领域中公知的方法分析式I化合物螯合细胞环境中的过渡金属的能力，例如，通过使用特定荧光指示剂如zinquin或Phen GreenSK，在有或没有候选化合物存在下，测量细胞内锌、铁或铜的可螯合池(参见例如，Zalewski等人，Biochem J.1993，296(Pt2)，403-8；和Petrat等人，Biol Chem.2002，383(3-4)，489-502)。此外，可以在各种生物样品如细胞提取物、分离出的细胞、组织或体液中，利用诸如高效液相色谱(HPLC)、分光光度法检测、电子自旋共振(ESR)或原子吸收光谱等方法，通过测量细胞内金属离子的可螯合池，分析式I化合物在细胞环境中的金属螯合能力，这记载在例如以下文献中：Gower等人，Anal.Biochem.1989，180，126-130；
Figure A20068002337700621
和Roberg，J.Biol.Chem.1997，272，23707-23711；Flatmark和Tangeras，Proteins of Iron Metabolism，Brown，Aisen，Fielding和Crichton编著(New York，USA：Grune & Stratton)，1976，页349-358；Kozlov等人，Free Radic.Biol.Med.1992，13，9-16；Cammack和Cooper，Methods Enzymol.1993，227，353-384；Yegorov等人，Free Radic.Biol.Med.1993，15，565-574；Cairo等人，J.Biol.Chem.1995，270，700-703；和Nielsen等人，Int.J.Biochem.1993，25，223-232。
通过在候选化合物和不同浓度的金属离子存在下，分析细胞生长、与金属调控相关的基因表达的变化、细胞毒性、酶分析或本领域中已知的其他可测量的终点，也可以间接地分析式I化合物在细胞环境中的金属螯合能力。例如，可以在培养的细胞中或整个动物中，通过控制细胞金属池，并测量在有和没有候选化合物存在下细胞生长的变化，分析式I化合物的金属螯合能力。
可选择地，或除了测量细胞生长变化之外，可以使用本领域中已知的标准方案测定已知的金属调控的基因或金属调控性蛋白如金属硫蛋白或金属转录因子-1的基因表达变化。在本领域中已知的是，金属硫蛋白(MT)的表达受细胞内锌浓度的严格调控。锌与金属转录因子(MTF-1)的结合允许MTF-1结合MT的启动子中的金属应答元件(MRE)，从而启动MT-基因转录。因此，式I化合物调节MT或MTF-1表达的能力可以被测定作为化合物的金属螯合能力的指示。本领域中已知的其他金属调控的基因包括例如编码铁调控性蛋白(IRP)、铁蛋白或转铁蛋白受体的基因，其受铁水平调控(参见例如，Eisenstein和Blemings，J.Nutr.1998，128(12)：2295-2295；和Martini等人，J.Nutr.2002，132(4)：693-696)；和编码锌转运子蛋白-1的基因，其受锌水平调控(参见例如，Kindermann等人，J.Nutr.2004，134(1)：57-62；和Langmade等人，J.Biol.Chem.2000，275(44)：34803-24809)。
B.体外试验
i)癌细胞增殖的抑制
可以使用标准技术初步分析候选的式I化合物体外抑制癌细胞增殖的能力。
通常，候选的式I化合物抑制癌细胞增殖的能力测试如下。使特定的测试癌细胞系的细胞生长至适合的密度(例如约1×104)，加入各种浓度的候选化合物。在适合的培养时间后(通常约48～74小时)，分析细胞存活，例如，通过分析四唑盐(或经修饰的四唑盐)断裂，或通过使用刃天青还原试验(参见Fields & Lancaster(1993)Am.Biotechnol.Lab.11：48-50；O′Brien等人，(2000)Eur J.BioChem.267：5421-5426和美国专利No.5,501,959)、磺酰罗丹明分析(Rubinstein等人，(1990)J.Natl.Cancer Inst.82：113-118)、中性红染料试验(Kitano等人，(1991)Euro.J.Clin.Investg.21：53-58；West等人，(1992)J.Investigative Derm.99：95-100)或XTT分析。通过将在处理的培养基中的细胞存活率与一种或多种对照培养物中的细胞存活率作比较，测定细胞增殖的抑制，对照培养物例如是未用候选化合物预处理的培养物、用对照载体预处理的培养物和/或用对照化合物(通常是已知的治疗剂)预处理的培养物。
本领域中已知的测量代谢活性的其他分析(如基于四唑盐的分析)也可用于分析候选化合物对细胞增殖的影响，只要增殖细胞在代谢方面比休止细胞更具活性。
还可以体外测试候选化合物抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长的能力。锚定非依赖性生长是本领域中已知的，其是肿瘤发生的良好指示。通常，通过将适宜的癌细胞系的细胞在软琼脂上进行平板培养，并测定适合培养时间后形成的集落数来分析锚定非依赖性生长。可以将用候选化合物处理的细胞的生长与用适合对照(如上所述)处理的细胞的生长作比较。
适于测试式I化合物的各种癌细胞系可以商购得到，例如AmericanType Culture Collection(ATCC；Manassas，VA)目前供应700种以上不同的人癌细胞系，DCTD Tumor Depository(NCI at Frederick，Frederick，MD)供应各种哺乳动物细胞系，包括NCI/NIH筛选中使用的人癌细胞系。
可用于测试式I化合物的适合的人癌细胞系的例子包括但不限于膀胱癌细胞系HT-1376、HT-1197和Hs 195.T；结肠和结肠直肠的腺癌和癌细胞系，如CaCo、COLO320、HCT-116、LoVo、NCI-H498、NCI-H548和SNU-C2B；十二指肠癌细胞系HuTu 80；胃的腺癌和癌细胞系Hs740.T、AGS、Hs 746T、NCI-N87、NCI-SNU-1和RF-48；大细胞肺癌细胞系NCI-H661和NCI-H1581；***的腺癌和癌细胞系MDA PCa 2b、LNCaP-FGC和22Rv1；Burkitts淋巴瘤(Non-Hodgkin(非霍奇金))细胞系raji、Namalwa和HS Sultan；组织细胞淋巴瘤细胞系U-937；急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系Jurkat、T-细胞淋巴瘤细胞系Karpas 299；浆细胞白血病细胞系L-363；和直肠的腺癌和癌细胞系NCI-H630和SW837。耐药性癌细胞系也可用于测定本发明的化合物抑制耐药性或多药耐药性肿瘤性细胞的生长和/或增殖的能力。
还可以测试候选式I化合物的不同的肿瘤性选择性，即与正常增殖细胞相比，所述化合物对肿瘤性(或癌症)细胞表现出一定水平的选择作用的能力。Vassilev等人(Anti-Cancer Drug Design(2001)16：7)已经描述了分析化合物对正常细胞和癌细胞之间的不同灵敏度的示例性方法。该方法包括比较各IC90值，即，使呈指数生长的细胞的生长抑制90％所需的测试化合物的摩尔浓度。因此，可以在各种癌细胞系(如上述那些)和正常细胞(如HUVEC和/或WI38细胞)中评价候选化合物的IC90值并作比较。可以使用本领域中已知的各种标准技术测量IC90值。通过所有正常细胞系的平均IC90和所有癌细胞系的平均IC90之比计算癌细胞的选择性。IC90比(正常/癌症)＞4的化合物被认为对癌细胞有选择性(L.T.Vassilev等人，Anti-Cancer Drug Design，2001，16：7-17)。
在本发明的一个实施方案中，式I的化合物选择性地抑制白血病细胞、***癌细胞、非小细胞肺癌细胞和结肠癌细胞中的一种或多种的增殖。使用NCI/NIH Therapeutic Drug Program体外筛选中使用的人癌细胞系分析候选化合物的选择性。该筛选中所用的癌细胞系列于上面的表1中。
根据本发明的该实施方案，当化合物抑制所选癌症的细胞系的增殖时，其中平均GI50比乳腺癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌和肾癌的各细胞系抑制的平均GI50低至少10％，则所述化合物对所选癌症(即***癌、结肠癌、非小细胞肺癌和/或白血病)表现出选择性抑制。在一个实施方案中，***癌细胞、结肠癌细胞、非小肺癌细胞和/或白血病细胞的平均GI50比乳腺癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌和肾癌的各细胞系抑制的平均GI50低至少15％。在另一个实施方案中，***癌细胞、结肠癌细胞、非小肺癌细胞和/或白血病细胞的平均GI50比乳腺癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌和肾癌的各细胞系抑制的平均GI50低至少20％。
计算GI50的方法是本领域中已知的(参见例如，Boyd，M.R.等人，Cytotoxic Anticancer Drugs：Models and Concepts for Drug Discovery andDevelopment；Vleriote，F.A.；Corbett，T.H.；Baker，L.H.编著；KluwerAcademic：Hingham，MA，1992和Monks，A.等人，(1991)JNCI，J.Natl.Cancer Inst.83，757-766；pp 11-34)。如本领域中所述，GI50是对IC50值的重命名(使生长抑制50％的浓度)，其强调在计算GI50时对时刻0时的细胞计数的校正。因此，GI50是候选化合物的浓度，其中：
100×(T-T0)/(C-T0)＝50。
其中，与测试药物接触48小时后测试孔的光密度是T，时刻0时的光密度是T0，对照光密度是C。
例如，目前NCI使用的以下方法可以用于分析候选的式I化合物在所选癌细胞系中的GI50。简言之，稀释细胞悬液(5000-40,000个细胞/孔)，并将100μL稀释的细胞悬液加到96-孔微滴定板中。进行接种，为进行稳定在37℃下预培养24小时。在时刻0时，将候选化合物的预期测试浓度的两倍稀释液以100μL的等分试样加到微滴定板的孔中。通常在5次10倍稀释下评价测试化合物。在例行试验中，最高的孔浓度经常为10E-4M，但可以根据待测试的化合物进行调节。在5％CO2气氛中和100％湿度下，用测试化合物培养细胞48小时。然后通过磺酰罗丹明B分析对细胞进行分析(参见例如，Skehan，P.等人(1990)JNCI，J.Natl.Cancer Inst.82，1107-1112；和Chen，S.F.等人(1990)Proc.Am.Assoc.Cancer Res.31，A2644)，其中使用可以用于读取光密度的孔板读取仪。
ii)增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因表达的能力
根据本发明的一个实施方案，式I的化合物增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达。在另一个实施方案中，式I的化合物增加肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达，该肿瘤抑制基因的表达在癌细胞中的表达被下调。过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中的增加或上调的表达可以被测定为在处理的细胞相对于未处理的细胞中基因表达增加的百分比。在一个实施方案中，式I的化合物使过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达增加约10％。在另一个实施方案中，式I的化合物使过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达增加约20％。在其他实施方案中，式I的化合物使过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达增加约25％、50％、75％或100％。
过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中表达的增加或上调还可以被测定为基因在癌细胞中的表达“倍数”增加或上调，其中在未处理的癌细胞中的基因表达表示为“1”，并且相对于在未处理的癌细胞中的各基因表达，表示在处理的癌细胞中基因表达各自的“倍数”增加。在本发明的一个实施方案中，式I的化合物能够将过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达增加或上调约1.5倍。在另一个实施方案中，式I的化合物能够将过渡金属调控的肿瘤抑制基因的表达增加约2.0倍。
在本发明另一个实施方案中，过渡金属调控的肿瘤抑制基因是KLF4。通过测量KLF4 mRNA或蛋白的水平的变化，可以分析候选化合物调节肿瘤抑制基因如KLF-4表达的能力。进行这些分析的方法是本领域中已知的。
例如，可以将候选化合物引入所选癌细胞系中，并可以通过标准技术如Northern印迹分析、RT-PCR等测量从相关肿瘤抑制基因转录的mRNA量。可选择地，可以通过标准技术如Western印迹分析测量细胞产生的肿瘤抑制蛋白的量。然后可以将在用候选化合物处理的细胞中产生的mRNA或蛋白的量与在对照细胞中产生的量作比较，从而提供化合物怎样成功地抑制肿瘤抑制基因表达的指示。适合的对照细胞包括例如未处理的细胞和/或用对照化合物处理的细胞。
可选择地，可以使用筛选多个基因表达(“表达谱”)的标准方法，筛选在所选癌细胞系中具有增加基因表达能力的候选化合物。这种方法是本领域中公知的，包括例如微阵列分析，如高密度微阵列分析，其中含有10倍以上(例如，19,000个)的人基因以识别其表达受所述化合物影响的适合功能基因簇。
通常，表达谱使用预制的短DNA序列或寡核苷酸的微阵列。构造微阵列的方法是本领域中公知的[参见例如，Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc，NY.(1989和更新材料)]。作为选择的是，微阵列可以是定制的，例如包括对应于已知肿瘤抑制基因的序列。对于许多有机体而言，预制的微阵列也是市售的，包括例如(Affimetrix，Santa Clara，CA)、AtlasTM(BDBiosciences-CLONTECH，Palo Alto，CA)、GEM微阵列、GeneJetTM阵列和
Figure A20068002337700672
(Incyte Genomics，Palo Alto，CA)、MICROMAXTM人cDNA微阵列***(PerkinElmer Life  Sciences，Boston，Mass.)和ResGenTM
Figure A20068002337700673
(Invitrogen，Huntsville，Ala.)。从用候选化合物处理的细胞和从对照细胞分离RNA用于表达分析。在需要时，可以通过常规技术使RNA扩增，以确保有足够的量用于分析。然后在适合的条件下使RNA与微阵列杂交，并使用市售扫描仪和软件对微阵列进行常规分析，以识别在处理的细胞中相对于对照细胞表达变化的基因。本领域技术人员使用标准技术可以容易地确定适合的杂交条件。在识别其他这样的基因后，可以评价mRNA的量和各蛋白水平，以确定处于研究中的化合物对基因的影响程度。
iii)细胞凋亡的诱导
根据本发明的另一个实施方案，式I的化合物能够诱导癌细胞中的细胞凋亡。分析候选化合物诱导细胞凋亡的能力的方法是本领域中已知的(参见例如，Current Protocols in Cell Biology，2000和更新材料，K.Morgan编著，J.Wiley & Sons，New York，NY)，包括例如DNA片段分析、流式细胞术组合annexin V-FITC和碘化丙啶染色、用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT-分析)造成的DNA链断裂的荧光素标记和流式细胞术分析、流式细胞术检测或利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析的免疫细胞化学原位检测、蛋白水解断裂或聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解的免疫组织化学或流式细胞检测、和/或半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶(caspases(胱冬肽酶))的活化的检测。
例如，通过用候选化合物培养细胞一段时间然后使用annexinV-FITC-碘化丙啶法的细胞术分析，可以分析式I化合物对细胞凋亡的影响。细胞凋亡导致磷脂酰丝氨酸从质膜的内叶移位到细胞外侧。AnnexinV是一种以高度亲合性结合磷脂酰丝氨酸的蛋白，可以用于检测这种细胞凋亡诱导的膜变化。DNA结合染料碘化丙啶(PI)易于进入非存活的细胞并使其染色，但不能穿过存活的细胞的膜。因此，仅有用Annexin V染色的细胞被认为是早期细胞凋亡，而同时用Annexin V和PI染色的细胞被认为是晚期细胞凋亡。仅用PI染色的细胞被认为是非存活的细胞，而未染色表明是存活的细胞。
在需要时，可以进行分析以研究化合物作用的潜在机制，从而提供用于确定化合物影响肿瘤生长的哪一方面的信息。这种类型的信息可能有助于确定癌症类型，从而有利于使用所述化合物进行治疗。这种分析的例子包括但不限于细胞周期分析(例如，使用流式细胞术)、抗血管生成分析(例如，各种Matrigel分析，包括条索状结构的形成(cord formation)和Matrigel胶塞分析)和免疫组织化学分析。
C.体内试验
使用本领域中已知的标准技术在适宜的动物模型中可以测定候选化合物体内抑制肿瘤生长、增殖和/或转移的能力(参见例如，Enna等人，Current Protocols in Pharmacology，J.Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)。下面和实施例中提供示例性方案。
例如，使用中空纤维分析也可以测试候选化合物的体内活性(Hollingshead，M.等人，(1995)Life Sciences 57：131-141；和Decker等人，Eur.J.of Cancer 40：821-826(2004))。在该分析中，将在中空纤维(聚偏二氟乙烯，PVDF)中生长的细胞移植到小鼠的各种体腔中。12个肿瘤细胞系的标准组可以用于已显示出体外活性的候选化合物的中空纤维筛选。这些细胞系可以包括NCI-H23、NCI-H522、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SW-620、COLO 205、LOX-IMVI、UACC-62、OVCAR-3、OVCAR-5、U251和SF-295。此外，可选细胞系如在上面体外部分中记载的那些也可用于化合物的专用试验。根据标准方案培养细胞系，并通过将细胞冲入PVDF纤维中和以2cm间隔密封它们来制备纤维。将从这些密封物产生的样品置于组织培养基中，并且在移植之前在37℃下、在5％CO2中培养24～48小时。对于每一实验共制备3个不同的肿瘤细胞系，使得每只小鼠接受3个腹腔移植物(每个肿瘤细胞系1个移植物)和3个皮下移植物(每个肿瘤细胞系1个移植物)。在移植那天，例如通过稳定的终点MTT分析，量化每一肿瘤细胞系制备物样品的存活的细胞量，使得时刻0的细胞量是已知的。在纤维移植后的第3天或第4天开始用实验试剂处理小鼠，并每天进行处理，如此持续4天。通过腹腔注射以2个剂量水平给予每种试剂。在第四种化合物处理的那天从小鼠收集纤维，并进行稳定的终点MTT分析。通过分光光度法在540nm下测定每个样品的光密度，并计算每个处理组的平均值。计算每一处理组中每种细胞系的净生长百分比，并与载体处理对照中的净生长百分比作比较。与载体对照样品相比，处理样品中的净生长百分比降低50％或更大被认为是阳性结果。每个阳性结果评分为2，对于给定化合物合计所有分值。试剂的最大可能分值是96(12种细胞系×2个位点×2个剂量水平×2[分])。
在中空纤维分析中初始筛选出的候选化合物，如果其ip+sc分值之和为20或更大，sc分值为8或更大，或者在所评价的任何剂量水平下造成任何细胞系的细胞杀死，那么随后可以在异种移植模型中进行测试。这种评分体系已经得到CTEP的DCTDC统计员的证实，代表着将现有“标准”试剂评分为活性的检测水平。
可选择地，可以在异种移植模型中直接测试式I的化合物。其中人肿瘤已被植入到动物中的异种移植模型是分析候选化合物的抗癌活性的标准模型。人癌症的异种移植模型的例子包括但不限于人实体瘤异种移植物，通过皮下注射或移植植入并用在肿瘤生长分析中；人实体瘤同种移植物，通过脂肪垫注射植入并用在肿瘤生长分析中；人实体瘤同位异种移植物，直接植入相关组织中并用在肿瘤生长分析中；实体瘤或白血病用的播散性疾病模型，经静脉注射植入并用在生存分析中；小鼠中淋巴瘤和白血病的实验模型，用在生存分析中；以及小鼠中的肺转移的实验模型。除了植入的人肿瘤细胞之外，异种移植模型还可以包括移植的人外周血白细胞，其用于评价抗癌免疫反应。在各种异种移植模型中，植入或移植的人肿瘤细胞可以是原发性肿瘤细胞或源于细胞系的肿瘤细胞。
几种宿主动物选项用于异种移植模型，包括但不限于使用重度联合免疫缺失(SCID)小鼠、无胸腺裸鼠和无胸腺大鼠。非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺失小鼠(NOD/SCID)代表可用于各种异种移植模型中的另一种宿主动物，例如，用于植入血液癌细胞，如白血病和/或淋巴瘤细胞。
可选择地，鼠科动物癌症模型可用于筛选抗肿瘤化合物。适合的鼠科动物癌症模型的例子是本领域中已知的，包括但不限于通过静脉、皮下、脂肪垫或同位注射植入鼠科动物癌细胞的移植模型；鼠科动物转移模型；转基因小鼠模型；和基因敲除小鼠模型。还可以在正常小鼠中分析候选化合物对自发性肿瘤的影响。
例如，可以使用在第0天皮下移植或注射30～60mg肿瘤碎片或适量肿瘤细胞(例如约106～107个细胞)的小鼠针对实体瘤体内测试候选化合物。在进行各种处理和对照之前，混合带有肿瘤的动物。在处理晚期肿瘤的情况下，允许肿瘤发展到所需大小，除去肿瘤未充分发展的动物。随机分布所选动物，进行处理和对照。不带肿瘤的动物可以进行与带有肿瘤的动物相同的处理，从而能够分离毒性作用与对肿瘤的特定影响。化疗通常从移植后3～22天开始，这取决于肿瘤类型，每天观察动物。候选化合物可以通过例如输注给予动物。每周称量不同动物组的重量约3或4次，直到获得最大重量损失，其后每周称量各组重量至少1次，直到试验结束。
每周测量肿瘤约2或3次，直到肿瘤到达预定的大小和/或重量，或者直到过了预定的时间，或者直到动物死亡(如果在肿瘤到达预定的大小/重量发生这种情况)。然后处死动物，分析肿瘤的组织学、大小和/或增殖。
通过在异种移植物实验中使用耐药性或多药耐药性癌细胞，可以分析候选化合物对耐药性肿瘤的体内影响。
为研究候选化合物对血液肿瘤如淋巴瘤或白血病的影响，用特定数量的细胞植入或注射入动物，并通过处理的小鼠相对于对照的生存时间增加来测定抗肿瘤活性。通过使用流式细胞术或聚合酶链反应(PCR)从一系列血液样品测量白血病的各种指示如细胞表面标志物或白血病特异性基因的表达，可以分析白血病异种移植模型中的疾病负担。
为研究候选化合物对肿瘤转移的影响，通常用化合物离体处理肿瘤细胞，然后注射入适合的测试动物。然后，在适合的时间内监测肿瘤细胞从注射位置的扩散。
在上述模型中还可以测试候选化合物与另一种化疗剂组合使用或敏化另一种化疗剂对肿瘤影响的能力。在这种情况下，同时用化疗剂和候选的式I化合物处理测试动物。对照动物可以包括仅用化疗剂处理的动物、仅用候选化合物处理的动物和/或未处理的动物。
可以通过标准技术评价式I化合物的体内毒性作用，例如，通过测量处理过程中对动物体重的影响并在处死动物后进行血常规和肝酶分析(生存分析)。
表2：人癌症的体内模型的例子
  癌症模型   细胞类型
  肿瘤生长分析小鼠中的人实体瘤异种移植物(皮下注射)   ***(PC-3，DU-145)乳腺(MDA-MB-231，MVB-9)结肠(HT-29)肺(NCI-H460，NCI-H209)胰腺(ASPC-1，SU86.86)胰腺：耐药性(BxPC-3)皮肤(A2058，C8161)
  子宫颈(SIHA，HeLa-S3)子宫颈：耐药性(耐HeLa S3-HU)肝(HepG2)大脑(U87-MG)肾(Caki-1，A498)卵巢(SK-OV-3)膀胱(T24)
  肿瘤生长分析小鼠中的人实体瘤同种移植物(脂肪垫注射)   乳腺：耐药性(MDA-CDDP-S4，MDA-MB435-To.1)
  生存分析小鼠中的淋巴瘤和白血病的实验模型   人：Burkitts淋巴瘤(Non-Hodgkin′s)(raji、Namalwa、HS Sultan)，组织细胞淋巴瘤(U-937)，慢性骨髓性白血病(K-562)，急性淋巴细胞白血病(T-ALL)(Jurkat、CEM、MOLT-4)，T-细胞淋巴瘤(Karpas 299)，浆细胞白血病(L-363)鼠科动物：红白血病(CB7 Friend逆转录病毒诱导的)，淋巴细胞白血病(L1210)，淋巴瘤(P388)
  小鼠中的肺转移的实验模型   人：黑素瘤(C8161)鼠科动物：纤维肉瘤(R3)
此外，在需要时，通过例如测量肿瘤抑制mRNA或蛋白水平的变化，可以在测试动物的肿瘤中分析式I的化合物对过渡金属调控的肿瘤抑制基因表达水平的影响。进行这些分析的方法是如上所述的本领域中已知的方法。
在需要时，还可以对从测试动物分离出的组织进行一种或多种标准免疫组织化学测试，以测定化合物对肿瘤生长、分化、细胞凋亡和/或血管生成的影响。这种测试的例子包括但不限于使用特异性抗体(例如，对Ki-67的抗体用于分析增殖，对CD31的抗体用于分析血管生成，对NK1.1的抗体作为存在NK细胞的指示，对F4/80的抗体作为存在巨噬细胞的指示)和TUNEL分析以确定细胞凋亡。
D.毒性试验
在需要时，可以对式I的化合物进行毒性试验。潜在药物的毒性试验是本领域中公知的(参见例如，Hayes，A.W.编著，(1994)，Principles andMethods of Toxicology，3rd ed.，Raven Press，NY；Maines，M.编著，CurrentProtocols in Toxicology，John Wiley & Sons，Inc.，NY)。
式I化合物的体外急性毒性试验可以使用哺乳动物细胞系进行(参见例如，Ekwall，B.，Ann.N.Y.Acad.Sci，(1983)407：64-77)。适合细胞系的选择取决于候选化合物的潜在应用，并且本领域技术人员容易确定。例如，这些测试包括在市售载体存在下用式I的化合物体外处理人原发性纤维原细胞。然后，使用标准存活分析，如台盼蓝排除分析、XTT或MTT分析在处理后的不同时间点测试细胞的生存。还可以例如使用胸腺嘧啶脱氧核苷加入法分析细胞合成DNA的能力，并例如使用标准细胞分选分析组合流式细胞分选仪(FACS)分析细胞周期动力学的变化。
可以通过标准方法进行体内毒性试验，例如，给适合的动物模型注射不同浓度的候选化合物。化合物可以注射一次或者几天内重复给予。可以通过在适合的时间内监测动物的死亡率、行为变化、外观和体重来评价化合物的毒性作用。在评价期结束后，可以将动物处死，然后确定相关器官的外观和重量。在需要时，可以进行额外的分析，例如血常规、组织学和肝酶分析。在化合物的体内抗癌试验中还可以获得化合物毒性的指示。
在需要时，可以使用标准技术，分析式I化合物的体外遗传毒性，如Ames分析用于筛选突变活性，小鼠淋巴瘤分析用于测定供试品诱导哺乳动物细胞系中基因突变的能力，使用例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的体外染色体畸变分析用于测定供试品诱导的任何DNA重排或损害。其他分析包括用于供试品诱导的染色体臂之间的任何交换的姐妹染色单体分析和用于测定对染色体或对有丝***纺锤体任何损害的体外小鼠微核分析。在需要时，还可以使用体内姐妹染色单体交换分析、体内微核分析或体内染色体畸变分析来分析式I化合物的体内遗传毒性。关于这些和其他标准分析的方案是本领域中已知的，例如，参见OECD Guidelinesfor the Testing of Chemicals和ISO研究的方案。
IV.式I化合物的用途
式I的化合物可以用于治疗、稳定或预防受试者的癌症。关于这一点，所述化合物可以发挥细胞毒作用或细胞抑制作用，从而使肿瘤大小减小、减慢或预防肿瘤大小的增大、使得肿瘤消失或除去与其再现之间的无疾生存的时间增加、预防肿瘤的初始发生或后续发生(例如转移)、增加进展时间，减小与肿瘤相关的一种或多种不利症状，或增加癌症受试者的总生存时间。根据本发明的一个实施方案，式I的化合物通过诱导癌细胞中的细胞凋亡对癌细胞发挥细胞毒作用。
示例性肿瘤包括但不限于血液肿瘤，包括白血病、骨髓瘤和淋巴瘤；癌，包括腺癌和鳞状细胞癌；黑素瘤和肉瘤。癌和肉瘤也常称作“实体瘤”。常见实体瘤的例子包括但不限于脑、乳腺、子宫颈、结肠、头和颈、肾、肺、卵巢、胰腺、***、胃和子宫的癌、非小细胞肺癌和结肠直肠癌。各种形式的淋巴瘤也会导致形成实体瘤，因此也常被认为是实体瘤。
本发明的一个实施方案提供式I化合物在治疗***癌、非小细胞肺癌、结肠癌和白血病中的一种或多种中的用途。此外，根据本发明的一个实施方案，式I的化合物可用于通过增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达治疗癌症。在具体实施方案中，式I的化合物可以用于治疗、稳定或预防其中金属调控的肿瘤抑制基因KLF4用作肿瘤抑制剂的癌症，包括胃肠(GI)道癌、膀胱癌和白血病。胃肠道癌包括胃癌、食管癌、小肠癌、十二指肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌和***癌。
在一个实施方案中，本发明还提供式I的化合物增加过渡金属调控的肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达的用途。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物增加KLF4肿瘤抑制基因在癌细胞中的表达的用途。
因此，可以根据本发明的一个实施方案治疗的癌症包括但不限于白血病；腺癌和癌，包括鳞状细胞癌。如上所述，癌也常称作“实体瘤”，可以根据本发明治疗的常见实体瘤的例子包括但不限于***癌、膀胱癌、结肠癌、结肠直肠癌、十二指肠癌、胃癌、肺(非小细胞)癌、食管癌、***癌、直肠癌和小肠癌。因此、本发明的一个实施方案提供式I的化合物在治疗选自白血病、膀胱癌、肺(非小细胞)癌、***癌和胃肠道癌的癌症中的用途，其中胃肠道癌包括但不限于***癌、结肠癌、结肠直肠癌、十二指肠癌、胃癌、食管癌、直肠癌和小肠癌。
术语“白血病”广义上指血液形成器官的进展性、恶性疾病。白血病常见特征在于，白细胞和其前体在血液和骨髓中的畸形增殖和发展，但也可以指其他血细胞的恶性疾病，如红白血病，其影响不成熟的红血细胞。临床上通常基于以下事实对白血病分类：(1)疾病的持续时间和特性-急性或慢性；(2)涉及到的细胞类型-骨髓细胞(骨髓性)、淋巴细胞(淋巴性)或单核细胞，和(3)血液中异常细胞的增加或未增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)。白血病包括例如急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T-细胞白血病、非白血病性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱粒细胞白血病、原始细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、胚性白血病、嗜酸性白血病、Gross白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、原始血细胞白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴腺白血病、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴性白血病、淋巴白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小骨髓芽球性白血病、单核细胞白血病、原始粒细胞性白血病、髓细胞白血病、骨髓粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化的细胞白血病。
术语“癌”指倾向于渗透周围组织并引起转移的由上皮细胞构成的恶性新生长。术语“癌”也包括腺癌。腺癌是起源于构成具有腺体(分泌)性能的器官的细胞的癌或是起源于排列在空腔脏器如胃肠道的细胞或支气管上皮细胞的癌，包括肺的腺癌和***的腺癌。
根据本发明，式I的化合物可以用于治疗癌细胞、肿瘤和/或癌症发展和进展的各阶段和等级。因此，本发明预期组合物在治疗早期阶段癌症中的用途，包括可以是小的、缓慢生长的、局部的和/或非侵袭性的早期瘤形成，例如，意图治愈疾病或使癌症受到抑制；以及在治疗中期阶段癌症和在治疗晚期癌症中的用途，包括晚期和/或转移性和/或侵袭性瘤形成，例如，减缓疾病进展、降低转移或提高患者存活率。相似地，组合物可用于治疗低等级癌症、中等级癌症和/或高等级癌症。
本发明也预期所述化合物可用于治疗顽固性癌症、复发癌症(包括局部复发、远处复发)和/或难治性癌症(即对治疗不响应的癌症)、转移性癌症、局部晚期癌症和侵袭性癌症。因此，“晚期”癌症包括局部晚期癌症和转移性癌症，并且指患者中的明显疾病，其中所述明显疾病不能通过诸如手术或放射治疗等局部治疗形式治愈。术语“转移性癌症”指从身体的一个部分扩散到另一个部分的癌症。晚期癌症也可以是不可切除的，即它们已扩散到周围组织并且不能通过手术除去。
本领域技术人员应当理解，这些类别中的多个类别可以重叠，例如，侵袭性癌症通常也是转移性的。本说明书中，“侵袭性癌症”指快速生长的癌症。本领域技术人员应当理解，对于一些癌症而言，如乳腺癌或***癌，术语“侵袭性癌症”指对于给定癌症在复发时间范围的大约前三分之二内已经复发的晚期癌症，而对于其他类型的癌症而言，如小细胞肺癌(SCLC)，几乎所有病例均是快速生长的癌症并被认为是侵袭性的。因此，该术语覆盖某种癌症类型的小部分，或可以包括所有其他癌症类型。
所述化合物还可以用于治疗耐药性癌症，包括多药耐药性肿瘤。本领域中已知的是，癌细胞耐化疗是癌症控制中的核心问题之一。
某些癌症如***癌可以通过激素疗法来治疗，即，使用激素或抗激素药物，通过阻断身体的天然激素来减缓或终止某些癌症的发展。所述癌症可以发展为耐激素治疗，或固有地耐激素治疗。本发明还预期所述化合物在治疗所述“耐激素性”或“激素难治性”癌症中的用途。
本发明也预期所述化合物作为选择性地抑制癌细胞生长的“敏化剂”的用途。在这种情况下，所述化合物单独对癌细胞没有细胞毒作用，但是提供一种弱化癌细胞的方式，并更好地利用从常规抗癌治疗剂或治疗法的应用获得的优点，或以其他方式加强所述治疗剂或治疗法。
因此，本发明预期给予受试者治疗有效量的一种或多种化合物及一种或多种抗癌治疗剂或治疗法。可以在用抗癌治疗剂或治疗法治疗之前、之中或之后给予所述化合物。“抗癌治疗剂或治疗法”是一种防止或延迟癌细胞生长和/或转移的化合物、组合物或治疗法。所述抗癌治疗法包括但不限于化疗药物治疗、放射治疗、基因治疗、激素控制、免疫治疗和反义寡核苷酸治疗。有用的化疗药物的例子包括但不限于羟基脲、白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、苯丙酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、长春新碱、长春碱、Navelbine
Figure A20068002337700771
(长春瑞滨)、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉萜、吉西他滨、胞嘧啶、***糖苷、博莱霉素、新制癌菌素、苏拉明、泰素、丝裂霉素C等。本发明的化合物也适用于利用两种或多种化疗剂的标准组合治疗。应该理解，本发明使用的抗癌治疗剂或治疗法还包括在将来发展出的化合物或治疗法。
式I的化合物也适用于需要螯合过渡金属的各种应用中，例如在治疗应用中。金属螯合与治疗身体中的金属中毒、金属毒性、金属过量相关，如与遗传紊乱和/或输血依赖性贫血症、微生物感染、免疫介导的疾病或紊乱、皮肤疾病或紊乱、神经疾病或紊乱、心血管疾病或紊乱、衰老相关的疾病或紊乱、或遗传疾病或紊乱相关的铁超载。在本发明的一个实施方案中，式I的化合物可用于治疗应用中，例如，用于体内螯合金属离子，用于治疗除癌症之外的疾病或紊乱。
式I的化合物也可用于需要螯合过渡金属的产品或方法中，例如，用于防止或控制生成氧化皮、化学降解、脱色、沉淀、微生物生长、乳液不稳定性、腐臭和/或与不希望的金属离子相关的其他问题，如脱臭、脱味、浑浊、透明度损失、质地劣化、晶体形成、粘度变化、氧化。螯合剂在这些情况下的用途可以有助于改进产品质量、消费者控诉、保质期或价值，改进加工效率，减小设备停工期，或降低加工成本。因此，本发明预期式I的化合物在各种应用中螯合金属离子的用途，包括但不限于食品和饮料品、清洁用品、个人护理产品、药物、诊断性应用、浆料和纸应用、水处理应用、金属加工应用、织物应用、农产品和应用、橡胶加工应用、摄影应用、印刷油墨、油田应用、采矿应用、气体净化、建筑应用、电子应用、或清除氧化皮和预防氧化皮生成。
V.药物组合物
本发明的化合物通常在给药之前配制。因此，本发明提供了包括一种或多种式I的化合物和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。采用公知的或容易获得的成分根据已知的方法制备药物组合物。包括一种或多种式I的化合物及一种或多种已知的癌症化疗剂的药物组合物也在本发明的预期内。
通式I的化合物或含有所述化合物的药物组合物可以以含有常规无毒的药学可接受的载体、辅料和载体的剂量单位制剂经口服、局部、胃肠外、通过吸入或喷雾、或经直肠给予。在常规治疗过程中，将活性化合物加到可接受的载体中，形成局部给予至受影响区的组合物，如疏水性或亲水性霜剂或洗剂，或形成适于口服、直肠或胃肠外给予的形式，如糖浆剂、酏剂、片剂、含片、锭剂、硬或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性混悬剂、分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、注射剂或溶液剂。本说明书中，术语胃肠外包括皮下注射、皮内、关节内、静脉内、肌肉内、血管内、胸骨内、鞘内注射或输注技术。
本发明还提供包括一种或多种式I化合物和载体，如人造膜囊(包括脂质体、脂质胶束等)、微粒或微胶囊的药物组合物。
用于口服的组合物可以制备成固体或流体单位剂型。可以根据本领域已知的制备药物组合物的方法来制备流体单位剂型，并且所述组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂的试剂，以提供药学可接受的美观可口的制剂。通过使用水醇性(例如，乙醇)载体与适合的甜味剂如糖和糖精以及芳香性调味剂，来制备酏剂。可以使用水性载体在悬浮剂如***树胶、黄芪胶、甲基纤维素等的辅助下制备混悬剂。
固体制剂如片剂含有活性成分和非毒性的适于制备片剂的药学可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂例如可以是惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、白明胶或***树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石；以及其他常规成分，例如磷酸氢钙、硅酸铝镁、硫酸钙、淀粉、乳糖、甲基纤维素和功能上相似的材料。片剂可以是无包衣的，或者通过已知的技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更久的持续作用。例如，可以使用延迟时间的材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂还可以是硬的明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如是碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者是软的明胶胶囊，其中活性成分与水或油性介质混合，所述油性介质例如是花生油、液体石蜡或橄榄油。通过机器将化合物与可接受的植物油、轻质液体矿脂或其他惰性油的浆料进行封装来制备软的明胶胶囊。
水性混悬液含有活性材料与适于制备水性混悬液的赋形剂的混合物。所述赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和***树胶；分散剂或湿润剂，可以是天然磷脂(例如卵磷脂)、或脂肪酸与烯基氧化物的缩合物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或长链脂肪醇与环氧乙烷的缩合物(例如十七烷基乙烯氧基十六醇(hepta-decaethyleneoxycetanol))、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合物(例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性混悬液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂，或一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性混悬液可以通过将活性成分悬浮于植物油或矿物油中制备，所述植物油例如是花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，所述矿物油例如是液体石蜡。油性混悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬质石蜡或十六醇。可以加入上面列出的甜味剂和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来防腐。
适于通过加入水而制备的水性混悬液的分散粉剂和颗粒剂含有活性成分与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂可以是上面所提到的那些。也可以加入另外的赋形剂，如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物也可以为水包油乳剂形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，也可以是矿物油，例如液体石蜡，或它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然树胶(例如***树胶或黄芪树胶)；天然磷脂(例如大豆卵磷脂)和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如山梨糖醇酐单油酸酯)；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。乳剂也可以含有甜味剂和调味剂。
药物组合物可以为无菌可注射的水性或油性混悬液。这种混悬液可以根据已知的工艺，使用上述的适宜分散剂或湿润剂和悬浮剂制备。无菌注射制剂还可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂的无菌注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇溶液。可以使用的可接受载体和溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。可以使用任何温和的不挥发油达到这个目的，不挥发油包括合成的单或二甘油酯。此外，发现脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。辅料如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以包含在注射溶液或混悬液中。
式I的化合物可以共同或单独地以栓剂形式给予，用于直肠给药。可以通过将药物与适宜的无刺激赋形剂混合来制备这些组合物，所述赋形剂在常温下为固体，而在直肠温度下为液体，并因此在直肠中融化释放药物。这种材料包括可可油和聚乙二醇。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法在本领域中是已知的，并记载在例如″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″(之前的″Remingtons Pharmaceutical Sciences″)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams& Wilkins，Philidelphia，PA(2000)中。
VI.式I化合物的给予
根据将要治疗的癌症，可以通过各种途径将式I的化合物给予至受试者，例如，所述化合物可以以剂量单位制剂经口服、局部、胃肠外、通过吸入或喷雾、或经直肠给予。在一个实施方案中，将化合物全身性地给予至受试者，例如，通过团注或输注进受试者的血流中或通过口服给予。当与一种或多种已知化疗剂联合使用时，可以在给予化疗剂之前或之后给予所述化合物，或者可以同时给予。一种或多种化疗剂也可以被全身性地给予，例如通过团注、输注或口服给予。
式I的化合物可以用作新辅助治疗的一部分(相对于主要治疗)，或用作辅助治疗方案的一部分。本发明预期式I的化合物在肿瘤发展和进展的各种阶段中的用途，包括在治疗晚期和/或侵袭性瘤形成(即不能通过诸如手术或放射治疗等局部治疗形式治愈受试者的明显疾病)、转移性疾病、局部晚期疾病和/或难治性肿瘤(即对治疗不响应的癌症或肿瘤)中的用途。
“主要治疗”指经初始诊断癌症在受试者中的一线治疗。示例性主要治疗可以包括手术、各种化疗和放射治疗。“辅助治疗”指主要治疗后给予有复发风险受试者的治疗。辅助全身性治疗经常在主要治疗后不久就开始，以延迟复发、延长存活率或治愈受试者。
预期本发明的化合物可以单独使用，或者与作为主要治疗或辅助治疗一部分的一种或多种其他化疗剂组合使用。式I化合物和标准化疗剂的组合可用于改进化疗的功效，因此，可以用于改进标准癌症治疗。在治疗对标准治疗不响应的耐药性癌症中这种应用很重要。耐药性癌症可以起因于例如肿瘤细胞群的异质性、响应于化疗的变化和恶性潜能的增加。在疾病的晚期阶段这些变化经常更显著。
给予的剂量并不局限于定义的界限，但是通常是有效量。通常，剂量将与由给药制剂通过活性自由药物的代谢释放产生的药理活性自由形式达到所需的药理和生理效应的摩尔量相当。药物组合物可以配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，其适合作为给予人体和其他哺乳动物的给药剂量单位，每个单位含有预定量的活性材料和适宜的药用赋形剂，该预定量的活性材料通过计算以达到所需的治疗效果。每个剂量单位中的化合物量的范围为约0.05～100mg，或更通常约1.0～50mg。
本发明的化合物的典型日剂量为约0.01～100mg每千克体重，单次或分剂量给药。然而，可以理解，实际给予的化合物剂量将由医师根据相关情况决定，包括治疗的病症、选择的给药途径、实际给予的化合物、个体患者的年龄、体重和反应，以及患者症状的严重性。因此，上述的给药范围仅是示例性的，并不以任何形式限制本发明的范围。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能也过量，而在其他情况下，可能使用更大剂量，但并不引起有害的副反应，例如首先将较大剂量分成几个较小剂量全天给予。
VII.在癌症患者中的临床试验
本领域技术人员应当理解，在证实式I的化合物在体外和动物模型中的效力之后，可以进行标准GLP动物毒理学和药代动力学研究，然后进入临床试验，以进一步评价其在治疗癌症中的功效并获得治疗用途的管理审批。本领域中已知的是，临床试验包括各试验阶段，称作I期、II期、III期和IV期。
首先，在I期试验中评价所选的式I化合物，I期试验经常是开放标记试验。通常，I期试验用于确定化合物的最佳给药方式(例如，通过丸剂或通过注射)、给药频率和毒性。I期研究经常包括实验室测试，如血液测试和活组织检查，以评价式I化合物在患者体内的作用。对于I期试验，用特定量的式I化合物治疗癌症患者小组。在试验中，剂量通常按组增加，以确定与化合物相关的最大耐受剂量(MTD)和剂量限制性毒性(DLT)。该过程确定了在后面的II期试验中使用的适宜剂量。
可以进行II期试验以进一步评价本发明化合物的效力和安全性。在II期试验中，使用I期试验中发现的有效剂量，将这些化合物给予至患有特定类型癌症或患有相关癌症的患者组。
III期试验主要确定如何将化合物与标准或被最广泛接受的治疗作比较。在III期试验中，将患者随机分配到两个或多个“臂”中的一个臂。例如，在两臂试验中，一个臂接受标准治疗(对照组)，另一个臂接受使用本发明化合物的治疗(研究组)。
IV期试验用于进一步评价化合物的长期安全性和效力。IV期试验比I期、II期和III期试验更少见，并在已经批准化合物用于标准使用之后进行。
A.临床试验的患者资格
参与者资格标准可以从一般(例如，年龄、性别、癌症类型)变化到特殊(例如，在先治疗的类型和数量、肿瘤特征、血细胞计数、器官功能)。资格标准也可以随试验阶段变化。例如，在I期和II期试验中，该标准经常不包括由于异常器官功能或其他因素而有研究治疗风险的患者。在II期和III期试验中，经常包括关于疾病类型和阶段以及在先治疗的数量和类型的额外标准。
I期癌症试验经常包括对其他治疗选项无效的15～30名参与者。II期试验通常包括已经接受化疗、手术或放射治疗，但治疗无效的参与者达100名。基于接受的在先治疗，参与II期试验经常受到限制。III期试验经常包括数百名至数千名参与者。为确定本发明的化合物和标准治疗之间效力是否存在真正差异，必需大量参与者。III期可以包括新诊断出患有癌症的患者至患有广泛疾病的患者，以覆盖疾病连续带。
本领域技术人员应当理解，临床试验应被设计成尽可能广泛，而不能使研究群体过于变化，以确定治疗是否对更窄的确定群体有效。试验中包括的群体变化越多，结果越能适用于一般群体，特别是在III期试验中。在临床试验的每一阶段中选择适合的参与者被认为是本领域技术人员的普通技能。
B.治疗之前患者的评估
在开始研究之前，可以使用本领域中已知的几种方法首先将患者分类。例如，首先可以使用Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)Performance Status(PS)(东部肿瘤协作组体能状态)评分来评估患者。ECOG PS是用于通过测量患者的功能损害评估患者疾病进展的被广泛接受的标准，ECOG PS 0表明没有功能损害，ECOG PS 1和2表明患者具有逐渐增大的功能损害但仍可活动，ECOG PS 3和4表明渐进性的残废和缺乏活动性。
例如，可以使用McGill Quality of Life Questionnaire(MQOL，生存质量量表)(Cohen等人(1995)Palliative Medicine 9：207-219)评估患者的生存总质量。MQOL测量身体症状；身体上、心理上和存在的幸福感；赡养；和生存总质量。为评估诸如反胃、情绪、食欲、失眠、活动性和疲劳等症状，可以使用McCorkle和Young((1978)Cancer Nursing 1：373-378)研究的Symptom Distress Scale(SDS，忧虑症状评分)。
还可以根据患者的疾病类型和/或阶段和/或根据肿瘤大小对患者分类。
C.药代动力学监测
为符合I期标准，例如通过化学分析定期收集的样品如血液或尿液来监测化合物的分布。例如，可以定期采集样品，直到在输入开始后约72小时。在一个实施方案中，在输入各化合物开始后的第0、0.33、0.67、1、1.25、1.5、2、4、6、8、12、24、48和72小时采集样品。
如果没有立即进行分析，那么可以在收集后将样品置于干冰上，并随后转移至冷冻箱中，在-70℃下保存，直到可以进行分析。可以使用本领域中已知的标准技术制备分析用的样品，并且例如可以通过高效液相色谱(HPLC)测定化合物的存在量。
与临床药理学专家合作，可以得到药代动力学数据并进行分析，然后用于测定例如清除率、半衰期和最大血药浓度。
D.患者结果的监测
临床试验的终点是表明评价中的化合物的效力的可测量结果。在开始试验之前确立终点，并随临床试验的类型和阶段变化。终点的例子包括例如肿瘤响应率——肿瘤大小减小特定量的试验参与者的比例，经常记作百分数；无病生存——参与者生存而没发生癌症或复发的时间量，经常按月测量；总生存——参与者活着的时间量，通常从临床试验开始直到死亡时间。对于晚期和/或转移性癌症，疾病稳定性——疾病已经稳定的试验参与者，例如肿瘤已经停止生长和/或转移的试验参与者的比例可以用作终点。其他终点包括毒性和生存质量。
肿瘤响应率是II期试验中的典型终点。然而，即使治疗减小了参与者的肿瘤大小并延长了无病生存的时间，但也不能延长总生存。在这种情况下，副作用和不能延长总生存会超过更长无病生存的益处。可选择地，在无肿瘤期内参与者改善的生存质量会超过其他因素。因此，由于肿瘤响应率经常是临时性的，并且不能转变成参与者的长期生存优点，因而响应率是II期试验中治疗效力的合理量度，而参与者生存和生存质量通常用作III期试验的终点。
VIII.试剂盒
本发明还提供了含有一种或多种式I的化合物的治疗试剂盒。在一个实施方案中，所述治疗试剂盒用于治疗癌症。试剂盒的内含物可以是冻干的，并且试剂盒还可以含有用于重构冻干成分的适合溶剂。试剂盒中的每种成分可以包装在单独的容器内，该容器上可以有管理医药品或生物制品的生产、使用或销售的由政府机构指定形式的产品说明，该产品说明反应政府机构对人类或动物给药所进行的生产、使用或销售的批准。
当试剂盒中的成分是以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液可以是水溶液，例如无菌水溶液。对于体内使用，化合物可以制备成药学可接受的可注射组合物。在这种情况下，容器本身可以是吸入器、注射器、吸液管、滴眼管或其他类似的设备，通过这些设备可以将制剂给予受试者感染部位如肺部、注射给受试者或者与试剂盒中的其他成分混合使用。
包括一种或多种本发明的化合物及一种或多种标准化疗剂、用于组合治疗应用的药物试剂盒或包装也是本发明所预期的。
本发明还证实，式I的化合物能够螯合过渡金属离子。因此，本发明还提供含有一种或多种式I的化合物、用于螯合过渡金属离子的试剂盒。
下面结合具体实施例说明本发明。可以理解，以下实施例仅是为了描述本发明的实施方案，不应当以任何形式限制本发明。
实施例
制备化合物：
根据下文所示方案制备式(I)的示例性化合物：
Figure A20068002337700861
在一般过程中，将1mmol(1当量)菲咯啉醌(phenanthrolinequinone)与等摩尔量的相应醛和乙酸铵10mmol(10当量)在冰乙酸中回流。通过TLC监测反应过程，直到反应物完全消耗。反应完成后，将反应混合物冷却到室温，用水稀释，用二氯甲烷(DCM)从得到的溶液萃取出杂质。使水层碱化，分离出2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉的沉淀，过滤，并用适合的溶剂重结晶。在需要时，用R7X处理其中R7是H的2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉，得到其中R7不是H的化合物(I)。
根据以下方案制备式(III)的吲哚-3-甲醛：
在一般的实验过程中，将11mmol(1.1当量)POCl3逐滴滴加到5-10℃的吲哚(10mmol，1.0当量)的15-20mL二甲基甲酰胺(DMF)的磁力搅拌溶液中。将混合物在室温下搅拌0.5小时，在60℃下搅拌0.5小时，冷却到室温，倒在100g冰上。得到的溶液用NaHCO3碱化至pH＞7，将混合物在60℃下搅拌1小时，分离出沉淀，过滤，并用适合的溶剂重结晶。
使用MEL-TEMP毛细管熔点仪记录熔点，熔点未经校正。在室温下，使用适合的氘代溶剂，用500MHz Brucker仪测定1H-NMR。
实施例1：制备化合物2
Figure A20068002337700871
将菲咯啉醌(0.42g)和5-溴吲哚-3-甲醛(0.45g)的悬浮液在乙酸铵(1.54g)存在下在乙酸(15mL)中回流1小时。过滤形成的黄色沉淀，用乙醇洗涤，用DMF结晶。
产量0.70g(85％)。M.p.＞400℃。
用HCl(g)处理0.200g化合物2(0.483mmol)的DMF溶液，直到不再观察到沉淀。然后过滤固体，用二氯甲烷和己烷洗涤，真空干燥。将得到的所需HCl盐溶解在水中。
实施例2：制备化合物3
Figure A20068002337700872
将菲咯啉醌(1.05g)和2-甲基吲哚-3-甲醛(0.80g)的混合物在乙酸铵(3.85g)存在下在乙酸(20mL)中回流2小时。将冷却的红色溶液倒入水(150mL)中。用DCM(3×50mL)萃取出杂质并弃去。用NaOH(100mL 10％溶液)和过量Na2CO3将水层中和至碱性溶液。过滤分离出的沉淀，用水洗涤，在EtOH(30mL)中回流10min。过滤结晶产物(化合物3)，用EtOH、DCM和己烷洗涤。产量0.92g(57％)。
实施例3：制备化合物4
Figure A20068002337700881
将菲咯啉醌(0.105g)和5-氟吲哚-3-甲醛的混合物(0.082g)在乙酸铵(0.39g)存在下在乙酸(3mL)中回流0.5小时。过滤分离出的沉淀，用50％乙醇水溶液和EtOH洗涤，真空至干。产量0.15g(85％)。
实施例4：制备化合物5
Figure A20068002337700882
将0.96g POCl3逐滴滴加到10℃的2-甲基-5-氯吲哚(1.0g)的20mLDMF溶液中。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却，用饱和NaHCO3稀释。悬浮液在60℃下加热15min，冷却，过滤2-甲基-5-氯吲哚-3-甲醛的沉淀。产量1.14g(99％)。分析样品用EtOH结晶。
将菲咯啉醌(0.210g)和2-甲基-5-氯吲哚-3-甲醛(0.203g)的混合物在乙酸铵(0.77g)存在下在乙酸(5mL)中回流1.5小时。过滤分离出的化合物5的沉淀，用AcOH、EtOH+H2O和EtOH+EtOAc洗涤。产量0.230g(60％)。
实施例5：制备化合物6
Figure A20068002337700891
将菲咯啉醌(0.104g)和2-甲基-5-OCH3-吲哚-3-甲醛(0.095g)的混合物在乙酸铵(0.38g)存在下在乙酸(5mL)中回流2.5小时。用DCM稀释溶液，用水萃取。用DCM(2×40mL)洗涤水层，碱化，用EtOAc萃取。浓缩萃取物，用EtOH处理，得到结晶产物(化合物6)，过滤，用己烷洗涤。
实施例6：制备化合物7
Figure A20068002337700892
将1.69g POCl3逐滴滴加到10℃的2-甲基-5-氟吲哚(1.49g)的20mLDMF溶液中。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却，用饱和NaHCO3稀释。悬浮液在60℃下加热15min，冷却，过滤2-甲基-5-氟吲哚-3-甲醛的沉淀。产量1.14g(99％)。
将菲咯啉醌(0.210g)和2-甲基-5-氟吲哚-3-甲醛(0.177g)的混合物在乙酸铵(0.77g)存在下在乙酸(5mL)中回流1.5小时，倒入1％HCl中，用DCM萃取。用Na2CO3碱化水层，过滤化合物7的沉淀，用EtOH结晶。纯产物产量0.19g(52％)。
实施例7：制备化合物8
Figure A20068002337700901
将化合物6(0.150g)和HBr(4mL)的混合物在2mLAcOH中回流3.5小时。用水稀释悬浮液，用饱和Na2CO3水溶液碱化，用EtOAc萃取，真空除去溶剂。用甲苯-EtOH和DMF结晶残余物。产量0.03g(21％)。
实施例8：制备化合物9
Figure A20068002337700902
将1.7g POCl3逐滴滴加到10℃的2-苯基吲哚(1.93g)的20mL DMF溶液中。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却，用饱和NaHCO3稀释。悬浮液在60℃下加热15min，冷却，过滤2-苯基吲哚-3-甲醛的沉淀。产量2.05g(93％)。
将菲咯啉醌(0.105g)和2-苯基吲哚-3-甲醛(0.111g)的混合物在0.39g乙酸铵存在下在3mL乙酸中回流1.5小时。将红色溶液倒入水(100mL)中，用DCM(3×40mL)洗涤。用饱和Na2CO3水溶液中和水层，过滤得到的固体，用EtOH洗涤，用DMF∶EtOH∶H2O＝1∶1∶1结晶。得到纯化的固体0.12g，产率58％。
实施例9：制备化合物10
Figure A20068002337700911
将1.7mL POCl3逐滴滴加到10℃的2-(4-氟苯基)-吲哚(2.11g)的20mL DMF溶液中。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却，用饱和NaHCO3稀释。悬浮液在60℃下加热15min，冷却，过滤2-(4-氟苯基)-吲哚-3-甲醛的沉淀，用EtOH结晶。产量2.10g(88％)。
将菲咯啉醌(0.105g)和2-(4-氟苯基)-吲哚-3-甲醛(0.120g)的混合物在乙酸铵(0.38g)存在下在乙酸(3mL)中回流1.5小时，用DCM(50mL)稀释，用50mL 5％HCl处理。过滤分离出的黄色沉淀，用Na2CO3水溶液处理，用EtOAc萃取，除去溶剂。用DCM处理残余物。过滤分离出的化合物10的固体，用己烷洗涤。产量0.08g(37％)。
实施例10：制备化合物11
Figure A20068002337700921
将苯基肼(4.32g)加到4-乙酰基吡啶(4.76g)的30mL无水EtOH溶液中。加入3滴AcOH，在室温下搅拌溶液。发生放热反应，开始出现白色沉淀。将混合物回流1小时。冷却后，过滤分离出的4-乙酰基吡啶苯基腙的沉淀，干燥。产量6.04g。
在烧杯中加热腙(3.10g)和多磷酸(PPA)(18g)的混合物，缓慢升温，并用温度计搅拌。将混合物在180-190℃下保持10min，冷却，用Na2CO3水溶液稀释，用EtOAc萃取。浓缩有机层，通过硅胶过滤，用EtOAc洗涤。蒸发滤液，用甲苯结晶4-(2-吲哚基)吡啶的残余物。
将1.32g POCl3逐滴滴加到10℃的吲哚4-(2-吲哚基)-吡啶(1.46g)的20mL DMF溶液中。将混合物在50℃下搅拌1小时，冷却。TLC表明约50％转化，然后加入0.7g POCl3，将混合物在55-60℃下搅拌0.5小时。冷却混合物，用过量NaHCO3处理。悬浮液在60℃下加热1小时，冷却，过滤2-(4-吡啶基)吲哚-3-甲醛的沉淀。产量0.98g(59％)。
将菲咯啉醌(0.210g)和2-(4-吡啶基)吲哚-3-甲醛(0.212g)的混合物在乙酸铵(0.77g)存在下在乙酸(5mL)中回流1.5小时。过滤沉淀，在EtOH中溶解，用0.1mL NH4OH处理，除去溶剂几乎至干。用EtOAc处理残余物。过滤化合物11的沉淀。产量0.25g(61％)。
实施例11：制备化合物12
将12mL SOCl2逐滴滴加到搅拌的2-吲哚羧酸(5.44g)的甲苯悬浮液中，同时外部冷却烧瓶。1小时后，将混合物升至室温，将混合物搅拌度过周末。将甲苯(100mL)加到棕色的悬浮液中，将得到的混合物旋转蒸发至干。在接下来的转化中使用酰氯时没有进行纯化。
将酰氯(7.174g)的50mL DCM溶液逐滴滴加到哌啶(10.2g)的DCM溶液中，同时外部冷却烧瓶。将混合物在室温下搅拌1小时，用饱和NaHCO3水溶液处理。将有机层蒸发至体积15mL，通过硅胶过滤，用DCM+EtOAc洗涤，溶剂蒸发至15-20mL，过滤分离出的2-吲哚羰基哌啶的晶体，在室温下放置1小时后用己烷洗涤。产量5.37g。
将9.05g结晶酰胺(即，2-吲哚羰基哌啶)加到搅拌的LiAlH4(3.2g)的40mL THF悬浮液中，同时保持温度为45-55℃。在加入全部酰胺后，将悬浮液搅拌回流2小时。用EtOAc和6％NaOH猝灭反应，用EtOAc萃取，除去溶剂，得到油状(2-吲哚甲基)-N-哌啶。
将0.85g POCl3逐滴滴加到0℃的吲哚[即，(2-吲哚甲基)N-哌啶](1.07g)的10mL DMF溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时，倒进水中，碱化，用EtOAc萃取。用稀HCl萃取有机层。分离水层，碱化，用EtOAc萃取。蒸发溶剂。用EtOH结晶2-(N-哌啶亚甲基)-吲哚-3-甲醛的残余物。产量0.30g(25％)。
将菲咯啉醌(0.105g)和2-(N-哌啶亚甲基)-吲哚-3-甲醛(0.121g)的混合物在乙酸铵(0.38g)存在下在乙酸(3mL)中回流1.5小时，倒进稀HCl中，用DCM萃取杂质。使水层碱化，用EtOAc萃取。用无水Na2SO4干燥有机层，过滤，蒸发。用DCM处理油状残余物，过滤分离出的化合物12的晶体，用DCM∶己烷-1∶1洗涤。产量0.060g(28％)。
使用本申请中所述的方法或本领域技术人员已知的方法也可以制备其他示例性化合物。
实施例12：化合物3在人癌细胞系中的体外抗增殖活性
评价化合物2和化合物3在60种人癌细胞系组中的抗增殖作用，作为US National Cancer Institute(NCI)的DTP(Developmental TherapeuticsProgram)提供的体外抗癌筛选服务的一部分。这些化合物对大部分人肿瘤细胞系表现出抗增殖活性，包括NSCLC、白血病、结肠癌、***癌、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、CNS癌和乳腺癌，其中平均GI50(50％的生长抑制)值小于2μM(图1)。
作为式I化合物之一的化合物3表现出抑制活性，其GI50平均值为0.61μM～12.3μM。化合物3是极为有效的，但却是结肠癌、白血病、非小细胞肺癌和***细胞系的选择性抑制剂(图2)。白血病细胞系MOLT-4和CCRF-CEM受到最大抑制，其GI50值分别为16nM和30nM。三种白血病细胞系(MOLT-4、K-562和CCRF-CEM)的GI50值在纳摩尔范围内。第四种白血病细胞系实际上是骨髓瘤细胞系，其GI50值为2.88μM，并预期可以起到与其他白血病细胞系不同的作用。
实施例13：式I化合物在HT-29结肠癌细胞中的体外抗增殖活性
式I化合物抑制人结肠癌HT-29细胞增殖的能力测试如下。在本实施例和后面实施例中使用的HT-29结肠癌细胞在37℃下、在5％CO2-加湿培养器中，在生长培养基中保持为单层，所述生长培养基为用2mML-谷氨酰胺(Gibco，Grand Island，NY)、10％胎牛血清(FBS)(Multicell，WISENT Inc.St-Bruno，QC)、抗生素-抗真菌剂(Multicell)补充的McCoy′s5A改进培养基(Sigma，St.Louis，MO)。在使用之前将细胞转移至150mm组织培养板上并生长，直到亚融合(70-80％)。通过用不同浓度的表1所示化合物培养细胞6-7天，评价化合物的体外抗增殖活性。基于活细胞将四唑盐XTT还原成橙色甲臜(formazan)化合物的能力，测量这些化合物在该细胞增殖分析中的功效(XTT细胞增殖试剂盒II，Roche AppliedScience，Montreal，QC)。实验结果示于表3。
表3：式I化合物的抗增殖活性
Figure A20068002337700961
实施例14：测定金属螯合在化合物3抑制HT-29结肠癌细胞生长的能力中的作用
为确定在式I化合物的生长抑制活性中是否涉及到金属螯合，用外源金属(100μM的ZnCl2、FeCl2·4H2O、FeCl3·4H2O、MgCl2)培养HT-29细胞5天，同时使用对照载体DMSO、化合物3(5μM)或化合物13(25μM)培养HT-29细胞5天。化合物13(参见以下结构)是比化合物3效力更低的化合物，在结构上与化合物3密切相关，但在菲咯啉环中缺少必需的螯合氮。据推测，化合物13的生长抑制以与化合物3不同的机制进行。
Figure A20068002337700971
该实验结果示于图3。加入锌(100μM)完全削弱化合物3抑制HT-29细胞生长的能力，表明化合物3可以用作锌的螯合剂，并且过量的锌会阻断该化合物从必需的酶中螯合内源金属的能力。过量的铁和镁对化合物3的活性没有影响。这些金属对阴性对照化合物13的活性没有影响，这些金属对细胞本身的生长也没有影响。观察到锌对化合物3活性的影响在低浓度的化合物3(1-2μM)和100μM锌时最明显。
实施例15：铜对各种浓度的化合物3抑制HT-29结肠癌细胞生长的能力的影响
为确定在式I化合物的生长抑制活性中是否涉及到铜的螯合，在有或没有25μM CuSO4·5H2O存在下，用达到5μM的化合物3培养HT-29细胞5天。如图4所示，向HT-29细胞中加入25μM外源铜削弱化合物3对HT-29细胞的生长抑制活性，但是仅在低浓度的化合物3情况下(小于2μM)如此。相比而言，在高浓度化合物3(＞2.5μM)下，加入外源铜显著增强化合物3的活性。铜对化合物13的生长抑制作用没有影响或对细胞本身的生长没有影响。使用浓度达到100μM的铜得到相似的结果。这些结果表明，该化合物可以用作铜的螯合剂并且能够与铜形成细胞毒螯合配合物。
实施例16：外源金属对化合物3体外抑制HT-29结肠癌细胞生长的能力的影响
为确定在化合物3的生长抑制活性中是否涉及到金属螯合，用各种浓度的外源金属培养HT-29细胞5天，同时使用各种浓度的化合物3。被测试的外源金属是：ZnCl2(锌)、CuSO4·5H2O(铜)、FeCl2(铁II)、FeCl3·4H2O(铁III)、MgCl2(镁)和CaCl2·2H2O(钙)。在96-孔细胞培养板中，在100μl体积的生长培养基中接种HT-29细胞(4×103/孔)，并在37℃下培养过夜。除去培养基，并用含有如图5所示各种浓度的金属离子与化合物3或0.1％DMSO对照载体的总体积100μl的生长培养基置换。在37℃下培养细胞5天之后，使用XTT(3′-[1-(苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物)比色分析(Roche Applied Science，Penzberg，Germany)量化细胞生存。根据制造商的说明，将XTT标记试剂(1mg/mL)与电子偶联试剂混合，并将50μl混合物直接加到在100μl生长培养基中培养的细胞中。将培养板在37℃下进一步培养4小时，并使用多孔分光光度计(Bio-Tek Instruments Inc.)在460nm下测量各孔的吸光度。相对于空白校正数据，并表达成与DMSO对照相比较的细胞生长％。
结果表明，锌(图5A)、铜(图5B)削弱化合物3的生长抑制活性，铁(II)(图5C)以较小的程度削弱化合物3的生长抑制活性，而铁(III)(图5D)、镁(图5E)和钙(图5F)对化合物3的活性基本上没有影响。铜在低浓度化合物3(小于2μM)情况下削弱化合物3的生长抑制活性，而在高浓度化合物3(＞2.5μM)情况下增强化合物3的活性。没有金属对阴性对照化合物13的活性有任何影响，化合物13在结构上与化合物3密切相关，但在菲咯啉环中缺少必需的螯合氮(数据未显示)。这些结果表明，化合物3可以用作锌、铁(II)和铜的螯合剂，并且过量存在这些金属会阻断化合物3从必需的酶中螯合内源金属的能力。化合物3也表现出与铜形成细胞毒螯合配合物。
实施例17：外源金属对化合物5和化合物7体外抑制HT-29结肠癌细胞生长的能力的影响
为确定化合物5和化合物7螯合细胞中金属的能力，将外源金属加到HT-29细胞中，同时将各种浓度的化合物5和化合物7加到HT-29细胞中。简言之，用各种浓度的化合物5和化合物7、加上或减去铜(25μMCuSO4·5H2O)或锌(100μM ZnCl2)处理HT-29细胞5天。通过XTT分析测定细胞生存。对于化合物5，铜和锌对HT-29细胞生长抑制的影响示于图6A，对于化合物7示于图6B。与化合物3相似，锌削弱化合物5和化合物7的生长抑制活性，而铜仅在低浓度的化合物5和化合物7的情况下削弱活性。结果表明，化合物5和化合物7可以用作锌和铜的螯合剂，并且过量存在这些金属会阻断化合物5和化合物7的生长抑制性效果。
实施例18：化合物3和化合物9对于癌细胞的选择性
为确定与正常细胞的增殖相比，式I的化合物是否选择性地抑制癌细胞的增殖，在正常细胞系和癌细胞系中测量化合物3和化合物9增殖的IC90值。使用的正常细胞系是PrEC(***)、HMEC(乳腺)和WI38(肺纤维原细胞)细胞系，癌细胞系是DU145(***)、MDA-MB-435(乳腺)、HT-29(结肠)。还测定了作为对照的多柔比星和依托泊苷的IC90值。按照实施例13中记载的一般过程培养细胞。用各种浓度的化合物培养细胞6～7天，并使用XTT分析测量增殖细胞的数量。癌细胞选择性被计算作为所有正常细胞系的平均IC90与所有癌细胞系的平均IC90之比。化合物3和化合物9的IC90(正常/癌症)＞4，表明这些化合物对癌细胞有选择性。
表4：癌细胞选择性
  化合物   正常/癌症IC90之比
  多柔比星   5.6
  依托泊苷   ＞5.0
  化合物3   ＞4.3
  化合物9   ＞5.6
实施例19：化合物3抑制癌细胞中金属硫蛋白1A基因表达的能力
为确定式I的化合物是否可以螯合细胞中的锌，测定化合物3对人结肠癌HT-29细胞中锌调控的基因金属硫蛋白1A(MT1A)的表达水平的影响。在100mm培养皿中，在10mL体积的生长培养基中接种HT-29细胞，1×106个细胞，并在37℃下培养过夜。除去培养基，并用含有35μM ZnCl2、1μM或4μM TPEN(NNNN-四(2-吡啶基-甲基)乙二胺)、或1μM或4μM化合物3、或0.1％DMSO对照载体的生长培养基置换。在培养16小时之后，通过胰蛋白酶消化分离细胞，离心收集，并用PBS洗涤一次。根据制造商的说明，通过使用TRIZOL(Invitrogen，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)提取总RNA，并使用下述比较CT法通过实时PCR测量MT1A mRNA的水平。根据制造商的方案，使用pd(N)6随机六聚体(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)和SuperscriptTM II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)，在Biometra Tpersonal Thermal Cycler(Abgene，UK)中从200ng总RNA合成第一链cDNA。在ABI Prism 7000型序列检测***(Applied Biosystems Inc.，ABI，Foster City，CA)中，使用通过上述方法合成的5μL cDNA进行实时PCR，然后按照ABI
Figure A20068002337701001
UniversalPCR混合试剂方案进行
Figure A20068002337701002
基因表达分析(ABI)。
图7显示出向HT-29细胞中加入锌(35μM)增加MT1A基因的表达，而加入特异性的锌螯合剂TPEN会降低MT1A的表达。化合物3使MT1A的表达下降超过50％，表明化合物3能够降低易变化的细胞内锌的量。因此，化合物3可以用作细胞中锌的螯合剂。
实施例20：化合物3体外调节HT-29细胞中KLF4mRNA表达的能力
式I化合物体外调节过渡金属调控的肿瘤抑制基因的mRNA水平的能力测定如下。测试化合物3，以确定其增加锌调控的肿瘤抑制剂KLF4mRNA在结肠癌HT-29细胞中表达的能力。之前已经显示KLF4的表达可以通过改变细胞内锌的浓度来诱导。使用DMSO作为对照载体、35μMZnCl2、1μM或4μM化合物3培养HT-29细胞16小时，或使用1μM或4μM TPEN培养16小时，并按照实施例19所述，从细胞提取mRNA。使用按实施例19所述的比较CT法，通过实时聚合酶链反应分析KLF4mRNA的表达。与仅用载体处理的HT-29细胞相比，化合物3诱导KLF4mRNA在HT-29细胞中的表达(约8倍)(参见图8)。
实施例21：化合物3体外调节HT-29细胞中KLF4蛋白表达的能力式I化合物增加KLF4蛋白的表达的能力测定如下。用对照载体(DMSO)、TPEN(4μM)、ZnCl2(100μM)或化合物3(2.5、5、7.5和10μM)处理HT-29细胞16小时。裂解细胞，并用抗-KLF4抗体或GAPDH抗体进行Western印迹，以确保等量的蛋白上样。如图9所示，在处理16小时之后，化合物3能够增大KLF4蛋白在HT-29细胞中的水平。
实施例22：化合物3对周期素依赖性激酶抑制剂p21表达的影响
式I化合物对受KLF4调控的基因表达的影响测定如下。测试化合物3，以确定其增加细胞周期调控剂p21(周期素依赖性激酶抑制剂)在HT-29结肠癌细胞中表达的能力。已经显示肿瘤抑制剂KLF4通过抑制p21而介导细胞周期抑制。用DMSO(对照载体)、35μM ZnCl2、1μM或4μM TPEN、或0.5μM，1μM，4μM，或7.5μM化合物3培养HT-29细胞16小时，从细胞提取mRNA。使用比较CT法，通过实时聚合酶链反应分析p21mRNA的表达。使用实施例19所述的方法进行该分析。与仅用载体处理的HT-29细胞相比，化合物3诱导p21在HT-29细胞中的表达(30～60倍)(参见图10)。
实施例23：化合物3体外阻断HT-29和CCRF-CEM细胞中的细胞周期进程的能力
为测试式I化合物阻断细胞周期进程的能力，用化合物3培养人结肠癌HT-29或人白血病CCRF-CEM细胞，使用流式细胞分析确定在细胞周期的不同阶段细胞群体的变化。按照实施例13保持HT-29细胞。在本实施例和后面实施例中使用的CCRF-CEM细胞在37℃下、在5％CO2-加湿培养器中保持为生长培养基中的悬浮细胞，所述生长培养基是用2mM L-谷氨酰胺(Gibco，Grand Island，NY)、10％胎牛血清(FBS)(Multicell，WISENT Inc.St-Bruno，QC)、抗生素-抗真菌剂(Multicell)补充的RPMI-1640培养基(Sigma，St.Louis，MO)。
分析进行如下。对于HT-29细胞，在100mm培养皿中，在10mL体积的生长培养基中接种1×106个细胞。对于CCRF-CEM细胞，在25cm2烧瓶中，在10mL体积的生长培养基中接种3×106个细胞。16小时后，加入含有如图11所示浓度的化合物3(对于HT-29细胞，0.5μM、1μM或5μM，对于CCRF-CEM细胞，0.25μM、0.5μM或1μM)或0.1％DMSO对照载体的生长培养基。24小时后，通过胰蛋白酶消化分离HT-29细胞。在2000rpm下分别离心4min，收集两种类型的细胞，用PBS洗涤一次，并在70％乙醇中在-20℃下固定至少4小时。在1500rpm下使固定的细胞离心3min，用含有2％FBS的冷PBS洗涤一次，用3mg/mL核糖核酸酶(Sigma)和50μg/mL碘化丙啶(Sigma)在37℃下处理30min。使用FACScan流式细胞仪和Cell Quest程序(BD Biosciences，San Jose，CA)分析染色细胞的荧光。使用Modfit软件(Verity software House，Topsham，ME)评价数据。通过流式细胞图的门分析(gate analysis)确定各值。图11A和11B显示在除去双联体细胞后总细胞群的百分比。
结果表明，使用化合物3处理两种细胞系(图11A和11B)，使得细胞百分比在G1阶段剂量依赖性增加，而在S和G2/M阶段细胞百分比减小，表明化合物3诱导在细胞周期进程中G1阶段的阻断。
实施例24：化合物3体外诱导CCRF-CEM和MOLT4白血病细胞中的细胞凋亡的能力
通过测定化合物3对用载体(DMSO)，0.1μM、0.25μM、0.5μM或1μM化合物3处理24小时的CCRF-CEM白血病细胞群的影响，测量化合物3改变细胞凋亡不同阶段的细胞群的能力。接种CCRF-CEM细胞，并按照实施例23所述，用上述浓度的化合物3或0.1％DMSO对照载体处理CCRF-CEM细胞。24小时后，离心收集细胞，并重悬于生长培养基中，大约1×106个细胞/mL。然后使用annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(OncogeneTM研究产品，MA)并根据制造商的RAPID Annexin V结合方案，用annexin V结合和PI染色使细胞染色。使用FACScan流式细胞仪和Cell Quest程序(BD Biosciences，San Jose，CA)分析染色细胞的荧光。使用Modfit软件(Verity software House，Topsham，ME)评价数据，产生象限统计。仅有用Annexin V染色的细胞被认为是早期细胞凋亡，而同时用Annexin V和碘化丙啶染色的细胞被认为是晚期细胞凋亡。仅用碘化丙啶染色的细胞是非存活的细胞，而未染色表明是存活的细胞。相似地处理MOLT-4白血病细胞。
增大化合物3的浓度导致早期和晚期凋亡的细胞数量增大，而使存活的细胞减少(图12)。仅在高浓度的化合物3(1.0μM)情况下，观察到非存活的细胞增加。使用MOLT4白血病细胞得到相似结果(数据未显示)。因此，化合物3能够诱导细胞发生细胞凋亡。
实施例25：化合物3在中空纤维分析中的体内功效
通过测定化合物3在中空纤维分析中的功效，测试式I化合物的体内功效。该分析记载在Decker等人，Eur.J.of Caner 40：821-826(2004)中，并通过将12个人肿瘤细胞系(乳腺：MDA-MB-231、MDA-MB-435。神经胶质瘤：U251、SF-295。卵巢：OVCAR-3、OVCAR-5。结肠：COLO-205、SW-620。黑素瘤：LOX-IMVI、UACC-62。肺：NCI-H23、NCI-H522)按下述移植进无胸腺小鼠中。在含有10％FBS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640中培养细胞培养物。通过标准胰蛋白酶消化收集细胞，重悬(2-10×106个细胞m/L)，并倒入1mm内径的(I.D.)聚偏二乙烯中空纤维(MW500,000Da.的除外)中。在移植之前，与PVDF纤维粘附的培养物在37℃下、在5％CO2中培养24～48小时。每只小鼠共接受六次移植，3根纤维置于腹膜中，3根纤维置于皮下包埋中，每只小鼠共3个细胞系；每组3只小鼠，6只仅用载体处理的对照小鼠。以两种不同的剂量和两种途径(I.P.和S.C)对药物进行测试，治疗4天。移植后6-8天收集纤维，并通过MTT法评价细胞的生存；与对照相比，如果生长降低50％或更大，则认为试剂具有作用。通过与移植物中的初始生存相比细胞生存的降低，评价细胞杀死作用。通过受抑制的细胞系的数目(即12)×2个位点×2个化合物剂量×2个因子＝最大96，对结果评分。总分为20、SC分值为8或一种或多种细胞系的净细胞杀死的化合物被认为是阳性的。
所得结果表明，化合物3的IP分值为22，SC分值为10，总分值等于32，为阳性的细胞杀死作用，如表5所示。这些研究证实，化合物3在体内可有效地杀死几种类型的肿瘤细胞。
表5：化合物3的体内癌细胞生长抑制
  ip分   SC分   总分   净细胞杀死
  目标分   12   8   20   一种或多种
 化合物3   22   10   32   一种或多种
实施例26：化合物3在结肠癌异种移植模型中的体内功效化合物3体内抑制结肠肿瘤生长的能力测试如下。用人结肠腺癌细胞HT-29细胞(0.1mL PBS中3×106个细胞)腹腔注射CD-1雌性裸鼠(7只小鼠/治疗组，6-7周龄)。接种后5天开始用载体或50mg/kg/d化合物3治疗小鼠(肿瘤大小＝20-40mm3)，7天(治疗5天，然后中止2天)为一周期，持续5周。在实验过程中使用测径器测量肿瘤大小，并在处死动物后测量肿瘤重量。通过测量肿瘤大小和重量，与载体处理的对照动物相比，化合物3能够抑制肿瘤生长(参见图13A和图13B)。
实施例27：化合物3在大细胞肺癌异种移植模型中的体内功效
通过测定化合物3在异种移植模型中的功效，测试式I化合物体内抑制大细胞肺肿瘤生长的能力，如下所述。作为具有以下组成的基于脂质的制剂来测试化合物3：二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG/5％mol)和卵磷脂(ePC/95％mol)。制剂按照如下进行制备：在DMF中制备化合物3和脂质(ePC和DSPE-PEG)的贮备溶液。然后混合特定体积的化合物3和脂质的贮备溶液，以使最终脂质浓度为25mg/mL(ePC∶DSPE-PEG＝95∶5(mol％))，并且化合物3与总脂质之比为1∶10(w/w)。将混合物搅拌4小时，在氮气中充分干燥，真空下放置过夜。然后加入升温至60℃的HEPES缓冲盐水(HBS 0.01M，pH＝7.4)，以使干燥的薄膜再次水合。使溶液涡旋混合，在室温下搅拌48小时，并用超声波处理2.5小时。然后在1000rpm下使制剂离心5分钟，除去任何游离的化合物3。
用人肺NCI-H460细胞(0.1mL PBS中3×106个细胞)皮下腹腔注射CD-1雌性裸鼠(6-7周龄，7小鼠/治疗组)。接种后5天开始用载体或化合物3治疗小鼠(肿瘤大小＝20-40mm3)，7天(治疗5天，然后中止2天)为一周期，持续实验时间(35天)。第一周用80mg/kg/d治疗小鼠，然后用40mg/kg/d，直到实验结束。在实验过程中使用测径器测量肿瘤大小，并在处死动物后测量肿瘤重量。通过测量肿瘤大小和重量，与载体处理的对照动物相比，化合物3能够抑制肿瘤生长(参见图14A和图14B)。
实施例28：化合物3、化合物5和化合物7在结肠癌异种移植模型中的体内功效
按实施例26所述，测试化合物3、化合物5和化合物7在小鼠异种移植模型中体内抑制结肠癌细胞生长的能力。作为Lutrol制剂(腹腔注射给予)、基于脂质的制剂胶束(静脉注射给予)或基于水的制剂(腹腔注射给予)来测试化合物。对照载体包括Lutrol对照(腹腔注射给予)、脂质胶束对照(静脉注射给予)和水对照(腹腔注射给予)。Lutrol制剂含有15％Lutrol和10％DMSO。基于脂质的制剂的组成和其制备记载在上面的实施例27中。
结果(图15)表明，这些化合物能够降低源于HT-29细胞的肿瘤的大小(图15A)和重量(图15B)。
实施例29：化合物3、化合物5和化合物7在大细胞肺癌异种移植模型中的体内功效
按实施例27所述，测试化合物3、化合物5和化合物7在小鼠异种移植模型中体内抑制大细胞肺癌细胞生长的能力。作为Lutrol制剂(腹腔注射给予)、基于脂质的制剂胶束(静脉注射给予)或基于水的制剂(腹腔注射给予)来测试化合物。对照载体包括Lutrol对照(腹腔注射给予)、脂质胶束对照(静脉注射给予)和水对照(腹腔注射给予)。Lutrol制剂含有15％Lutrol和10％DMSO。基于脂质的制剂的组成和其制备记载在上面的实施例27中。
结果(图16)表明，化合物3、化合物5和化合物7能够降低源于NCI-H460细胞的肿瘤的大小(图16A)和重量(图16B)。
实施例30：化合物3体内调节KLF4表达的能力
化合物3调节KLF4在HT-29结肠肿瘤异种移植物中的表达的能力测定如下。用人结肠腺癌细胞HT-29细胞(0.1mL PBS中3×106个细胞)皮下在10只CD-1雌性裸鼠(6-7周龄)组的下中背部进行注射。接种后5天开始用载体或50mg/kg/d化合物3治疗小鼠(肿瘤大小＝20-40mm3)，治疗5天，然后中止2天为一周期，持续实验时间(35天)。在治疗期之后，处死动物，切除肿瘤，并使用Rneasy Mini试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)从30mg肿瘤组织提取总RNA。按照实施例19所述，使用比较CT法通过实时聚合酶链反应分析KLF4 mRNA的表达。与仅用载体处理的肿瘤异种移植物相比，在用化合物3治疗的所有小鼠的肿瘤异种移植物中，化合物3诱导KLF4的表达约1.5倍(图17)。
实施例31：化合物3体内调节p21表达的能力
按照实施例26所述，使用HT-29结肠肿瘤异种移植模型测定化合物3体内调节p21表达的能力。按照实施例30所述，使用比较CT法通过实时聚合酶链反应分析来分析p21 mRNA的表达。与仅用载体处理的肿瘤异种移植物相比，化合物3诱导在用化合物3治疗的所有小鼠的肿瘤异种移植物中p21的表达(图18)。
实施例32：化合物3体内调节周期素D1的表达的能力
按照实施例26所述，使用HT-29结肠肿瘤异种移植模型测定化合物3调节周期素D1表达的能力。按照实施例30所述，通过实时聚合酶链反应分析周期素D1 mRNA的表达。与仅用载体处理的肿瘤异种移植物相比，化合物3始终降低在用化合物3治疗的小鼠的肿瘤异种移植物中周期素D1的表达(图19)。该实验的结果以及按照实施例30和31所述化合物3对KLF4和p21表达的体内作用的结果均示于图20。
实施例33：化合物的亚急性毒性试验
为测试式I化合物的亚急性毒性，用化合物注射雌性小鼠，并基于死亡率、行为、外观和重量的变化评价毒性。简言之，用100mg/kg和50mg/kg的各种化合物或仅用载体(Lutrol(M68，微粉化的))注射体重约0.020kg的ICR正常雌性小鼠(5-6周龄；n＝33)。注射3组ICR雌性小鼠，一组腹腔(i.p.)注射250μl各化合物，4.0mg/mL，每天两次(100mg/kg)，持续1周(组I)；或另一组腹腔(i.p.)注射250μl各化合物，2.0mg/mL，每天两次(50mg/kg)，持续1周(组II)；或再一组腹腔(i.p.)注射250μl Lutrol对照载体，每天两次，持续1周(对照组)。
制备待测试的化合物，提供浓度4.0mg/mL和2.0mg/mL足用1周的量。简言之，将50mg各化合物溶解在1.25mL 100％DMSO中，并用6.25mL Lutrol(水中浓度为30％)和5mL水稀释，制备在水中浓度为15％Lutrol中的4mg/mL的化合物溶液。接下来，将4mL各制得的溶液进一步用4mL水中浓度为15％的Lutrol稀释，得到各化合物的2.0mg/mL溶液。对于对照载体溶液，制备8mL水中浓度为15％的Lutrol。如上所述给予浓度4.0mg/mL和2.0mg/mL的化合物及对照载体。基于死亡率、行为、外观和重量的变化评价毒性，并示于表6。
表6：亚急性毒性试验
Figure A20068002337701081
实施例34：化合物3在HT-29细胞中的体外亚细胞定位
式I化合物在癌细胞中的亚细胞定位测定如下。由于化合物3自身具有荧光性，因此可以通过荧光显微镜法在HT-29结肠癌细胞中检测其在癌细胞中的亚细胞定位。用10或25μM化合物3处理细胞5分钟(图21A)或4小时(图21B和图21C)，在PBS中洗涤一次，在3.7％甲醛/PBS中固定10分钟，再洗涤三次，并用Cytoseal封固。使用Zeiss激光扫描荧光显微镜得到图像，激发滤波范围在360-370nm。结果示于图21A-C。对于图21A和图21B，用荧光图像覆盖微分干涉差图像。图21B和图21C是同一图像。化合物3在处理5分钟内进入细胞，并在细胞核和细胞质内均匀分布，但排除在HT-29细胞的质膜之外(图21A)。经4小时处理，化合物3主要位于细胞核外部的周围(核周区)，但一部分仍位于细胞核内(图21B和图21C)。
实施例35：式I化合物体外切割DNA的能力
测试化合物3在铜和还原剂抗坏血酸存在下体外切割质粒DNA的能力。在含有10mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH6.7)、1μg超螺旋质粒DNA、100μM抗坏血酸、25μM药物化合物(或载体)和10μM CuSO4·5H2O的总量20μl中进行实验。反应混合物在37℃下培养30分钟，加入1μl0.1M EDTA，以终止反应。加入DNA上样缓冲液，反应在含有溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶上在80V下进行80分钟。化合物3和阳性对照1，10-菲咯啉(OP)均能切割质粒DNA，从而将超螺旋和开环形式转化成低分子量的DNA片段。非螯合化合物13和对照载体DMSO不能切割DNA(图22A)。在没有铜或还原剂存在下，化合物3或OP均不能切割DNA。
为确定除铜之外的离子是否可以起作用，还在锌或铁存在下进行DNA切割反应。在25μM CuSO4·5H2O、ZnCl2或FeCl2·4H2O存在下按上述进行反应。在用化合物3的切割反应中，锌或铁均不能代替铜(图22B)。应注意到，在抗坏血酸存在下，仅有铜可以改变超螺旋DNA与开环形DNA之比。
为确定使化合物3有效的化合物与铜之比，进行图22A中的反应。通过将Cu的浓度保持10μM不变并改变化合物3的浓度，获得如图23所示的化合物3与铜之比3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1和1∶1。通过将化合物3的浓度保持10μM不变并改变铜的浓度，获得化合物3与Cu之比1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3。当化合物3与铜之比大于1.5∶1时，其能有效地切割DNA，而在比例为1∶1、1∶2、1∶2.5时不能进行切割。然而，在1∶3比例时化合物3能够进行切割(图22C)。这些结果有助于提供关于形成何种类型的铜-化合物3配合物以及哪一种是最具细胞毒性的配合物的指示。
还测试了其他式I化合物(化合物5、化合物7、化合物9和化合物13)在与铜之比为2.5∶1时切割DNA的能力(图23)。如同化合物3与铜之比，以及在没有化合物3存在下的铜浓度用在上述的DNA切割分析中。显示化合物9和化合物12也能切割DNA。
实施例36：式I化合物在HT-29结肠癌细胞中的体外抗增殖活性
按上面实施例13所述，测试式I化合物抑制人结肠癌HT-29细胞增殖的能力。该实验的结果示于表7。
表7：式I化合物的抗增殖活性
Figure A20068002337701111
Figure A20068002337701121
Figure A20068002337701131
Figure A20068002337701141
Figure A20068002337701151
Figure A20068002337701161
Figure A20068002337701171
Figure A20068002337701181
Figure A20068002337701191
实施例37：式I化合物的体外和体内作用
金属转录因子-1(MTF-1)是一种组成型表达的转录因子，其经锌活化，通过结合金属应答元件调控靶基因。MTF-1在快速增殖肿瘤细胞的缺氧微环境中的活化、其后的缺氧症-诱导的氧化应激和释放细胞内保存的锌与肿瘤发展和进展相关。Krüppel-样因子4(KLF4)是Sp/KLF家族转录因子的成员，其通过结合GC-盒和CACCC盒的DNA序列调控靶基因。KLF4是一种细胞生长的负调控剂，通过诸如经抵消结合周期素D1启动子的正调控剂Sp1而活化p21waf1/cip1和抑制周期素D1的表达等机制起作用。已经识别出了KLF4在T-细胞白血病、胃肠癌、膀胱癌和***癌中的肿瘤抑制剂作用。MTF-1、Sp1和KLF4的自动调控是KLF4的上游正调控剂。已经研究了一系列下调MTF-1的新的小分子，并且已经筛选出它们的体外和体内抗肿瘤活性。如图24所示，通过基于配体的结构设计，从超过3000种咪唑-菲咯啉结构选择式I的化合物。
利用前述实施例中所述的方法，分析式I化合物对体外和体内细胞生长抑制的影响。如实施例12所示，通过National Cancer Institute(国家癌症研究所)60-细胞系分析，筛选母体化合物3的细胞生长抑制，白血病、非小细胞癌症、结肠癌、肾癌和***癌组对化合物3特别敏感。如图2所示，被测试的所有细胞系的平均GI50为0.62μM。
如实施例25所示，通过National Cancer Institute中空纤维分析，体内筛选化合物3的细胞生长抑制。总分为20或更大，其中至少皮下分值为8或者任何细胞系的细胞杀死，被认为是显著活性的抗癌化合物。如上面的表5所示，化合物3的总分为32，其中皮下分值为10，并且表现出阳性细胞杀死。
在癌细胞增殖分析中体外观察以及在中空纤维分析和小鼠肿瘤异种移植模型中体内观察式I化合物在不同癌细胞类型中的肿瘤细胞生长抑制。
实施例38：式I化合物在人癌细胞系中体外调节细胞生长抑制和KLF4基因表达的能力
通过XTT细胞增殖分析对各种癌细胞类型进行式I化合物的细胞生长抑制IC50(μM)测试。如表8所示，在不同类型的癌症中观察到较低的或亚微摩尔的IC50。由Lorus Therapeutics Inc.再现下示的式I化合物对黑素瘤细胞系SK-MEL-2的生长抑制作用。
如下表8所示，式I化合物在乳腺癌细胞系MDA-MB-435中的IC50值为0.2μM～0.6μM。
通过RT-PCR，针对各种癌细胞类型检测式I化合物诱导的KLF4的基因表达水平。相对于在对照载体处理的各细胞类型的细胞中KLF4表达作为“1”，表示KLF4在化合物处理的细胞中的倍数变化。表8还显示，在不同类型的癌症中观察到KLF4表达增加。基因表达研究揭示出，与其他乳腺肿瘤细胞系相比，乳腺癌细胞系MDA-MB-435的基因表达谱更象黑素瘤细胞系的基因表达谱(Ross等人(2000)Nat Genet 24(3)：227-233)。此外，被移植进雌性SCID小鼠的乳腺脂肪垫中的MDA-MB-435的异种移植物显示出与黑素细胞一致的免疫组织化学染色(Ellison G，Klinowska T，Westwood RF，Docter E，French T，Fox JC.(2002)Mol Pathol.55(5)：294-299)。预期乳腺癌细胞系MDA-MB-435发挥不同于其他乳腺癌细胞系的功能。
Figure A20068002337701221
实施例39：式I化合物在大细胞肺癌和结肠癌异种移植模型中的体内功效
式I化合物在小鼠异种移植模型中的肿瘤生长抑制示于图25。非小细胞肺癌(H460)的给予途径和方案研究(图25A)，结肠腺癌(HT-29)的给予途径和方案研究(图25B)，非小细胞肺癌(H460)的最小有效量(图25C)，优化的式I化合物在非小细胞肺癌(H460)中的功效(图25D)。
实施例40：外源金属对化合物3体外抑制HT-29细胞生长的能力的影响
缺锌诱导的细胞生长抑制示于图26。通过XTT细胞增殖分析检测补充金属离子对化合物3介导的HT-29细胞的细胞生长抑制的影响。如图26A和图26B所示，仅有锌完全逆转了细胞生长抑制。
实施例41：化合物3和化合物7体外阻断HT-29细胞中细胞周期进程的能力
在图27A中，通过在使用化合物3处理的HT-29细胞中的流式细胞术进行细胞周期分析，在图27B中使用化合物7。在处理后观察G1/S阶段的细胞周期停滞。
实施例42：式I化合物体外螯合金属的能力
化合物3和化合物7的金属螯合性能示于图28。体外4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)金属结合分析表明，化合物3减少了结合于PAR的Zn+2和Cu+2，这表明化合物3的体外螯合Zn+2和Cu+2的性能。结果示于图28A(ZnCl2)、图28B(CuCl2)和图28C(FeCl2)。体外4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)锌结合分析进行如下：在96-孔板(Sarstedt，Newton，NC)的三分之一孔中，用10μL 80％乙腈-20％DMSO对照载体或溶解在80％乙腈-20％DMSO中的所示最终浓度的式I化合物，将在0.2M Tris-HCl，pH7.5中的10μL体积所示最终浓度的ZnCl2在室温下培养15min。然后，加入在0.2M Tris-HCl，pH7.5中的80μL最终浓度200μM的PAR，使用多孔分光光度计(Bio-Tek Instruments Inc.)在500nm下测量PAR-Zn2+配合物的显色。
实施例43：化合物3体外调节金属敏感性基因在HT-29细胞中表达的能力
如图29A、图29B和图29C所示，通过RT-PCR检测与各种金属特异性螯合剂相比，金属敏感性基因在HT-29细胞中的表达变化。测量化合物3和化合物7处理对锌保存蛋白金属硫蛋白1A(MT1A)表达(图29A)、铜转运子Ctrl(也称作SLC31A1)表达(图29B)和铁转运子(转铁蛋白受体1，(TfR1))表达(图29C)的影响，并分别与已知的锌螯合剂TPEN、铜螯合剂四胺和铁螯合剂DFO作比较。尽管体外螯合Cu+2，但是在化合物3处理后铜敏感性基因的增加是瞬时的。相比而言，锌敏感性基因的持续降低表明，细胞内缺锌是化合物3处理后的明显结果。
实施例44：式I化合物体内调节MTF-1和周期素D1表达的能力
在HT-29结肠癌异种移植组织中，锌敏感性转录因子MTF-1和细胞周期调控剂周期素D1表达之间的相关性示于图30。基于在周期素D1基因启动子区中存在推定的结合MTF-1的DNA序列(图30A示出)，通过RT-PCR，使用组织RNA提取物，检测MTF-1和周期素D1在异种移植组织中的表达水平。如图30B所示，使用化合物3，使MTF-1表达降低与周期素D1表达降低相关，在图30C中使用化合物7。
实施例45：化合物3体外调节MTF-1和周期素D1表达的能力
在HT-29细胞中的MTF-1和周期素D1基因表达之间的相关性示于图31。在化合物3处理后观察到，通过RT-PCR测量的MTF-1(图31A)和周期素D1(图31B)的表达呈时间依赖性地降低。在siRNA使MTF-1基因抑制后观察到周期素D1(图31D)表达降低。在siRNA使MTF-1基因抑制后的MTF-1水平示于图31C。
式I化合物使MTF-1的表达和活性下降。MTF-1的下调与周期素D1表达降低相关。
实施例46：化合物3体外调节KLF4结合活性的能力
造成诱导肿瘤抑制剂KLF4的MTF-1表达降低示于图32。基于KLF4基因启动子区上的重叠转录因子结合位点(如图32A所示)，MTF-1结合可能有助于增大其他KLF4诱导子Sp1和KLF4的结合。通过电泳迁移率分析(EMSA)显示出源于HT-29细胞核提取物的Sp1(图32B)和KLF4(图32C)的DNA结合活性增加。
电泳迁移率分析(EMSA)进行如下：使用核提取试剂盒(Panomics，Redwood City，CA)，从HT-29细胞(在每个实验组中，在100mm培养皿中有107个细胞)制备核提取物。根据制造商的说明，使用KLF4和Sp1EMSA“Gel-Shift”试剂盒(Panomics)进行EMSA分析。简言之，每个结合反应使用5μg核提取物。在结合反应进行30min之后，在4℃、120V下，在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离样品，并转移到BrightStarTM-Plus带正电荷的尼龙膜上。使用ECL检测***(Panomics)目视观察膜上的生物素标记的探针。
MTF-1活性降低有利于正调控剂Sp1和KLF4自动调控诱导KLF4。
实施例47：化合物3体外调节KLF4结合至周期素D1启动子的能力
KLF4表达增加造成周期素D1在HT-29细胞中抑制示于图33。基于在周期素D1基因启动子区上重叠的转录因子结合位点(图33A)，负调控剂KLF4结合的增大可以代替正调控剂Sp1的结合。通过染色质免疫沉淀分析(ChIP)显示KLF4和Sp1体内结合至周期素D1启动子(图33B)。在化合物3处理后观察到KLF4结合的增大和Sp1结合的下降。
染色质免疫沉淀反应(ChIP)进行如下。在所示实验结束时，从HT-29细胞(在每个实验组中，在三个15cm-培养板中的5.5×105个细胞)制备细胞裂解物，根据制造商的说明，使用抗-KLF4和抗-Sp1抗体(Santa CruzBiotechnology Inc.)和ChIP-ITTM试剂盒(Active Motif，Carlsbad，CA)进行ChIP分析。在Invitrogen合成包括周期素D1启动子的-231至-92区的引物；5′引物(5′-CGGACTACAGGGGCAA-3′)[SEQ ID NO：1]和3′引物(5′-GCTCCAGGACTTTGCA-3′)[SEQ ID NO：2]。
KLF4(负调控剂)结合至周期素D1启动子的增加抑制Sp1(正调控剂)结合以及抑制周期素D1表达。
实施例48：化合物3在HT-29细胞中体外抑制细胞生长和调节KLF4表达的能力
在HT-29细胞生长中KLF4表达的重要性示于图34。通过RT-PCR测量的KLF4基因表达表明，siRNA使KLF4基因有效地抑制(图34A)。通过XTT分析测量的细胞增殖表明，在siRNA使KLF4基因抑制后，化合物3介导的细胞生长抑制作用降低(图34B)。
小干扰RNA(siRNA)转染进行如下。使用预设计的MTF-1siRNA(ID#115734)(Ambion，Austin，TX)抑制内源MTF-1mRNA。相似地，使用预设计的KLF4siRNA(ID#115492)(Ambion，Austin，TX)抑制内源KLF4mRNA。基于不相干的基因序列，在Qiagen(Cambridge，MA)合成非特异性的双链RNA
(5′r(CUAGGGUAGACGAUGAGAG)d(TT)3′)[SEQ ID NO：3]和
(3′d(TT)r(GAUCCCAUCUGCUACUCUC)5′)[SEQ ID NO：4]。
根据制造商的说明，使用LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen)，用所示浓度的siRNA或零乱的RNA对照使HT-29细胞(在35mm-培养皿中3×105个细胞)转染6小时。在培养结束时，用完全的生长培养基补充转染培养基，并在所示实验之前，将细胞在37℃下培养24小时。
实施例49：式I化合物对人大细胞肺癌(H460)在CD-1裸鼠中生长的影响
按上面实施例所述，进行式I化合物在人大细胞肺癌(H460)的小鼠异种移植模型中的肿瘤生长抑制。结果示于图35。
实施例50：式I化合物对锌离子的体外螯合作用
为确定化合物3与锌离子的体外螯合性能，使用锌敏感性荧光染料Zinquin，然后用不同浓度的化合物3预培养ZnCl2，通过荧光光度法测量游离的锌离子(图36)。用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中所示浓度的化合物3培养ZnCl2 2μM，然后加入Zinquin，以10μM最终浓度培养30min。在Fluoroskan Ascent发光荧光光度计中，在364nm激发波长和485nm发射波长下，测量经锌结合的Zinquin荧光。
观察到Zinquin荧光呈剂量依赖性地降低，表明由于化合物3与锌离子螯合，使得结合至Zinquin的锌离子减少。使用FeCl2和CuSO4进行相似实验，没有表现出Zinquin荧光，表明Zinquin荧光仅对于锌离子有特异性。
实施例51：用式I的化合物处理后，细胞内锌离子在HT-29细胞中的体外螯合作用
为确定化合物3与细胞内锌离子的螯合性能，用化合物3、已知的锌螯合剂TPEN或对照载体(DMSO)处理预加载或未预加载35μM ZnCl2的HT-29细胞，并通过按前述实施例所述测量Zinquin荧光来测定细胞内的游离锌(图37)。在37℃下，用35μM ZnCl2预处理HT-29细胞(4×105个细胞/组)20min，然后加入所示浓度的化合物3或TPEN和10μMZinquin处理30min，并测量荧光计数(图37A)。为测量HT-29细胞中内源锌离子的螯合作用，在37℃下，用所示浓度的化合物3和10μMZinquin处理HT-29细胞(1.5×106个细胞/组)30min，并测量荧光计数(图37B)。
在化合物3或TPEN处理后，观察到预加载的锌和内源锌的水平均呈剂量依赖性地降低。
实施例52：式I化合物对HT-29细胞中的锌螯合作用和金属硫蛋白1A基因表达的体外影响
为证实化合物3处理后细胞内锌水平的降低，测量作为细胞内锌状态标记物的锌保存蛋白金属硫蛋白1A(MT1A)的基因表达变化。
用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间，MT1A基因表达测量如下。使用TRIZOL法提取总RNA，并通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定基因表达水平。在同一样品中用β-肌动蛋白的基因表达使MT1A基因表达归一化。相对于在各时间点DMSO对照的MT1A水平，表示MT1A的倍数变化。如图38A所示，在8小时处理后，MT1A基因表达显著降低。
为检验MT1A基因表达反映细胞内锌水平，用1μM化合物3、35μMZnCl2、或化合物3和ZnCl2一起处理HT-29细胞16小时(图38B)。通过上述RT-PCR测定MT1A基因表达。响应于ZnCl2处理的细胞中的细胞内锌离子增加，MT1A基因表达增加。在化合物3处理后，响应于细胞内缺锌，MT1A表达降低，通过补锌得以逆转(图38B)。
实施例53：式I化合物对HT-29细胞中的锌螯合作用和Krüppel--样因子4(KLF4)基因表达的体外影响
按下述通过RT-PCR测定经化合物3处理后缺锌的KLF4基因表达的变化。用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间(图39A)，或用1μM化合物3、35μM ZnCl2、或化合物3和ZnCl2一起处理HT-29细胞16小时(图39B)。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。
用1μM化合物3处理HT-29细胞4小时后，观察到KLF4呈时间依赖性地增加，最大增加在16小时(图39A)。通过补锌逆转KLF4基因表达增加(图39B)，表明响应于细胞内锌状态，KLF4基因表达发生显著变化。
实施例54：式I化合物对锌敏感性金属应答元件(MRE)-结合转录因子1(MTF-1)在HT-29细胞中的基因表达和DNA结合活性的体外影响
在用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间后，通过RT-PCR检测MTF-1的基因表达。用化合物3处理8小时后观察到MTF-1表达降低(图40A)。
为检验在培养早期MTF-1活性的变化，在MTF-1基因表达明显降低之前，按下述通过电泳迁移率分析(EMSA)测定在用化合物3处理4小时的HT-29细胞的核提取物中MTF-1核移位和DNA-结合活性(图40B)。用DMSO、35μM ZnCl2(阳性对照)和1μM化合物3处理HT-29细胞4小时。提取核蛋白，并用生物素-标记的MTF-1结合寡核苷酸探针培养。观察到经MTF-1结合的标记探针的延迟迁移率的条带迁移(图40B)。在泳道1(DMSO)中观察到三个迁移带(实心箭头)，表明MTF-1的组成型DNA结合谱。在锌处理组中，观察到两个额外的迁移带(空心箭头)(泳道3)，表明锌依赖性的MTF-1活性增加。在化合物3处理组中，没有观察到锌激活的迁移带(泳道5)，表明化合物3没有增加锌依赖性的MTF-1活性。泳道2、4和6中加入过量未标记的探针，以在核提取物中竞争与MTF-1结合的标记的探针，分别表明MTF-1-结合迁移带在泳道1、3和5中的特异性。
与阳性对照ZnCl2处理组中的迁移带相比，在化合物3处理的细胞中没有观察到迁移有明显变化，证实在化合物3处理后，锌依赖性的MTF-1活性没有增加。
实施例55：化合物3体外调节KLF4-对抗物Krüppel-样因子5(KLF5)在HT-29细胞中基因表达的能力
KLF4和KLF5是KLF家族转录因子中两种密切相关的成员，但是KLF5刺激细胞增殖，而KLF4抑制细胞生长(Ghaleb等人，(2005)Cell Res.15(2)：92-96)。KLF4和KLF5结合相似的富含GC的DNA共有序列，但表现出相反的转录活性。KLF4通过结合KLF4启动子中的GC富含区可以自动激活其自身基因，而KLF5通过结合相同的DNA元件抑制KLF4转录(Dang等人，(2002)Nucleic Acids Res.30(13)：2736-2741)。
为确认MTF-1表达/活性降低的原因，相对于KLF4的诱导，使用MTF-1-靶向的siRNA抑制MTF-1mRNA，并按下述通过RT-PCR测量MTF-1、KLF4和KLF5的基因表达。使用Lipofectamine 2000试剂，用100nM MTF-1siRNA转染HT-29细胞6小时。在用正常生长培养基代替转染培养基并培养18小时后，提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。在使用MTF-1基因特异性siRNA抑制MTF-1翻译后，观察到KLF5基因的表达下降，同时KLF4表达增加(图41A)。
还按照如下所述测定了用化合物3进行一定时间的处理后KLF5基因表达的降低。用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间(图41B)。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。与上述结果一致，在用1μM化合物3处理4小时后也检测到在HT-29细胞中KLF5基因表达降低(图41B)。
实施例56：在HT-29细胞中，化合物3体外调节细胞周期调控性蛋白p21基因和蛋白表达的能力
在用化合物3处理后检测p21基因和蛋白的表达。按下述在所示时间测定p21在用1μM化合物3处理的HT-29细胞中的基因表达。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平(图42A)。按下述通过ELISA测量p21蛋白在总细胞裂解产物中的水平(图42B)。用含有和不含有20μM MG-132(蛋白酶体抑制剂)的1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间。
通过RT-PCR观察到在用化合物3处理4小时后p21的基因表达增加(图42A)，但是通过Western印迹分析(数据未显示)或酶联免疫吸附分析(ELISA)均没有检测到p21蛋白表达显著增加(图42B)。然而，当在蛋白酶体抑制剂MG-132存在下用化合物3培养HT-29细胞时，p21蛋白水平增加，表明尽管p21基因表达显著增加，但p21蛋白快速降解。
实施例57：化合物3体外调节细胞周期调控性蛋白周期素D1的表达的能力
按下述通过RT-PCR和Western印迹测定用化合物3处理后周期素D 1的基因和蛋白表达，分别如图43A和图43B所示。用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。通过SDS-PAGE、然后通过Western印迹测定在HT-29细胞裂解产物中周期素D1蛋白的表达。
用化合物3处理8小时后，观察到周期素D1的基因(图43A)和蛋白(图43B)水平均降低。
实施例58：化合物3体外调节肿瘤抑制基因早期生长反应蛋白-1(Egr-1)的表达的能力
如同Sp1，Egr-1也是一种具有锌指DNA-结合域的转录因子，其识别靶基因的调控性启动子区中的GC富含序列(Al-Sarraj等人，(2005)J. Cell Biochem.94(1)：153-167)。按下述通过RT-PCR检测Egr-1基因表达在化合物3处理的HT-29细胞中的变化(图44A)。用1μM化合物3处理HT-29细胞所示时间。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。为确定补锌的作用，用1μM化合物3、35μM ZnCl2、或化合物3和ZnCl2一起处理HT-29细胞8小时。通过RT-PCR测定Egr-1基因表达(图44B)。
在用化合物3处理后2小时观察到Egr-1基因表达明显增加，如图44A所示，并且经补锌可以逆转，如图44B所示。
实施例59：化合物3和化合物7体外调节在HT-29细胞中的基因表达的能力
按下述通过RT-PCR检测响应于化合物3和化合物7的基因表达谱(图45)。用1μM化合物3或化合物7处理HT-29细胞8小时。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。观察到相关基因的相似表达谱。
实施例60：化合物3调节KLF4和周期素D1在HT-29结肠癌异种移植模型中的基因表达的能力
为检测化合物3介导的KLF4和周期素D1表达的变化的体内影响，通过RT-PCR分析各基因在对照载体(Lutrol)的异种移植组织中和在化合物3处理的HT-29结肠癌细胞移植的小鼠中的表达(图46)。简言之，用化合物3处理14天后的KLF4和周期素D1在HT-29异种移植组织中的基因表达测量如下。用对照载体(腹腔注射)或100mg/kg化合物3(腹腔注射)处理皮下移植HT-29细胞的小鼠14天(每组中n＝6)。提取总RNA，并通过RT-PCR测定基因表达水平。在同一样品中用β-肌动蛋白的基因表达使KLF4和周期素D1基因表达归一化。相对于用Lutrol处理的6只对照小鼠的各基因表达平均水平，表示KLF4和周期素D1的倍数变化。
与HT-29细胞系中体外的表达谱一致，体内观察到KLF4基因表达增加和周期素D1基因表达降低(图46)。
实施例61：化合物3从锌保存蛋白金属硫蛋白体外螯合锌的能力
细胞内锌以可变池存在，与保存蛋白金属硫蛋白(MT)松散结合，其保存达到7或8个锌/分子。可变锌池将锌给予酶或转录因子，为发挥全部活性它们需要与锌可逆结合(Tapiero和Tew(2003)Biomed Pharmacother 57(9)：399-411)。研究化合物3从MT除去锌的效率。可以从Alexis Biochemicals(Lausen，Switzerland)购得从兔肝分离的MT-1，在≥95％的MT中主要含有MT-1a和MT-2e且～7个锌/分子。按前述实施例所述，使用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)比色锌分析，体外测量MT中的锌含量。在500nm下，测量在PAR-锌离子配合物形成后的PAR的吸光度变化(Dinkova-Kostova等人，(2005)Biochemistry 44(18)：6889-6899)。为确定化合物3对MT-1的锌的体外螯合作用，将在100mL体积0.2MTris-HCl，pH7.5中的MT-125μM加到96-孔板中。在室温下，将在80％乙腈/20％DMSO中的化合物3(0.15～60μM)加到MT-1中，保持15min。加入PAR(200μM，在0.2M Tris-HCl，pH7.5中)，并使用多孔分光光度计在500nm下测量PAR-锌配合物的显色，如图47所示。
在用剂量增加的化合物3体外处理后观察到25μM MT的PAR吸光度呈剂量依赖性地降低(图47)，证实化合物3从细胞内可变锌池除去锌。
实施例62：化合物3体外影响MTF-1DNA结合活性的能力
研究化合物3使含有锌指的转录因子金属应答元件(MRE)结合转录因子(MTF-1)的DNA-结合活性失活的效率。MTF-1的核移位以及MTF-1最大结合至MRE需要锌可逆结合至MTF-1的活化锌指(Lichtlen和Schaffner(2001)Bioessays 23(11)：1010-1017)。
用35μM ZnCl2处理HT-29细胞4小时，用化合物3体外处理来自锌处理的细胞的核提取物(锌活化的MTF-1)，并通过电泳迁移率分析(EMSA)(Panomics，Redwood City，CA)来分析MTF-1结合至MRE序列的DNA-结合活性。化合物3造成的MTF-1DNA-结合体外失活示于图48A。
为检测化合物3造成的MTF-1在细胞中的失活，用化合物3处理HT-29细胞1～4小时，并通过EMSA分析MTF-1在核提取物中的DNA-结合活性。用化合物3处理HT-29细胞后4小时观察到MTF-1活性明显降低(图48B)。
实施例63：化合物3调节在HT-29细胞中MTF-1DNA-结合活性的能力
为检测结合至MTF-1-靶基因细胞周期调控性基因周期素D1的启动子区的MTF-1的降低，用化合物3处理HT-29细胞16小时，并通过染色质免疫沉淀分析(ChIP)(Active Motif，Carlsbad，CA)分析结合至周期素D1启动子的MTF-1。在用化合物3处理16小时结束时，用1％甲醛固定细胞，以使转录因子和它们的靶向染色质交联。剪切染色质配合物，并使用MTF-1的抗体(Santacruz Biotechnology Inc.)对结合MTF-1的染色质进行下拉(pull down)处理。逆转交联，并使用包括周期素D1启动子的-231至-92区的引物，通过聚合酶链反应扩增MTF-1-相关的DNA。在Invitrogen合成5′引物(5′-CGGACTACAGGGGCAA-3′)[SEQ ID NO：1]和3′引物(5′-GCTCCAGGACTTTGCA-3′)[SEQ ID NO：2]。在用35μM ZnCl2处理后观察到结合周期素D1启动子的MTF-1增加，如图49所示，表明周期素D1是MTF-1的靶基因。与基础水平MTF-1结合相比，化合物3处理后观察到结合至周期素D1启动子的MTF-1降低，表明化合物3抑制MTF-1引起的组成型周期素D1基因转录活化(图49)。
实施例64：式I化合物对HT-29细胞中的锌螯合作用和周期素D1基因的表达的体外影响
为确定在如实施例23和实施例41所示的化合物3介导的细胞周期停滞中所涉及的，特别是与G1/S阶段相关的细胞周期调控途径，检测G1/S阶段进展的关键细胞周期调控剂周期素D1的表达。通过RT-PCR测量，在用1μM化合物3处理HT-29细胞16小时后，周期素D1基因表达明显降低，并且在25μM ZnCl2存在下可以逆转，证实周期素D1表达降低是缺锌的结果(图50A)。通过SDS-PAGE、然后Western印迹也证实了周期素D1的蛋白表达降低(图50B)。此外，测量其他类型的周期素的表达证实周期素E的表达降低(图50B)。
实施例65：式I化合物对MTF-1在HT-29细胞中的基因表达的体外影响
为分析细胞对缺锌的反应，检测锌敏感性转录因子MTF-1的基因表达。通过RT-PCR测量，在用1μM化合物3处理HT-29细胞8小时后观察到MTF-1的基因表达显著降低(图51)，并且通过补锌可以恢复，证实化合物3处理造成的MTF-1表达降低是缺锌的结果。
用ZnCl2处理HT-29细胞并且通过RT-PCR测量周期素D1基因的表达。相对于对照细胞中周期素D1基因的表达，表示基因表达的倍数变化。用作为MTF-1的活化剂的锌处理细胞后观察到周期素D1基因的表达增加(图51B)。
使用或未使用ZnCl2处理对照HT-29细胞或MTF-1siRNA处理的HT-29细胞，并通过RT-PCR测量周期素D1基因的表达。相对于在对照组中没有转染的对照细胞中周期素D1基因的表达和相对于转染组在非特异性siRNA-转染的细胞中周期素D1基因的表达，表示基因表达的倍数变化。当在加入化合物3之前siRNA使MTF-1基因抑制时，避免了周期素D1表达的锌依赖性的增加(图51C)。
实施例66：化合物3体外调节KLF4在用siRNA介导的MTF-1抑制的HT-29细胞中的表达的能力
为评价MTF-1表达降低对KLF4诱导的重要性，通过RT-PCR测量在用MTF-1siRNA转染的HT-29细胞中响应于化合物3处理的KLF4基因表达。相对于在用对照载体处理的非特异性siRNA-转染的细胞中的KLF4表达，表示KLF4基因表达的倍数变化。在MTF-1基因抑制后KLF4基因的基础表达显著降低，表明是组成型MTF-1-依赖性KLF4基因转录(图52)。然而，尽管siRNA使MTF-1基因抑制，但用化合物3处理后KLF4基因表达仍然增加(图52)，表明经化合物3处理KLF4基因的MTF-1非依赖性活化。
实施例67：式I的化合物对KLF4、KLF2和KLF6基因在H-460非小细胞肺癌细胞中的表达的体外影响
在非小细胞癌细胞系H-460中分析其他潜在肿瘤抑制剂KLF2(肺-KLF)(Wang等人，(2005)OncoGene 22(24)：3878-3885)和KLF6(Ito等人，(2004)Cancer Res 64(11)：3838-3843)的表达水平。通过RT-PCR测量KLF2、KLF4和KLF6基因在对照H-460细胞中的表达。以KLF4表达作为“1”，表示基因表达(图53A)。以KLF4表达作为“1”，检测到KLF4表达最高，并且KLF2和KLF6的表达仅为0.05和0.3倍(图53A)。
通过RT-PCR测量KLF2、KLF4和KLF6基因在用对照载体或2.5μM化合物3或化合物7处理的H-460细胞中的表达。以对照载体处理的组中各基因表达作为“1”，表示基因表达。用化合物3或化合物7处理还表明，增加的KLF4是变化最为显著的基因(图53B)。
实施例68：化合物3体内调节MTF-1、周期素D1和KLF4在结肠癌异种移植模型中的表达的功效
在化合物3处理的移植HT-29的无胸腺小鼠中分析化合物3的肿瘤抑制功效(图54A)，并与MTF-1、KLF4和周期素D1在HT-29异种移植组织中的基因表达相关联(图54B)。用HT-29细胞(在0.1mL PBS中3×106个细胞)皮下注射CD-1无胸腺裸鼠(4只/组)。在肿瘤细胞接种后5天时，用200μL对照载体或100mg/kg化合物3腹腔注射小鼠5天，然后间隔10天，持续两个周期(第5～9天作为第一周期注射，第20～24天作为第二周期注射)。在处理过程中使用测径器测量肿瘤大小(图54A)。在肿瘤细胞接种后的34天处死小鼠。切除肿瘤组织，立即冷冻并在-80℃下保存，直到提取RNA，并通过RT-PCR分析基因表达(图54B)。相对于用Lutrol对照载体注射的4只对照小鼠的平均值，表示基因表达的倍数变化。
与对照载体注射的小鼠相比，在化合物3处理的小鼠中观察到肿瘤大小显著降低(图54A)。异种移植组织中的基因表达分析还表明，与对照载体注射组相比，在化合物3处理的小鼠中，KLF4的表达显著增加，并且MTF-1和周期素D1基因表达降低(图54B)。
实施例69：化合物3和化合物7体外调节MT1A、MTF-1、周期素D1和KLF4在HT-29细胞中的表达的能力
通过RT-PCR测定式I化合物调节MT1A(图55A)、MTF-1(图55B)、周期素D1(图55C)和KLF4(图55D)的基因表达的能力。用1μM化合物3或化合物7、35μM ZnCl2、化合物3和ZnCl2一起、或化合物7和ZnCl2一起处理HT-29细胞8～16小时。在同一样品中用β-肌动蛋白的基因表达使各基因表达归一化。相对于DMSO对照的各基因水平，表示基因表达的倍数变化。如同使用1μM化合物3观察到的那样，使用化合物7也检测到MT1A、MTF-1和周期素D1的表达降低，以及KLF4的表达增加。为强调基因表达变化是细胞内缺锌的结果，通过补锌使得用化合物3或化合物7处理后MT1A(8小时)(图55A)、MTF-1(8小时)(图55B)和周期素D1(8小时)(图55C)的降低以及KLF4(16小时)(图55D)的增加得到逆转。
实施例70：化合物3和化合物64对过渡金属离子的体外螯合作用
利用前述实施例中所述的方法，使用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)比色锌分析，评价化合物64的金属螯合性能和对不同金属离子的相对亲合性，并与化合物3的体外影响作比较。用80％乙腈-20％DMSO对照载体或200μM的式I化合物培养所示最终浓度的ZnCl2(图56A)、CuCl2(图56B)或FeCl2(图56C)。使用多孔分光光度计在500nm下测量PAR-金属离子配合物的显色。
在化合物3和化合物64存在下，分别加入增加量的锌或铜后PAR-Zn2+(图56A)和PAR-Cu2+(图56B)的吸光度剂量依赖性地增加被消除，表明化合物的螯合性能，与PAR对Zn2+和Cu2+的结合相竞争。通过加入化合物最低限度地影响PAR-Fe2+的剂量依赖性显色(图56C)，表明与Fe2+相比，化合物3和化合物64均优选针对Zn2+和Cu2+。
实施例71：化合物64体外调节基因MT1A、MTF-1、周期素D1和KLF4在HT-29细胞中的表达的能力
通过RT-PCR测定化合物3和化合物64对MT1A(图57A)、MTF-1(图57B)、周期素D1(图57C)和KLF4(图57D)在HT-29细胞中的基因表达变化的影响。用1μM化合物3或化合物64、35μM ZnCl2、化合物3和ZnCl2一起、或化合物64和ZnCl2一起处理HT-29细胞8～16小时。在同一样品中用β-肌动蛋白的基因表达使各基因表达归一化。相对于DMSO对照的各基因水平，表示基因表达的倍数变化。
如同使用1μM化合物3观察到的那样，使用化合物64也检测到MT1A、MTF-1和周期素D1的表达降低，以及KLF4的表达增加。通过补锌使得用化合物3或化合物64处理后MT1A(8小时)(图57A)、MTF-1(8小时)(图57B)和周期素D1(8小时)(图57C)的降低以及KLF4(16小时)(图57D)的增加得到逆转。
本说明书中具体参考涉及到的所有专利、出版物(包括公开的专利申请)和数据库条目的全部公开内容，其程度就如同各个专利、出版物和数据库条目均具体和单独地引入作为参考。
尽管结合一些具体实施方案说明了本发明，但本领域技术人员显然可以在所附权利要求记载的本发明的精神和范围内作出各种修改。在本发明的实施方案中，要求的专有权利或特权如权利要求书所定义的。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>劳洛斯治疗公司等(Lorus Therapeutics Inc.et al.)
<120>2-吲哚基咪唑并[4，5-d]菲咯啉衍生物及其在癌症治疗中的用途(2-Indolyl Imidazo[4，5-d]Phenanthroline Derivatives and Uses Thereof inthe Treatment of Cancer)
<130>335-173PCT
<140>PCT/IB2006/051675
<141>2006-05-25
<150>60/787,526
<151>2006-03-31
<150>60/710,551
<151>2005-08-22
<150>60/787,526
<151>2006-03-31
<160>4
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>引物(primer)
<400>1
cggactacag gggcaa                                                               16
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>引物(primer)
<400>2
gctccaggac tttgca                                                               16
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>siRNA寡核苷酸的非特异性正义链
(nonspecific sense strand of siRNA oligonucleotide)
<221>misc_feature
<222>(20)...(21)
<223>在位置20和21的n是DNA(胸腺嘧啶脱氧核苷)
(n at positions 20and 21are DNA(thymidine))
<400>3
cuaggguaga cgaugagagn n                                                         21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>siRNA寡核苷酸的非特异性反义链
(nonspecific antisense strand of siRNA oligonucleotide)
<221>misc_feature
<222>(20)...(21)
<223>在位置20和21的n是DNA(胸腺嘧啶脱氧核苷)
(n at positions 20and 21are DNA(thymidine))
<400>4
cucucaucgu cuacccuagn n                                                         21

Claims (55)

1. 一种用于在有需要的受试者中抑制癌细胞增殖的式I化合物或其盐：
Figure A2006800233770002C1
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基。
2. 如权利要求1所述的化合物，其中所述癌症选自白血病、***癌、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌和胃肠道的癌症。
3. 如权利要求2所述的化合物，其中所述胃肠道的癌症是结肠癌或结肠直肠癌。
4. 如权利要求1所述的化合物，其中所述癌症是白血病、***癌、非小细胞肺癌或结肠癌。
5. 如权利要求4所述的化合物，其中所述癌症是白血病。
6. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或多环烷基；以及
R7是H。
7. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
8. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C5-C6环烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
9. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
10. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基或金刚烷基；以及
R7是H。
11. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
12. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；或C5-C6杂环烷基；以及
R7是H。
13. 如权利要求1～5任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2006800233770005C1
Figure A2006800233770006C1
Figure A2006800233770007C1
Figure A2006800233770008C1
14. 一种用于诱导癌细胞中的细胞凋亡的式I化合物或其盐：
Figure A2006800233770009C1
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基。
15. 如权利要求14所述的化合物，其中所述癌细胞选自白血病细胞、***癌细胞、非小细胞肺癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞和胃肠道的癌细胞。
16. 如权利要求15所述的化合物，其中所述胃肠道的癌细胞是结肠癌细胞或结肠直肠癌细胞。
17. 如权利要求14所述的化合物，其中所述癌细胞是白血病细胞、***癌细胞、非小细胞肺癌细胞或结肠癌细胞。
18. 如权利要求17所述的化合物，其中所述癌细胞是白血病细胞。
19. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或多环烷基；以及
R7是H。
20. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
21. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C5-C6环烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
22. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
23. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基或金刚烷基；以及
R7是H。
24. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
25. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；或C5-C6杂环烷基；以及
R7是H。
26. 如权利要求14～18任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2006800233770011C1
Figure A2006800233770012C1
Figure A2006800233770015C1
27. 一种用于螯合细胞中的过渡金属离子的式I化合物或其盐：
Figure A2006800233770016C1
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基。
28. 如权利要求27所述的化合物，其中所述过渡金属离子是锌离子、铁离子或铜离子。
29. 如权利要求27或28所述的化合物，其中所述过渡金属离子是锌离子。
30. 如权利要求27或28所述的化合物，其中所述过渡金属离子是铜离子。
31. 如权利要求27～30任一项所述的化合物，其中所述细胞在体内。
32. 如权利要求27～30任一项所述的化合物，其中所述细胞在体外。
33. 如权利要求27～32任一项所述的化合物，其中所述细胞是癌细胞。
34. 如权利要求33所述的化合物，其中所述癌细胞选自白血病细胞、***癌细胞、非小细胞肺癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞和胃肠道的癌细胞。
35. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或多环烷基；以及
R7是H。
36. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
37. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C5-C6环烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
38. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
39. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基或金刚烷基；以及
R7是H。
40. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
41. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；或C5-C6杂环烷基；以及
R7是H。
42. 如权利要求27～34任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2006800233770020C1
Figure A2006800233770021C1
Figure A2006800233770023C1
43. 一种用于增加Krüppel-样因子4(KLF4)在癌细胞中表达的式I化合物或其盐：
Figure A2006800233770023C2
其中：
R1、R2、R3、R4、R6和R7独立地选自氢、卤素、羟基、巯基、低级烷基、取代的低级烷基、低级链烯基、取代的低级链烯基、低级炔基、取代的低级炔基、烷氧基、烷硫基、酰基、芳氧基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、硝基、氰基或-S(O)1-2R，其中R是烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、杂芳基、取代的杂环基或取代的杂芳基；
R5是H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、-CH2-芳基、-CH2-杂芳基，
其中所述式I的化合物能够增加KLF4的表达。
44. 如权利要求43所述的化合物，其中所述癌细胞选自白血病细胞、膀胱癌细胞和胃肠道的癌细胞。
45. 如权利要求44所述的化合物，其中所述胃肠道的癌细胞是结肠癌细胞或结肠直肠癌细胞。
46. 如权利要求43～45任一项所述的化合物，其中所述癌细胞是白血病细胞。
47. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或C6-C14芳基；
R5是氢；C1-C4烷基；用C6-C14芳基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C6-C14芳基；用C1-C4烷基或卤素取代的C6-C14芳基；C5-C6环烷基C5-C6杂环烷基；或多环烷基；以及
R7是H。
48. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；或苯基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或环戊基；
R6是氢；卤素；C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；苯基；用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；C5-C6环烷基；C5-C6杂环烷基；或金刚烷基；以及
R7是H。
49. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；用C5-C6杂环烷基取代的C1-C4烷基，其中杂原子是N；C5-C6环烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
50. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是C1-C4烷基；金刚烷基；苯基；或用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
51. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；卤素；或C1-C4烷基；
R5是氢；
R6是C1-C4烷基或金刚烷基；以及
R7是H。
52. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；金刚烷基，或任选用C1-C4烷基或卤素取代的苯基；以及
R7是H。
53. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中：
R1、R2、R3、R4独立地是氢；C1-C4烷基；或C1-C4烷氧基；
R5是C1-C4烷基；用苯基取代的C1-C4烷基；或C4-C6环烷基；
R6是氢；C1-C4烷基；或C5-C6杂环烷基；以及
R7是H。
54. 如权利要求43～46任一项所述的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2006800233770026C1
Figure A2006800233770027C1
55. 一种选自以下的化合物：
Figure A2006800233770029C2
Figure A2006800233770030C1
Figure A2006800233770031C1
Figure A2006800233770032C1
Figure A2006800233770033C1
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