JP2007520712A - 患者サンプルにおけるCu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/ZnSOD)の濃度の選択的測定による敗血症の診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、集中治療室および緊急治療室における患者の死亡の危険性を早期に測定するための方法であって、このタイプの患者の血清サンプルまたは血漿サンプル内のCu/Znスーパーオキシドジムスターゼ(Cu/Zn SODまたはSOD-1)の濃度を選択的に測定し、そして、定量的にまたは半定量的に測定した濃度であって予め求めたカットオフを超える濃度(例えば約310ng/mlよりも高い濃度)が、死亡の高い危険性と相関している方法に関する。
Description
本発明は、集中治療室および緊急治療室における、患者、特に敗血症の患者の臨床ケアに使用することができ、患者の死亡の危険性または生存の可能性についての情報を提供する新規の予後方法に関する。
本発明は、敗血症の診断および治療の更なる改良に関する、出願人による集中的な研究を起点とする。
炎症は、様々な外部因子、例えば怪我、火傷、アレルゲン、細菌および真菌類およびウイルスなどの微生物による感染に対する、拒絶反応を引き起こす異種組織に対する、または、身体の特定の炎症誘導内因性状態、例えば自己免疫疾患および癌に対する、特定の生理学的反応として一般的には定義されている。炎症は、身体の無害で局所的な反応として生じるだけでなく、個々の組織、臓器、臓器部分および組織部分に対して多くの重篤な慢性および急性疾患を引き起こす典型的な特徴を有する。
局所的な炎症は、一般的に、有害因子に対する身体の健全な免疫応答の一部であるので、生物の生命維持のための防御機構の一部である。しかしながら、炎症が、例えば、自己免疫疾患などの特定の内因性プロセスに対する身体の誤って導かれた反応の一部である場合、および/または慢性である場合、あるいは全身性炎症反応症候群(SIRS)のケースまたは感染によって生じた重篤な敗血症のように炎症が全身的範囲に至る場合、炎症反応に典型的な生理学上のプロセスは調節不能となり、患者の生命に危険を及ぼす実際の病理学上のプロセスになることが多い。このような患者は、したがって、典型的には、病院の集中治療室でケアされなければならない。以下においては、一般に、このような患者を敗血症患者と呼称するが、この用語は、事前に敗血症診断を行なった患者を必ずしも意味するわけではなく、一般的には、集中治療室における敗血症の危険性を有する重篤な患者を含むことを意図する。
現在、炎症プロセスの原因および経路が、多くがタンパク質またはペプチドである非常に多くの物質によって制御されていること、または、事実上限られた時間で特定の生体分子の発生に付随することが知られている。炎症反応に関与する内因性物質には、特に、サイトカイン、メディエイター、血管作用物質、急性期タンパク質および/またはホルモン性調節因子に含まれる物質が含まれる。炎症反応は、炎症プロセスを活性化する内因性物質(例えばTNF-α)および物質を不活性化する内因性物質(例えばインターロイキン-10)の両方が関与する複合的な生理学的反応である。
敗血症または敗血症性ショックの場合のような全身性炎症では、炎症特異反応カスケードが未制御で全身にわたって広まり、過度の免疫反応との関連で生命が危険にさらされるようになる。内因性の炎症に特異的な物質の個々の群の発生および役割の可能性についての現在の知識については、例えば、A. Beishuizen et al., “Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock”, Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131;およびC. Gabay et al., “Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation”, The New England Journal of Medicine, vol. 340, no. 6, 1999, 448-454を参照せよ。敗血症の知識、そしてそれに伴う認識されている定義までもが、近年変化しているので、K. Reinhart et al., “Sepsis und septischer Schock” [Sepsis and septic shock], in: Intesivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2001, 756-760も参照せよ。この文献では、敗血症という用語の現在の定義が示されている。「重篤な敗血症」の臨床像の重要性については、更に、(34;本明細書においては、括弧内の数字は、本明細書の最後の参考文献のリストにおいて同じ数字で表す参考文献を示す)を参照せよ。敗血症および密接に関連した臨床像についての基準および定義のより最近の要約については、http://www.talessin.de/scripte/medizin/sepsis1.htmlで見出すことができる。本明細書においては、敗血症という用語は、集中治療室の非常に重篤な患者の敗血症の臨床像について、前記出版物で表す定義に基づいて、包括的な意味で使用する。
少なくともヨーロッパでは、敗血症という用語は、長らく陽性の血液培養により検出可能な全身性細菌感染により特定されてきたが、今日では、主として敗血症とは、感染によって発生するが、病理学上のプロセスとして、他の原因によって誘導される全身性炎症とかなりの類似点を持っている全身性炎症であるものと理解されている。敗血症の理解における前記の変化は、診断方法の変化に基づく。そのため、細菌性病原体の直接検出は、コンピューターを活用した所謂スコアシステム(例えば、APACHE II SOCRE; APACHEは、“Acute Physiology and Chronic Health Evaluation”を表す; (33)およびDE 42 27 454 C1のイントロダクション参照)を使用した、検査パラメーターおよび血行動態パラメーターの複合的なモニタリングによって置き替えられるか補足され、そして、より最近では、特に、敗血症プロセスまたは炎症性プロセスに関与している特定の内因性物質、すなわち特定の「バイオマーカー」の検出によって置き替えられたか補足されている。
多くのメディエイターおよび急性期タンパク質の中でも、特に、その発生が敗血症または敗血症の特定の期間に非常に特異的であり、その濃度が劇的におよび臨床的に顕著に変化し、そして、更に所定の測定のために必要な安定性を有し、高い濃度に達する物質が、診断目的に適する。敗血症のプロセスに関与する内因性物質の複雑なカスケードにおける役割が具体的に知られている必要はなく、それぞれのバイオマーカーと病理学上のプロセス(敗血症)との信頼できる相関関係が、診断目的のためには、第一に重要である。
特に敗血症のバイオマーカーとして適する内因性物質は、プロカルシトニンである。プロカルシトニンは、全身性炎症または感染性の病因(敗血症)の状況下で血清濃度が非常に高い値に達するが、健康なヒトでは実質的に検出されないプロホルモンである。プロカルシトニンの高い値は、更にその上、敗血症の相対的に早期の段階で達するので、プロカルシトニンの測定は、また、敗血症の早期診断、および、感染を原因とする敗血症と他の原因の重篤な炎症の間の早期の区別に適する。敗血症マーカーとしてのプロカルシトニンの測定は、M.Assicot et al., “High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection”、The Lancet、vol. 341, no. 8844, 1993, 515-518による刊行物;ならびに特許DE 42 27 454 C2 および EP 0 656 121 B1 および US 5,639,617の主題である。本明細書を補完する前記出版物に言及された前記特許および早期の参考文献を明示的に参照せよ。
敗血症マーカーのプロカルシトニンの有用性によって、敗血症研究にかなりのはずみがついてきており、現在では、プロカルシトニン測定を補足し、かつ/または詳細診断または識別診断の目的で追加情報の提供が可能な、さらなるバイオマーカーを発見するために多大な努力が行われている。しかしながら、敗血症のプロセスに関与する特定の内因性物質の発症に関する正確な機能について、または正確な理由についてほとんど知られていないか、全く知られていないという事実によって、可能性ある新規の敗血症バイオマーカーの探索は、困難なものとなっている。
更なる可能性ある敗血症マーカーの測定に対する有益で、純粋に仮説に基づくアプローチの実験的な試験結果が、DE 198 47 690 A1またはWO 00/22439に見出すことができる。そこでは、敗血症においては、プロホルモンプロカルシトニンの濃度が増加するだけでなく、濃度の顕著な増加は、ペプチドプロホルモンとみなすことできる他の物質、または、このようなプロホルモンの断片でありプロホルモンに典型的な免疫活性を有する他の物質についても観察していた。記載した現象は十分に文献で示されているが、敗血症におけるプロホルモンまたはその断片の濃度の検出可能な増加の正確な原因は、大部分の場合、実質的に説明されていない。
本出願は、更なる敗血症-特異的な生体分子の探索における、有益で、純粋に実験的な他のアプローチの結果に基づく。この結果は、エンドトキシンを霊長類(ヒヒ)に投与することによって、人工的な敗血症を生じさせ、「敗血症の」ヒヒだけに見出されることから敗血症-特異的バイオマーカーとなる可能性のあるペプチドまたはタンパク質性状の内因性物質を、エンドトキシン処理したヒヒサンプルおよび非処理のヒヒサンプルの電気泳動タンパク質スポットを比較することによって測定するという事実に基づく。霊長類モデルは、霊長類とヒトとの生理機能の非常に高い類似性、ならびに、多くのヒトの治療および診断薬との高い交差反応性を考慮して選択した。
本出願人の先行特許出願の実験セクションでより詳細に記載したように、エンドトキシン投与(Salmonella Typhimuriumに由来するLPS)および処理した動物の肝臓組織の二次元ゲル電気泳動の実施によって、ヒヒにおける人工的な敗血症の実験的な誘導後に、処理した動物のみで同定可能な多くのタンパク質スポットが見出される。これらのスポットに対応するタンパク質生成物を、電気泳動ゲルから単離し、質量分析器(特に、タンデム質量分析器)によって調べた。
とりわけ、最初の本出願人による先行独国および欧州特許出願に記載したように、タンパク質「インフラミン(inflammin)」(WO 02/085937)、CHP (WO 03/005035)、可溶性サイトケラチン-1断片(sCY1F; WO 03/002600)、タンパク質LASP-1 (WO 03/089934)ならびにアルドース-1-エピメラーゼ (ムタロターゼ; WO 03/048780)、グリシンN-アシルトランスフェラーゼ (GNAT; WO 03/048781)および可溶性カルバモイルホスフェートシンターゼ1 (CPS 1; WO 03/089933)などの酵素が、前記の方法によって新規の敗血症マーカーとして同定された。
本出願人による前記先行出願の内容は、これらの出願の明確な言及によって、本出願の開示の一部としてみなすことができる。
開示する研究によって、また、敗血症-特異的なタンパク質スポットとしては、多くの物質を明らかにした。これらの物質については、所謂「急性期タンパク質」として既に知られているか、または、以後の文献探索によって炎症もしくは敗血症に関連して発生することが既に論じられていることが示された。
このような1つのタンパク質スポットが、分析的に検討した結果、スーパーオキシドジスムターゼ酵素、すなわちCu-およびZn-依存性スーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn SOD; SOD-1)であることが証明されたスポットであった。
スーパーオキシドジスムターゼ(SOD, EC 1.15.1.1)は、活性なスーパーオキシドアニオンO2 -をより活性が低い種へと変換することができる抗酸化機能を有する酵素である。真核生物は、2つの異なるSODタイプ、すなわち、Cu/Zn SOD(SOD-1としても知られている)およびMn SODを有する。ヒトCu/Zn SODは、主にサイトゾルで見られる。Cu/Znは、2つの一致したサブユニットからなり、約33kDaの分子量を有するダイマーである。ヒトMn SOD(SOD-2)は、特にミトコンドリアで見られ、ホモテトラマーであり、約80kDaの分子量を有する。更に、とりわけ血漿、リンパ液および滑液などの細胞外の体液において生じる、所謂細胞外SODすなわちEC-SODも同定された。前記した3つ全てのSODタイプのcDNAまたはアミノ酸配列は知られており(例えば、(27)、(28)、(29)を参照)、かなり異なっている。これらは、適切なデーターベースで見出すことができる(例えば、http://www.expasy.org/cgi-bin-niceprot) (Cu/Zn SODすなわちSOD1: Swiss-Prot Accession Number: P00441; Mn SODすなわちSOD2: Swiss-Prot Accession Number: P04179; 細胞外SODすなわちEC-SODすなわちSOD3; Swiss-Prot Accession Number: P08294)。以下の明細書において、SODとのみ省略して使用する場合は、個々のSODタイプの間に如何なる区別も無いものとする、すなわち、議論は、一般的に、その酵素作用が第一に重要である知見および情報についてである。
それらのサブユニットの異なる配列が原因で、全ての3つのSODタイプは異なる免疫反応性を有し、交差反応しないイムノアッセイによって選択的に測定することができる(例えば(2)参照)。ヒトCu/Zn SODおよびヒトMn SODの両方は、治療目的/実験のために、リコンビナント形態で調製された((5)および本明細書に引用する更なる参考文献を参照)。
特に、SOD-1とSOD-2についての多くの科学論文が存在するが、これらの科学論文は、様々な生理学的条件における、様々な敗血症および器官または組織における、ならびに、様々な外部の影響下での、様々なSODタイプの生理学的発生および役割の複雑性および矛盾した考えを与える。とりわけ、SODの発現または翻訳が、エンドトキシン(LPS)によって影響を受けること、そして、LPSの作用は、少なくともラットにおいては、特に呼吸気の酸素画分に依存していることが、長らく知られている(例えば(1)および(2)参照)。しかしながら、その実験的な知見は、試験した組織の由来または試験した細胞培養液に依存して、そして、mRNAまたはタンパク質のレベルを考慮するかに依存して、かなり異なっており、観察の時間間隔も付加的な役割を担っている(例えば、(1)から(4);(6)、(7)、(9)、(10)、(12)、(13)、(14)参照)。しかしながら、一般的には、LPSの影響下でのMn SOD発現/転写の増加が大部分の場合において報告されているのに対して、Cu/Zn SODについての対応する効果は、観察されていないか、実質的に顕著でない程度で観察されているにすぎないと言われている。大部分の研究においては、LPSの影響下でCu/Zn SODが減少することさえ報告されている(例えば(1)から(4)、(7)、(9)、(10)、(12)から(14)参照)。様々な炎症疾患におけるSOD形成の増加は、活性酸素種(ROS)に対する防御機構の一部として論じされており、したがって、SODは、また、治療剤として、とりわけ炎症を抑制するための治療剤として使用されていた((5)参照)。
多くの結果が様々な動物モデルを用いて得られたという事実が、更に、その解明を複雑にしている。それゆえ、ラットで観察されたLPS投与の防御効果は、例えば、ウシにおいては、証明することはできなかった(例えば(13)および記載されている更なる参考文献参照)。しかしながら、SODが、とりわけ身体の酸素ストレスおよび炎症反応に関連して、生理学的に重要な役割を果たしていることについては意見が一致している。
したがって、SODは、また、敗血症または敗血症に典型的な複雑性に関連して、論じられていた。これらに関連した文献(8)または特許出願WO 94/22016 A1には、敗血症の患者はMn SODのレベルが増し、特定のカットオフ値をMn SODレベルが超えた場合においては、合併症として恐れられる成人呼吸促迫症候群(ARDS)を発症する危険が著しく増すことが報告されている。Mn SODは、選択的ELISAアッセイによって、免疫的に測定されていた。
これらの結果に基づき、そして、これらを参照にして、その後に、敗血症におけるSODの役割が、特にとりわけSOD測定を介して敗血症の予期される経過の初期兆候を得ることを期待して、何度も調査された((11)、(15)から(17)、(19)、(20)参照)。しかしながら、多くの関連した研究においては、個々のSODタイプの選択的な測定は行なわず、サンプルにおいて見出された酵素活性が起因するSODタイプについての情報をもたらさない方法((30)、(31))によって、SOD酵素活性を一般的に測定していた。(8)またはWO 94/22016 A1による前記した基本的な刊行物に基づけば、しかしながら、測定したSOD酵素活性は、少なくとも主に増加したMn SODに起因し、付加的にES-SOD値に起因する可能性があることが想定されなければならない。Cu/Zn SODの特異的な役割、または、Cu/Zn SODの選択的測定の有用性は、前記した敗血症に関する如何なる刊行物にも論じられていなかった。酵素活性の測定が、その酵素の効果を担う生体分子またはこのような生体分子の群の濃度を測定することと、同等であるとみなすことはできないことに着目すべきである。なぜならば、酵素活性は、例えば、酵素の濃度が変化していなくとも、試験したサンプル内で阻害または増加する可能性があるからである。SODについては、例えば、活性窒素種(RNS)によって酵素活性が減少することが記載されている(24)。
Cu/Zn SOD遺伝子の発現が、酸化窒素によって制御されていることを示すより最近の刊行物((14)、(18))でさえも、敗血症の患者のサンプルにおいて測定されたCu/Zn SOD分子の濃度と、敗血症の予期される経過との間の関係は示していない。増加したCu/Zn SOD発現は、防御機構として論じられている。
DE 42 27 454 C1
EP 0 656 121 B1
US 5,639,617
DE 198 47 690 A1
WO 00/22439
WO 02/085937
WO 03/005035
WO 03/002600
WO 03/089934
WO 03/048781
WO 03/089933
WO 94/22016
EP 217 542 A2
EP 327 337 A2
WO 90/06513 A1
A. Beishuizen et al., "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131
C. Gabay et al., "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New England Journal of Medicine, vol. 340, no. 6, 1999, 448-454
K. Reinhart et al., "Sepsis und septischer Schock" [Sepsis and septic shock], in: Intesivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2001, 756-760
M.Assicot et al., "High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection"、The Lancet、vol. 341, no. 8844, 1993, 515-518
本出願人によるヒヒの敗血症モデルにおけるCu/Zn SODの明確な証拠の観点、ならびに、敗血症におけるSODの発生に関する文献で見られるデータは、敗血症のプロセスにおけるヒトSODの役割および敗血症の患者の血清または血漿サンプル中のヒトCu/Zn SODの特異的な測定の診断的な有用性に関しては、如何なる示唆も与えないという事実の観点から、本出願人が、より大きなグループの敗血症の患者の血清または血漿サンプルを測定することによって、サンプルにおけるヒトCu/Zn SODの測定可能な濃度と、試験したサンプルが由来する患者の病気の裏付けされた経過との間に如何なる関連性が存在するかを調べることを決心した。
この理由は、今のところ臨床行為に導入された実績のある敗血症の診断マーカーであるプロカルシトニンが存在するにもかかわらず、未だに、正確な敗血症診断のための、特に早期の敗血症の診断のための更なるバイオマーカーに対する緊急の必要性が存在するという切実な欠落のためである。このバイオマーカーは、集中治療室における患者の連続的な臨床のマルチパラメーターのモニタリングを便宜上補完することができる(例えば、APACHE II SCOREにしたがって)、または、場合によっては、このようなモニタリングと同等でさえある、診断的可能性、特に予後的可能性を有する。
驚くべきことに、本出願人によって行なわれた、集中治療室および緊急治療室の患者の血清または血漿サンプル中のCu/Zn SODの測定によって、測定値が、観察される病気の経過または敗血症の経過に対して顕著な相関関係を有しており、特に、重篤な患者を、恐らく生存するであろう患者からなるグループと生存しないであろう患者からなるグループへと早期に信頼性を持って評価することができることが示された。Cu/Zn SODの定量的な測定は、試験した他の如何なる生化学マーカーも及ばない卓越した診断感度および特異性を有しており、この定量的測定によって、一般に、敗血症が疑われたまたは敗血症と診断された、集中治療室に運搬された患者の生存の可能性が示された。それゆえ、この方法は、敗血症患者の中で、特定の危険性を有する患者のグループを同定することができる。
したがって、本発明は、請求項1に記載された、集中治療室および緊急治療室における患者の死亡の危険性を早期に測定するための方法であって、前記患者の血清または血漿サンプル内のCu/Znスーパーオキシドジムスターゼ(Cu/Zn SODまたはSOD-1)を測定し、そして、定量的にまたは半定量的に測定した濃度であって予め求めたカットオフを超える濃度が、死亡の高い危険性(生存の低い可能性)と相関している方法に関する。
この技術分野で有用または慣習的である方法の発展が、請求項2から12の対象である。
以下に、本発明による方法を、測定結果およびこれら測定結果を示すグラフを参照に、より詳細に説明する。
以下の実施例から明らかであるように、集中治療室の患者(敗血症の患者)の血漿におけるCu/Zn SODの免疫化学的測定は、製造者の取扱説明書に従って、研究目的で市販されているELISAアッセイ(31)によって実施した。
しかしながら、当然のことながら、必要な特異性および感度が達成される限り、任意の他の既知の免疫アッセイ、または、Cu/Zn SODを測定するための既知の原理による実施される免疫アッセイを使用することもできる。このようなアッセイの例は、とりわけ、(2)に、そして、EP 217 542 A2、EP 327 337 A2およびWO 90/06513 A1などの特許文献に見出すことができる。
原則として、選択的で定量的な、または、少なくとも半定量的なCu/Zn SODの測定に適した全ての免疫化学的方法を、測定のために使用することができる。
好ましい実施形態においては、本方法は、Cu/Zn SODに特異的な抗体が、任意の固相、例えばコートした試験管(例えばポリスチレンの;「コートしたチューブ」;CT)の壁またはマイクロタイタープレート(例えばポリスチレンの)または粒子(例えば磁気粒子)に固定化され、一方で、更なる抗体が、直接検出可能なラベルであり、または、ラベルへの選択的な結合を可能とし、形成されたサンドイッチ構造を検出するように機能する基を有する、ヘテロジーニアスなサンドイッチ免疫アッセイとして実施される。適した固相を使用した遅延の、または、その後の固定化も可能である。
原則として、前記したタイプのアッセイで使用することができ、放射性同位体、酵素および蛍光、化学発光または生物発光ラベルを用いた標識化、並びに、直接光学的に検出可能な発色標識化(例えば金原子および色素粒子など)を含む全ての標識化方法を使用することができ、特に、所謂ポイント-オブ-ケア(POC)または迅速試験に使用されている標識化方法を使用することができる。それゆえ、本発明による方法を迅速試験として企図することは、本発明の範囲に含まれる。
ヘテロジーニアスなサンドイッチ免疫アッセイの場合、二つの抗体は、また、ホモジーニアスなアッセイに対して、以下に記載するタイプの検出システムの部分を有することができる。それ故、本発明による方法は、例えば、2つの抗体およびCu/Zn SODから形成される検出すべきサンドイッチ複合体が液相中で保持されているホモジーニアスな検出方法を使用して、実施することができる。このような場合、両方の抗体が1つのサンドイッチに一体化した時にシグナル発生またはシグナル誘発が可能な検出システムの部分で、両方の抗体を標識することが好ましい。このような方法は、特に、蛍光増幅または蛍光消光検出方法として企図することができる。このタイプの特に好ましい方法は、例えばUS A-4 822 733、EP B1 180 492またはEP B1 539 477およびこれらに引用された既知技術に記載されているように、対で使用される検出試薬の使用に関する。こられによって、1つの免疫複合体において両方の標識成分を含む反応産物のみを、反応混合物から直接、選択的に検出する測定が可能になる。登録商標TRACE(Time Resolved Amplified Cryptate Emission)またはKRYPTORで利用でき、前記の適用の教示を実施する手法を参照せよ。
以下に示す実施例においては、予後診断「100%の死亡の危険性」または「高い生存の可能性」のための好ましいカットオフとして、310ng/mlの値を求めた。しかしながら、このカットオフは、予後の目的に依存して変化することができる。更にその上、本実施例に記載する最適なカットオフは、(31)による市販のアッセイを使用して測定したことに注意すべきである。しかしながら、カットオフは、通常は、測定のために使用した免疫化学方法のキャリブレーションに依存する。異なる免疫アッセイを使用する場合、測定可能なCu/Zn濃度のための他の明確なカットオフが生じる。しかしながら、(31)によるアッセイのために使用される特定のアッセイの適したキャリブレーション以外に、本明細書で言及するカットオフへの適応は、通常、可能であるべきである。前記したカットオフが、特許請求の範囲に現れるが、前記した意味において理解され、特許法の下で、本発明による方法の使用のための完全な基準として解釈することはできない。
それゆえ、具体的な臨床環境において使用されるカットオフは、キャリブレーションに依存する。しかしながら、この事情は、医師にとっては如何なる問題も生じない。
実験結果:
1.材料および方法
集中治療室の患者の血漿におけるCu/Zn SOD濃度の測定の統計評価を以下に示す。測定するそれぞれのサンプルは、習熟した方法で、サンプリング(静脈血)した直後にワークアップし、EDTA血漿を得て、その後に、EDTA血漿サンプルを-20℃で直接凍結させた。凍結した血漿は、病気の経過の関連した記述のように、測定目的のために保存した。解凍したサンプルを、以下に記載の測定のためだけではなく、本文脈においてはより詳細な説明が必要でない他の様々な測定にも使用した。
1.材料および方法
集中治療室の患者の血漿におけるCu/Zn SOD濃度の測定の統計評価を以下に示す。測定するそれぞれのサンプルは、習熟した方法で、サンプリング(静脈血)した直後にワークアップし、EDTA血漿を得て、その後に、EDTA血漿サンプルを-20℃で直接凍結させた。凍結した血漿は、病気の経過の関連した記述のように、測定目的のために保存した。解凍したサンプルを、以下に記載の測定のためだけではなく、本文脈においてはより詳細な説明が必要でない他の様々な測定にも使用した。
個々の血漿におけるCu/Zn SOD濃度の測定は、研究目的で購入可能なELISAアッセイ(「human Cu/Zn SOD ELISA BMS222」, Bender MedSystems, MedSystems Diagnostic GmbH, Rennweg 95b, A-1030 Vienna, Austria)を使用して、関連したマニュアル(32)における製造者の手順に従って行なった。
比較目的のために実施した、サンプルにおけるSOD酵素活性の測定は、(30)による方法によって、同じように実施した。
測定値の統計評価のために、対応する市販のソフトウェア(Prism 4.0, Graphpad.com)を使用した。
2.患者グループの血漿の測定
2a.予備測定
以下の測定のための参照値を得るために、健康な試験対象サンプルにおけるCu/Zn SOD濃度を測定した。測定値は、約224ng/mlの中央値で114.1ng/mlから352.1ng/mlの範囲(標準偏差49.70ng/ml)で散布した。男性および女性の試験対象の間には如何なる差異も観察されなかった。
2a.予備測定
以下の測定のための参照値を得るために、健康な試験対象サンプルにおけるCu/Zn SOD濃度を測定した。測定値は、約224ng/mlの中央値で114.1ng/mlから352.1ng/mlの範囲(標準偏差49.70ng/ml)で散布した。男性および女性の試験対象の間には如何なる差異も観察されなかった。
2b.集中治療室における、敗血症、重篤な敗血症および敗血症性ショックと診断された患者のCu/Zn SOD、および、死亡の危険性または生存の可能性
本発明者が利用できるバンクに由来し、様々な集中治療室の敗血症患者(診断:敗血症、重篤な敗血症および敗血症性ショック)のサンプルを含む103の血漿サンプルを、以下の測定のために使用した。血液サンプルは、集中治療室へ入ってから最初の48時間以内に摂取した。
本発明者が利用できるバンクに由来し、様々な集中治療室の敗血症患者(診断:敗血症、重篤な敗血症および敗血症性ショック)のサンプルを含む103の血漿サンプルを、以下の測定のために使用した。血液サンプルは、集中治療室へ入ってから最初の48時間以内に摂取した。
Cu/Zn SODの測定および測定の評価は、説明するように実施した。(8)において、Mn SODの測定が敗血症またはARDSの発症と関連して提案されており、これに基づき、(11)において、敗血症患者のサンプルにおけるSOD酵素活性の測定が予後マーカーとして論じられているという事実に関連して、本発明によるCu/Zn SODについて得られた測定値およびその予後における重要性を、(11)で使用された(30)の方法によるSOD酵素活性(kU/L)の測定において得られた同じサンプルについての結果と比較した。
2つの測定方法の結果を、図1、2および3に示す。死亡が見込まれる患者グループ(79人の患者)および生存が見込まれる患者グループ(24人の患者)へと、調査したサンプルをグループ分けしたことに基づいて、310ng/mlの値を、適したカットオフとして求め、評価のために使用した。
図1および2の比較によって、集中治療室の患者(敗血症の患者)の血漿におけるCu/Zn SOD濃度の免疫化学的測定は、同じサンプルのSOD酵素活性の測定と同等であるとはみなすことができないことが示された。なぜならば、質的に全く異なる結果が得られたからである。
また、Cu/Zn SOD濃度の測定結果、および、比較の目的で実施した酵素活性の測定結果を、お互いの患者グループについてのCu/Zn SODの感度および特異性を表す所謂ROC曲線(receiver operating characteristic plots)によって評価した。感度は、全てのその後に死亡した患者に基づく、その後に死亡すると正確に認識した患者の割合として計算した。特異性は、全ての生存した患者に基づく、生存すると正確に認識した患者の割合として計算した。
ROCカーブの場合、相当する曲線と45°の角度の直線の間の領域(「area under the ROC function」または「area under the curve」, AUC)を、測定の統計的妥当性の特徴として使用した。この領域がより多くなるほど、診断または予後の有意性がより高くなる。
図1および2で得られた値のROC評価の場合においては、図3に示すように、Cu/Zn SODの特異的免疫化学測定(太い実線)によって、同じサンプルのSOD酵素活性の測定(点線)よりも、非常により有益で大きな意義を有する結果が得られることが見出された。
緊急治療室の患者の血漿におけるCu/Zn SOD測定の統計的評価の前記結果に基づき、驚くべきことに、前記患者におけるバイオマーカーCu/Zn SODの濃度の測定によって、緊急治療室に運ばれた患者の生存の見込みの早期予測の入手の新たな可能性が開発された。このような測定、具体的には、プロカルシトニンの測定と組み合わせた測定は、敗血症診断にとって好都合である。高濃度のCu/Zn SODを有する患者は、その後、敗血症の患者の中でも特定の危険性を有するグループを構成することとなり、特に処理および治療行為を正当化することとなる。これに関連して、例えば、活性化プロテインC(Eli Lillyのドロトレコジンまたはザイグリス)が、アメリカで、敗血症の治療として最近認可されたが、これらは死亡の危険性が高い敗血症の患者群の一部にのみ適応できることに注目すべきである。それ故、この群の一部をどのように正確に求めるかに関する問題点が、課題であることが判明している。代替手段が存在しないAPACHE II SOCREの使用は、文献(35)、(36)、(37)において論争の対象となっている。この関連において、高い危険性を有する敗血症患者を同定するための付加的なまたは代替的な手段としての、予後診断マーカーCu/Zn SODの利用は、重要な利点である。
Claims (9)
- 敗血症、重篤な敗血症または敗血症性ショックと臨床診断された、集中治療室における患者の死亡の危険性を早期に測定するための方法であって、Cu/Znスーパーオキシドジムスターゼ(Cu/Zn SODまたはSOD-1)に特異的な免疫化学アッセイによって、前記患者の血清または血漿サンプル内のCu/Zn SODを選択的に測定し、予め求めたカット-オフを超える濃度が、死亡の高い危険性と相関する方法。
- 前記特異的な免疫化学アッセイ方法が、競合タイプまたはサンドイッチタイプのリガンド結合アッセイである、請求項1に記載の方法。
- 前記リガンド結合アッセイが、サンドイッチタイプの、ホモジーニアスまたはヘテロジーニアスな免疫アッセイであって、少なくとも1つの標識したモノクローナルまたはポリクローナル抗体をCu/Zn SODを検出するために使用し、前記標識が、放射性同位体、蛍光、化学発光および酵素標識ならびに直接光学的に検出可能な色素粒子から選択される、請求項2に記載の方法。
- 310ng/ml以上の値が、測定したCu/Zn SOD濃度のための最適なカット-オフとして選択される、請求項1に記載の方法。
- マルチパラメーター測定の一部として実施され、少なくとも1つの更なる敗血症の予後パラメーターの定量的または定性的測定を同時に行う、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- プロカルシトニン、CA 19-9、CA 125、S100B、S100Aタンパク質、可溶性サイトケラチン断片、特にCYFRA 21、TPSおよび/または可溶性サイトケラチン-1断片(sCY1F)、ペプチドインフラミン、CHP、LASP-1、GNAT、ムタロターゼ、CPS 1およびペプチドプロホルモンproANP、proBNP、proADMならびにC-反応性タンパク質(CRP)からなる群から選択される少なくとも1つの更なるパラメーターを、Cu/Zn SODに加えて、マルチパラメーター測定の一部として測定する、請求項5に記載の方法。
- 前記マルチパラメーター測定を、チップ技術による測定装置またはイムノクロマトグラフィー測定装置によって、同時測定として実施する、請求項5または6に記載の方法。
- 前記測定装置を使用して得られた複数の測定結果の評価を、コンピュータープログラムを活用して実施する、請求項7に記載の方法。
- イムノクロマトグラフィーによるポイント-オブ-ケア法(迅速試験)として実施する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
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