CN112946272B - 一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核基质蛋白22快速检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品。本发明所述试剂R1中的供体微球能够在680nm光的激发下产生单体氧；所述试剂R2中的受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm化学发光信号。因此在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现核基质蛋白22的快速检测。另外，本发明的试剂盒10min内即可完成检测，且本发明的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。

Description

一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物诊断试剂技术领域，尤其涉及基于一种双抗体夹心化学发发光法核基质蛋白22的快速检测试剂盒和应用。
背景技术
膀胱癌是全球范围内最常见的移行上皮细胞癌之一，占尿路上皮癌数量的 90％左右。2015年癌症年报中以2.88％占在男性癌症的第七位。其发病率较高，并且随着近些年来生活方式的改变呈逐年上升的趋势，主要治疗方法为手术治疗，但术后复发率较高。膀胱癌在中国已经位列泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。
早期诊断膀胱癌并给予相应的治疗对改善患者预后有着十分重要的意义。近年来人们试图通过寻找尿中膀胱癌标志物来诊断膀胱癌，越来越多的标志物被发现，尿核基质蛋白22(NMP22)是其中受关注较多的一种。尿核基质蛋白22属于核基质蛋白的一种，有研究表明：体外培养的膀胱癌细胞内NMP22的浓度比正常膀胱上皮细胞内NMP22浓度至少高25倍。NMP22在细胞死亡后被释放出来，以可溶性复合物或者片段的形式存在于人尿液中，因此NMP22已成为一种有极高研究价值的蛋白肿瘤标准物。
目前，NMP22的定量检测主要是Elisa方法，该方法虽然灵敏度较高，但是操作步骤繁琐、极为耗时，不利于将来的临床应用。因此迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择，该技术与Elisa方法检测方法相比，操作简单，反应时间短，该方法敏感性与精确度好，检测范围广。
发明内容
本发明的目的是为了解决当前市场上核基质蛋白22诊断试剂存在的成本高、耗时长、精度低等问题，从而提出的一种核基质蛋白22快速检测试剂盒。
因此，本发明一方面提供了一种核基质蛋白22的快速检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品，其中：所述试剂R1包括标记抗核基质蛋白22的单克隆抗体1的供体微球的缓冲液，所述供体微球能够在680nm光下激发产生单体氧；所述试剂R2包括标记抗核基质蛋白22单克隆抗体2的受体微球的缓冲液，所述受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm化学发光信号；所述的校准品是以蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成，所述的校准品浓度为100U/ml、50U/ml、20U/ml、10U/ml、5U/ml、1U/ml。
优选地，本发明所述的试剂R1的缓冲液为0.01M Tris、0.9％NaCl、2％BSA、 0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4。
优选地，本发明所述的试剂R2的缓冲液为0.01M Tris、0.9％NaCl、2％BSA、 0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4。
优选地，本发明所述的蛋白缓冲液为0.01M Tris、0.9％NaCl、5％BSA、0.1％Proclin 300、10％海藻糖、0.05％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4。
优选地，本发明所述的抗核基质蛋白22的单克隆抗体1针对的抗原表位均位于aa60-aa71。
优选地，本发明所述的抗核基质蛋白22的单克隆抗体2针对的抗原表位均位于aa231-aa240。
优选地，本发明所述的供体微球和受体微球的直径均为80nm。
优选地，本发明所述的试剂R1中供体微球的浓度为2μg/mL；所述的试剂 R2中受体微球的浓度为2μg/mL。
再一方面，本发明还提供了一种使用所述的核基质蛋白22检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：1)将检测样本或者校准品与试剂R1、试剂 R2按照体积比10μL:50μL:50μL的量混合，混合液置于37℃下避光温育10min； 2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，记录校准品和样本的化学发光值；3)根据校准品的浓度和化学发光值拟合标准曲线，将样本化学发光值代入标准曲线，计算样本的浓度。
再一方面，本发明还提供了一种所述的试剂盒在检测核基质蛋白22中的应用。
采用双抗体夹心法(两株抗体识别不同的抗原位点)检测样本中的核基质蛋白22时，当样本中存在核基质蛋白22时，待测样本池中的标记抗核基质蛋白 22单克隆抗体1的供体微球能够与核基质蛋白22结合，再与标记抗核基质蛋白 22单克隆抗体2的受体微球结合，最后形成受体微球-核基质蛋白22-供体微球这样一个复合体，在激光(680nm)的照射下，供体微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体微球上的发光基团，使之产生化学发光，波长为615nm，此时发光值最高，单体氧在其4μs的半衰期内可扩散的距离为200nm 左右，光信号可被高通量化学发光检测仪检测到；如果不存在抗原抗体的特异性反应，也就说如果未形成受体微球-核基质蛋白22-供体微球的复合体，单体氧将无法扩散至距离较远的受体微球，则不会产生化学发光作用。原理如图1所示。
本发明所述的试剂盒在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现核基质蛋白22的检测。本发明的试剂盒10min内即可完成抗体检测，且本发明的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。
本发明使用的两株单克隆抗体均为抗核基质蛋白22E2蛋白的单克隆抗体，作为本领域的技术人员来说，替换其它的抗核基质蛋白22的单克隆抗体的相似方案也在本发明的保护范围之内。
附图说明
图1检测试剂盒原理图。
图2试剂盒校准品标准曲线图。
图3本试剂盒线性范围检测结果图。
图4本试剂盒与金标准相关性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。核基质蛋白22购自武汉科斯坦生物科技有限公司。供体微球和受体微球购自科美诊断技术股份有限公司。
实施例1核基质蛋白22检测试剂盒的建立
1两株抗核基质蛋白22单克隆抗体的制备
用核基质蛋白22，免疫8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫时，核基质蛋白22与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，50μg蛋白/只；7天后核基质蛋白22与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，50μg蛋白 /只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫核基质蛋白22，50μg/只；免疫后的第 3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基培；10 天后以核基质蛋白22为包被抗原，间接ELISA检测细胞上清，筛选阳性杂交瘤细胞，从中筛选到7D7和4C8两株细胞株。
取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠分别注射杂交瘤细胞(7D7株和4C8株)1×106～2×106个，7～10日后，抽取小鼠腹水，在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清液。使用 ProteinG亲和层析柱纯化单克隆抗体，其中7D7株表达的抗体标记为抗核基质蛋白22单克隆抗体1，4C8株表达的抗体标记为抗核基质蛋白22单克隆抗体2；将两株抗体分别分装成0.5mL/管，-20℃保存备用。
接下来，我们委托南京金斯瑞公司对来两株单克隆抗体所识别的抗原表位进行检测，结果显示，本发明所述的抗核基质蛋白22的单克隆抗体1针对的抗原表位均位于aa60-aa71(氨基酸序列为RLDFVCSFLQKN)；本发明所述的抗核基质蛋白22的单克隆抗体2针对的抗原表位均位于aa231-aa240(氨基酸序列为 DELELELAEN)。
2试剂R1制备：量取10mg 80nm的的供体微球和1mg抗核基质蛋白22的单克隆抗体1，迅速混匀，再加入pH 6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH 6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的 NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH 6.0的 0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为 1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm 离心60min，弃去上清，加入2mL pH 6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M Tris、0.9％NaCl、2％BSA、0.1％Proclin 300、 5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为2μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
3试剂R2制备：具体制备方法与供体微球基本相同(将供体微球替换为受体微球，抗核基质蛋白22的单克隆抗体1替换为抗核基质蛋白22的单克隆抗体 2)，最后用00.01MTris、0.9％NaCl、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、 0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4的缓冲液溶解制备的受体微球，使其终浓度为2μg/ml，超声分散后置于4℃保存备用；
4校准品的制备
使用蛋白缓冲液将核基质蛋白22分别稀释为100U/ml、50U/ml、20U/ml、10U/ml、5U/ml、1U/ml。其中所述的蛋白缓冲液为0.01M Tris、0.9％NaCl、5％ BSA、0.1％Proclin300、10％海藻糖、0.05％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.4。
5使用1-4制备的试剂盒检测核基质蛋白22的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将检测样本或者校准品与试剂R1、试剂R2按照体积比10μL:50μL:50μL 的量混合，混合液置于37℃下避光温育10min；
2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间 3s，记录校准品和样本的化学发光值；
3)根据校准品的浓度和化学发光值拟合标准曲线(参见附图2)，将样本化学发光值代入标准曲线，计算样本的浓度；当样本浓度小于10U/ml为正常。
实施例2核基质蛋白22检测试剂盒的性能指标评价
1检测灵敏度以0.9％的NaCl为空白样本，选取一份低值样本进行倍比稀释，配制出不同浓度(0、0.05、0.10、0.15、0.20mg/L)的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见下表，从中可见，本发明试剂盒的的检测灵敏度为0.1U/ml。
浓度(U/ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20
SD 0.02 0.03 0.01 0.02 0.02
AVERAGE -0.02 0.08 0.10 0.36 0.49
3SD 0.06 0.09 0.02 0.06 0.07
AVERAGE-3SD / -0.01 0.07 0.30 0.42
AVERAGE+3SD 0.05 / / / /
CV -129％ 37％ 7％ 6％ 5％
2线性范围用0.9％NaCl按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0的稀释比例对高值样本进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，由图3可知，在样本浓度小于500U/ml的范围内能够保持保持良好的线性，即R2大于0.99。
3与金标准的相关性分别采用本发明试剂盒和金标准检测尿液样本中 NMP22做相关性实验，使用本发明试剂盒对40份人样本(包含正常和异常样本) 进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图4(X、 Y轴均为测定值，单位U/ml)。由图4可知，本发明试剂盒和金标准的相关系数为R2＝0.9989，回归方程为y＝0.9926x-0.2472。该结果表明本发明试剂盒与金标准具有很好的相关性、特异性和准确性。
综上所述，本发明的试剂盒操作简单，可以在10分钟左右完成所有，大大缩短了临床检验标本周转时间。使用本发明的试剂盒检测核基质蛋白22，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样本在进行检测时，无需稀释，不存在 HOOK效应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种核基质蛋白22抗原表位肽的组合，其特征在于，所述的抗原表位肽在核基质蛋白22的氨基酸序列的位置分别为aa60-aa71和aa231-aa240；所述的aa60-aa71的氨基酸序列为RLDFVCSFLQKN；所述的aa231-aa240的氨基酸序列为DELELELAEN。
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