CN111793136A - 一种nmp22抗体对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NMP22抗体对及其应用，包括与NMP22的N端表位相结合的单克隆抗体AntiNMP22_N和与NMP22的C端表位相结合的单克隆抗体AntiNMP22_C，并以化学发光检测方法特异性识别AntiNMP22_C，用于检测NMP22的含量。本发明使用与NMP22表位结合的AntiNMP22_N、AntiNMP22_C抗体对，利用化学发光检测方法来检测患者样品中NMP22的表达情况，来诊断患者膀胱部疾病，以提示患者患膀胱癌的风险。

Description

一种NMP22抗体对及其应用
技术领域
本发明涉及泌尿***疾病诊断领域，具体涉及一种NMP22抗体对及其应用。
背景技术
在泌尿***肿瘤当中，膀胱癌的发病率高居首位，近年来膀胱癌的发病率有上升趋势。大部分膀胱癌患者确诊时处于分化良好或中等分化的非肌层浸润性膀胱癌，其中约10％的患者最终发展为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌在保留膀胱的各种手术治疗中，约50％在2年内肿瘤可能复发，约10％-15％的复发肿瘤恶性程度有增加趋势，因此长期随访早期发现肿瘤复发是***治疗成功的关键之一。
目前，寻找特异、敏感、稳定的早期诊断标志物，对膀胱癌的早期诊断治疗和预后判断起到了积极的作用。膀胱镜检查及活检是膀胱癌的诊断金标准，但属侵入性的检查，且有较高的经济成本，并存在***的风险。
研究发现，膀胱癌患者细胞中核基质蛋白(nuclear matrix protein)浓度为正常细胞的25倍。NMP22在细胞凋亡后，由细胞核释出，以可溶性复合物或片段的形式存在于尿中，膀胱癌患者尿NMP22浓度水平为非癌对照组的20-80倍。NMP22是国外研究的一种可经尿液检测的***标记物，详见文献《specific nuclear protein that associates withthe polarregion of the mitotic apparrus:distribu tion in a human/hamsterhybrid cell》和文献《Use of a new tu mor marker,urinary NM P22,in the detectionof occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinarytravt following surgical treatment》,已被美国食品和药品管理局(FDA)批准在临床应用，NMP22肿瘤标记物在膀胱癌中的检测对膀胱癌的早期诊断治疗和预后判断起到了积极的作用。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种NMP22抗体对及其应用。
根据本申请实施例提供的技术方案，一种NMP22抗体对，包括与NMP22的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_N和与NMP22的C端表位如SEQID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_C，所述AntiNMP22_N包括如SEQID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiNMP22_C包括如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
本发明中，所述AntiNMP22_N的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:4所示、LCDR2如SEQID NO:5所示、LCDR3如SEQ ID NO:6所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_N的重链包含HCDR1如SEQ ID NO:8所示、HCDR2如SEQ ID NO:9所示、HCDR3如SEQ ID NO:10所示三个氨基酸序列，
所述AntiNMP22_C的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:14所示、LCDR2如SEQ ID NO:15所示、LCDR3如SEQ ID NO:16所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_C的重链包含HCDR1如SEQ ID NO:18所示、HCDR2如SEQ ID NO:19所示、HCDR3如SEQ ID NO:20所示三个氨基酸序列。
本发明中，所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C是IgG型单克隆抗体，所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可以变换成NMP22结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。
本发明中，所述AntiNMP22_N为捕获抗体，所述AntiNMP22_C抗体为检测抗体。
本发明中，所述AntiNMP22_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。
本发明中，所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶。
本发明中，通过免疫学检测法方法检测生物样品中NMP22含量，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)检测。
一种化学发光检测试剂盒，包含与NMP22的N端表位结合的AntiNMP22_N和与MP22的C端表位结合的AntiNMP22_C抗体对，以化学发光检测方法特异性识别AntiNMP22_C，用于检测NMP22的含量。
综上所述，本申请的有益效果：本发明使用与NMP22表位结合的AntiNMP22_N、AntiNMP22_C抗体对，利用化学发光检测方法来检测患者样品中NMP22的表达情况，来诊断患者膀胱部疾病，以提示患者患膀胱癌的风险。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1本发明配对抗体反应原理示意图；
图2为本发明pcDNA3.1-NL-LFc载体构建；
图3为本发明pcDNA3.1-NH-HFc载体构建；
图4为本发明重组AntiNMP22_N蛋白纯化图谱；
图5为本发明pcDNA3.1-CL-LFc载体构建；
图6为本发明pcDNA3.1-CH-HFc载体构建；
图7为本发明重组AntiNMP22_C蛋白纯化图谱；
图8为本发明试剂盒性能验证操作示意图；
图9是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第一次测定曲线；
图10是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第二次测定曲线；
图11是本发明性能指标考核中剂量-反应曲线验证的第三次测定曲线；
图12为本发明试剂盒与市场试剂盒检测浓度结果相关性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
一种NMP22抗体对，包括与NMP22的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_N和与NMP22的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_C，所述AntiNMP22_N包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiNMP22_C包括如SEQ IDNO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。所述AntiNMP22_N的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:4所示、LCDR2如SEQ ID NO:5所示、LCDR3如SEQ ID NO:6所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_N的重链包含HCDR1如SEQ ID NO:8所示、HCDR2如SEQ ID NO:9所示、HCDR3如SEQ ID NO:10所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_C的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:14所示、LCDR2如SEQ ID NO:15所示、LCDR3如SEQ ID NO:16所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_C的重链包含HCDR1如SEQ ID NO:18所示、HCDR2如SEQ ID NO:19所示、HCDR3如SEQ ID NO:20所示三个氨基酸序列。所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C是IgG型单克隆抗体，所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可以变换成NMP22结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。所述AntiNMP22_N为捕获抗体，所述AntiNMP22_C抗体为检测抗体。所述AntiNMP22_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶。通过免疫学检测法方法检测生物样品中NMP22含量，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)检测。
一种化学发光检测试剂盒，包含与NMP22的N端表位结合的AntiNMP22_N和与MP22的C端表位结合的AntiNMP22_C抗体对，以化学发光检测方法特异性识别AntiNMP22_C，用于检测NMP22的含量。
实施例1
单克隆抗体AntiNMP22_N和单克隆抗体AntiNMP22_C的制备
a)分别合成NMP22的N端表位(SEQ ID NO:2)和NMP22的C端表位(SEQ ID NO:3)，分别偶联KLH后免疫小鼠，小鼠为8周龄的雌性Balb/c小鼠。
b)免疫方法为：100ug的抗原免疫小鼠4次，每次间隔4周。
c)细胞融合：将免疫后的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞按1:1的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1000rpm/min离心10分钟，弃去上清，用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度)，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
d)用吸管在60s内加预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。
e)用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用)；20-27℃静置10分钟。
f)1000r/min离心5分钟，弃上清
g)加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
h)分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层)，每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板，每孔1.0-1.5ml)，然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
i)5天后用HAT培养基换出1/2培养基
j)7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；
k)经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清通过ELISA检测其活性。
l)通过多轮筛选和有限稀释法，最终获得纯的有效价的克隆。
实施例2
单克隆抗体AntiNMP22_N和单克隆抗体AntiNMP22_C的筛选
对实施例1获得克隆抗体分别进行N端抗原(SEQ ID NO:2)和C端抗原(SEQ ID NO:3)筛选。最终分别获得活性和配对最佳的抗体对AntiNMP22_N和AntiNMP22_C，其中AntiNMP22_N能特异性的结合NMP22的N端抗原(SEQ ID NO:2)，而不结合NMP22的C端抗原(SEQ ID NO:3)。AntiNMP22_C能特异性的结合NMP22的C端抗原(SEQ ID NO:3)，而不结合NMP22的N端抗原(SEQ ID NO:2)。
NMP22全抗原(SEQ ID NO:1)包被，化学发光法验证
NMP22的N端抗原(SEQ ID NO:2)包被，化学发光法检测。
NMP22的C端抗原(SEQ ID NO:3)包被，化学发光法检测。
表1
全抗原(SEQ ID NO:1) N端抗原(SEQ ID NO:2) C端抗原(SEQ ID NO:3)
空白组 6798 6953 6622
AntiNMP22_N 2ul 92302 83290 6991
AntiNMP22_N 10ul 402993 387862 7099
AntiNMP22_N 50ul 1840516 1472154 7041
AntiNMP22_C 10ul 89290 6832 86860
AntiNMP22_C 20ul 403333 6502 391525
AntiNMP22_C 50ul 1823704 6898 1453347
由表1可知，通过此实验确认本发明抗体对中的AntiNMP22_N能够识别N端抗原不能识别C端抗原。本发明抗体对中的AntiNMP22_C能够识别C端抗原不能识别N端抗原。
实施例3
重组表达NMP22的N端抗体AntiNMP22_N和NMP22的C端抗体AntiNMP22_C
a、重组表达NMP22的N端抗体AntiNMP22_N
对实施例2获得抗体对中的AntiNMP22_N的杂交瘤进行测序后，获得抗体AntiNMP22_N的轻链可变区序列(SEQ ID NO:7)重链可变区(SEQ ID NO:11)。对其序列进行优化后，将轻链可变区克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，获得pcDNA3.1-NL-LFc(图2)。将重链可变区克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，获得pcDNA3.1-NH-HFc(图3)。pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区。其中NL(轻链可变区)的核酸序列为SEQID NO:12，NH(重链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:13。将pcDNA3.1-NL-LFc和pcDNA3.1-NH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗NMP22的N端抗体AntiNMP22_N(图4)。
注：
图2中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-NL-LFc Plasmid；
Lane 2:NL
图3中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1--HFc Plasmid；
Lane 2:NH
图4中Lane M：Marker；
Lane 1：AntiNMP22_N
b、重组表达NMP22的N端抗体AntiNMP22_C
对实施例2获得抗体对中的AntiNMP22_C的杂交瘤进行测序后，获得抗体AntiNMP22_C的轻链可变区序列(SEQ ID NO:17)重链可变区(SEQ ID NO:21)。对其序列进行优化后，将轻链可变区克隆到pcDNA3.1-LFc载体中，获得pcDNA3.1-CL-LFc(图5)。将重链可变区克隆到pcDNA3.1-HFc载体中，获得pcDNA3.1-CH-HFc(图6)。pcDNA3.1-LFc和pcDNA3.1-HFc中已经含有人源的轻链恒定区和重链恒定区。其中CL(轻链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:22，NH(重链可变区)的核酸序列为SEQ ID NO:23。将pcDNA3.1-CL-LFc和pcDNA3.1-CH-HFc按照1:1共转染到CHO-S细胞中，重组表达抗NMP22的C端抗体AntiNMP22_C(图7)。
注：
图5中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-CL-LFc Plasmid；
Lane 2:CL
图6中Lane M:DNA Marker；
Lane 1：pcDNA3.1-CH-HFc Plasmid；
Lane 2:CH
图7中Lane M：Marker；
Lane 1：AntiNMP22_C
实施例4
抗体对参与化学发光试剂盒制备和验证
按照现有化学发光法诊断试剂生产工艺，将本发明中AntiNMP22_C作为捕获抗体进行包被配置成NMP22包被板，将本发明中AntiNMP22_N标记作为结合抗体进行配置成NMP22酶结合物，将NMP22抗原配置成系列校准品(0U/ml、5U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml)形成一套完整试剂盒并对其进行一系列验证。
参照YY/T1175-2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学发光法行业标准以及参考市场上现有NMP22试剂盒厂家的技术要求，制定对NMP22免洗检测试剂的性能验证指标
1.性能指标
1.1最低检测限
应不高于4U/ml。
1.2剂量-反应曲线的线性
在线性区间0U/ml～100U/ml内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。
1.3准确度
以试剂盒检测回收率，应在0.85-1.15范围内。
1.4精密度
精密度(CV)应不大于10％。
2.检验方法
2.1最低检测限
平行测定20孔零校准品(0U/ml)的相对发光强度，计算发光值平均值x和标准偏差SD，用剂量-反应曲线计算发光值为x+2×SD时对应的浓度值即为最低检出限，结果应符合1.1要求。
2.2剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的参考品(S0-S5，浓度依次为0U/ml、5U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml)，用四参数进行拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)应符合1.2要求。
2.3准确度
将NMP22抗原配制成标准溶液(80U/ml)按体积比为1：9加入到已知浓度的低值样本(2-5U/ml)中，在试剂盒上进行检测，根据公式(1)计算回收率R，结果应符合1.3的规定。
Figure BDA0002664340020000101
式中：R——回收率；
V——加入标准溶液的体积；
V0——低值样本的体积；
C——低值样本加入标准溶液后的检测浓度；
C0——低值样本的检测浓度；
Cs——标准溶液的浓度。
2.4精密度
平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔，分别按照公式计算CV，结果应符合1.4的规定。
Figure BDA0002664340020000102
式中：
Figure BDA0002664340020000103
—质控品测定浓度值的平均值
SD—质控品测定浓度值的标准差
3.实验配置
3.1 NMP22包被板配置
将AntiNMP22_C作为捕获抗体，加入到包被缓冲液(0.05mol PBS)，按照1ug/ml比例加入。每个空白发光板板孔加入100ul，4℃过夜，取出，用洗板洗涤液(0.9％NaCl)洗涤2次，加入每孔200ul封闭液(0.5mol PBS+1％BSA+2.5％蔗糖)，4℃过夜，取出，弃掉板中液体，干燥后制成NMP22包被板。
3.2 NMP22酶结合物配置
将AntiNMP22_N作为结合抗体，加入到酶稀释液(50Mmol Tris+1％BSA)，按照1/2000比例加入。
3.3校准品配置
将NMP22抗原(久丰润达，20191221，3KU/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释6个梯度(0U/ml、5U/ml、10U/ml、25U/ml、50U/ml、100U/ml)
3.4回收率标准溶液配置
将NMP22抗原(久丰润达，20191221，3KU/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释到80U/ml，作为标准溶液，选取2-5U/ml正常人血清作为低值样本
3.5质控品配置
将NMP22抗原(久丰润达，20191221，3KU/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释成QC1(20U/ml±10％),QC2(65U/ml±10％)
4、加样操作
(1)分别取上述配置的3.3-3.5NMP22校准品、回收率标本，质控品及特异性样本各100μl加入上述配置的3.1相应包被板板孔内，振荡器振荡30秒钟，使其充分混合均匀
(2)盖上封板膜，置37℃温育30分钟
(3)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次
(4)取上述配置的3.2 NMP22酶结合物100μL加入各孔，振荡器振荡30秒钟
(5)盖上封板膜，置37℃温育30分钟
(6)取出，用应用洗涤液(0.5mol PBS+0.025％T-20)洗板3次
(7)每孔加入底物液100ul(购买自ThermoFisher T2142)
(8)用中生百克BHP9504化学发光仪检测化学发光强度(RLU)
5、性能指标验证结果
5.1最低检测限
表2
Figure BDA0002664340020000121
由表2可知，最低检测限为1.392U/ml,不高于4U/ml，符合指标。
5.2剂量-反应曲线的线性
表3
第一次测 第二次测 第三次测
线性相关系数R 1.0000 0.9996 0.9998
由表3、图9、图10和图11可知，连续三次测定0-100U/ml浓度范围NMP22抗原曲线，线性相关系数r均大于0.9990，符合指标。
5.3准确度
表4
CS(pmol/L) C0(pmol/L) 样本C发光值 C(pmol/L) 回收率(％)
80 3.3 220010 11.3 104.13
由表4可知，试剂盒检测回收率，在0.85-1.15范围内，符合指标。
5.4精密度
表5
Figure BDA0002664340020000131
由表5可知，连续三次平行测定QC1 QC2，结果均不大于10％要求，符合指标。
由上可知，NMP22试剂盒的剂量-反应曲线，准确性，均一性等性能指标均符合现有技术要求
实施例5
本发明抗体试剂盒与市场现有试剂盒的对比试验
随机选取40份人标本，用本发明抗体制成试剂盒及市场现有NMP22试剂盒对以上标本进行检测，对比相关性
40份人标本对比结果如下：
表6
本发明 对照试剂 本发明 对照试剂 本发明 对照试剂 本发明 对照试剂
1 8.85 8.07 11 7.22 7.40 21 50.70 51.99 31 5.03 5.16
2 2.42 2.56 12 2.49 2.63 22 6.95 6.34 32 3.30 3.49
3 6.01 5.98 13 9.90 9.03 23 1.68 1.67 33 0.81 0.80
4 40.09 36.58 14 83.85 83.39 24 5.30 5.60 34 3.80 3.89
5 2.61 2.59 15 7.31 7.72 25 2.73 2.49 35 6.10 5.56
6 3.33 3.42 16 5.61 5.75 26 2.80 2.88 36 1.91 1.96
7 7.54 6.88 17 1.61 1.47 27 10.83 10.79 37 9.87 9.83
8 43.55 43.31 18 6.93 7.32 28 6.58 6.95 38 1.91 1.90
9 10.31 10.57 19 9.59 9.54 29 2.01 2.07 39 7.35 6.70
10 6.65 6.62 20 1.35 1.42 30 9.86 10.12 40 8.87 9.37
由表6、图9所示，本发明检测浓度结果与市场已有试剂盒检测浓度结果相关性R2为0.9983。
由上可知，临床样本检测结果基于本发明制成试剂与市场现有化学发光法检测试剂检测结果相符。
实施例6
NMP22的序列见SEQ ID NO:1。因为NMP22的抗原较大，抗原制备的难度较大。同时，截止目前，还没有针对NMP22临床检测的配对抗体报道。本发明创造性的选择NMP22抗原进行分成N端(SEQ ID NO:2)和C端(SEQ ID NO:3)两段序列。并用这两段序列分别免疫小鼠，筛选到高特异性和高灵敏性的抗体对AntiNMP22_N和AntiNMP22_C。
在第一实施方案中，本发明提供了NMP22抗体对的核心序列(抗体对重轻链的可变区)。其中AntiNMP22_N的轻链序列中的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和重链序列中的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10是NMP22抗原N端表位(SEQ ID NO:2)结合的关键位置。AntiNMP22_C的轻链序列中的SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和重链序列中的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20是NMP22抗原C端表位(SEQ IDNO:3)结合的关键位置。
本发明的抗体对中的抗体可以是Fab片段；可以是F(ab’)2片段；可以是Fab’片段；可以是scFv片段；可以是di-scFv片段。
本发明的抗体对中的抗体是单克隆抗体。
本发明的抗体对中的抗体是IgG型抗体。
本发明的抗体对是鼠抗体或鼠源的抗体。
本发明抗体对中的抗体AntiNMP22_N是捕获抗体，AntiNMP22_C是标记抗体，可进一步与可检测标记偶联。
本发明的抗体对中的抗体AntiNMP22_C的可检测标志半酶或酶或荧光基团或者放射性同位素。
本发明的抗体用于检测样品中NMP22(SEQ ID NO:1)的存在，所述样品根据一个实施方案是生物学样品，优选为尿液。
本发明的抗体对，通过夹心法免疫学方法检测NMP22(SEQ ID NO:1)是否存在。本实施类中选择化学发光方法学检测。因此，可以精确的检测生物样本中NMP22的含量。
本发明的抗体对AntiNMP22_N和AntiNMP22_C，通过化学放光方法检测NMP22的存在和表达。
本发明的体外方法中使用的样品源自患有以下或具有以下风险的对象：膀胱炎，膀胱癌。
本发明涉及本发明的抗体对AntiNMP22_N和AntiNMP22_C在检测样品中NMP22表达的用途。
本发明提供了表达AntiNMP22的表达载体pCDNA3.1-AntiNMP22_NL和pCDNA3.1-AntiNMP22_NH，其包含编码本发明的抗体AntiNMP22_N的重链和轻链多核苷酸。
本发明提供了表达AntiNMP22的表达载体pCDNA3.1-AntiNMP22_CL和pCDNA3.1-AntiNMP22_CH，其包含编码本发明的抗体AntiNMP22_C的重链和轻链多核苷酸。
本发明公开的表达载体，其用于产生本发明的抗体对AntiNMP22_N和AntiNMP22_C。
本发明提供至少一种宿主细胞，其包含至少2种根据本发明的表达载体。
本发明提供至少一种根据本发明的宿主细胞，其用于制备本发明的抗体对。
本发明提供诊断膀胱部疾病的方法，其包括以下步骤：使用如上公开的本发明的抗体对AntiNMP22_N(作为捕获抗体)和AntiNMP22_C(作为结合抗体)，采用化学发光检测方法来检测患者样品中NMP22的表达情况。如果NMP22含量大于10U/ml，则提示膀胱癌风险。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 廊坊天光生物技术有限公司
<120> 一种NMP22抗体对及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Met Thr Leu His Ala Thr Arg Gly Ala Ala Leu Leu Ser Trp Val Asn
1 5 10 15
Ser Leu His Val Ala Asp Pro Val Glu Ala Val Leu Gln Leu Gln Asp
20 25 30
Cys Ser Ile Phe Ile Lys Ile Ile Asp Arg Ile His Gly Thr Glu Glu
35 40 45
Gly Gln Gln Ile Leu Lys Gln Pro Val Ser Glu Arg Leu Asp Phe Val
50 55 60
Cys Ser Phe Leu Gln Lys Asn Arg Lys His Pro Ser Ser Pro Glu Cys
65 70 75 80
Leu Val Ser Ala Gln Lys Val Leu Glu Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala
85 90 95
Lys Met Thr Met Leu Leu Leu Tyr His Ser Thr Met Ser Ser Lys Ser
100 105 110
Pro Arg Asp Trp Glu Gln Phe Glu Tyr Lys Ile Gln Ala Glu Leu Ala
115 120 125
Val Ile Leu Lys Phe Val Leu Asp His Glu Asp Gly Leu Asn Leu Asn
130 135 140
Glu Asp Leu Glu Asn Phe Leu Gln Lys Ala Pro Val Pro Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ser Thr Phe Pro Glu Glu Leu Ser Pro Pro Ser His Gln Ala Lys
165 170 175
Arg Glu Ile Arg Phe Leu Glu Leu Gln Lys Val Ala Ser Ser Ser Ser
180 185 190
Gly Asn Asn Phe Leu Ser Gly Ser Pro Ala Ser Pro Met Gly Asp Ile
195 200 205
Leu Gln Thr Pro Gln Phe Gln Met Arg Arg Leu Lys Lys Gln Leu Ala
210 215 220
Asp Glu Arg Ser Asn Arg Asp Glu Leu Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn
225 230 235 240
Arg Lys Leu Leu Thr Glu Lys Asp Ala Gln Ile Ala Met Met Gln Gln
245 250 255
Arg Ile Asp Arg Leu Ala Leu Leu Asn Glu Lys Gln Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Leu Glu Pro Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Asp Lys Asn Glu Ser Leu
275 280 285
Thr Met Arg Leu His Glu Thr Leu Lys Gln Cys Gln Asp Leu Lys Thr
290 295 300
Glu Lys Ser Gln Met Asp Arg Lys Ile Asn Gln Leu Ser Glu Glu Asn
305 310 315 320
Gly Asp Leu Ser Phe Lys Leu Arg Glu Phe Ala Ser His Leu Gln Gln
325 330 335
Leu Gln Asp Ala Leu Asn Glu Leu Thr Glu Glu His Ser Lys Ala Thr
340 345 350
Gln Glu Trp Leu Glu Lys Gln Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Ser Ala
355 360 365
Ala Leu Gln Asp Lys Lys Cys Leu Glu Glu Lys Asn Glu Ile Leu Gln
370 375 380
Gly Lys Leu Ser Gln Leu Glu Glu His Leu Ser Gln Leu Gln Asp Asn
385 390 395 400
Pro Pro Gln Glu Lys Gly Glu Val Leu Gly Asp Val Leu Gln Leu Glu
405 410 415
Thr Leu Lys Gln Glu Ala Ala Thr Leu Ala Ala Asn Asn Thr Gln Leu
420 425 430
Gln Ala Arg Val Glu Met Leu Glu Thr Glu Arg Gly Gln Gln Glu Ala
435 440 445
Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly His Phe Glu Glu Glu Lys Gln Gln Leu
450 455 460
Ser Ser Leu Ile Thr Asp Leu Gln Ser Ser Ile Ser Asn Leu Ser Gln
465 470 475 480
Ala Lys Glu Glu Leu Glu Gln Ala Ser Gln Ala His Gly Ala Arg Leu
485 490 495
Thr Ala Gln Val Ala Ser Leu Thr Ser Glu Leu Thr Thr Leu Asn Ala
500 505 510
Thr Ile Gln Gln Gln Asp Gln Glu Leu Ala Gly Leu Lys Gln Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Lys Gln Ala Gln Leu Ala Gln Thr Leu Gln Gln Gln Glu Gln
530 535 540
Ala Ser Gln Gly Leu Arg His Gln Val Glu Gln Leu Ser Ser Ser Leu
545 550 555 560
Lys Gln Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Val Ala Glu Lys Gln Glu Ala
565 570 575
Thr Arg Gln Asp His Ala Gln Gln Leu Ala Thr Ala Ala Glu Glu Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Leu Arg Glu Arg Asp Ala Ala Leu Lys Gln Leu Glu Ala
595 600 605
Leu Glu Lys Glu Lys Ala Ala Lys Leu Glu Ile Leu Gln Gln Gln Leu
610 615 620
Gln Val Ala Asn Glu Ala Arg Asp Ser Ala Gln Thr Ser Val Thr Gln
625 630 635 640
Ala Gln Arg Glu Lys Ala Glu Leu Ser Arg Lys Val Glu Glu Leu Gln
645 650 655
Ala Cys Val Glu Thr Ala Arg Gln Glu Gln His Glu Ala Gln Ala Gln
660 665 670
Val Ala Glu Leu Glu Leu Gln Leu Arg Ser Glu Gln Gln Lys Ala Thr
675 680 685
Glu Lys Glu Arg Val Ala Gln Glu Lys Asp Gln Leu Gln Glu Gln Leu
690 695 700
Gln Ala Leu Lys Glu Ser Leu Lys Val Thr Lys Gly Ser Leu Glu Glu
705 710 715 720
Glu Lys Arg Arg Ala Ala Asp Ala Leu Glu Glu Gln Gln Arg Cys Ile
725 730 735
Ser Glu Leu Lys Ala Glu Thr Arg Ser Leu Val Glu Gln His Lys Arg
740 745 750
Glu Arg Lys Glu Leu Glu Glu Glu Arg Ala Gly Arg Lys Gly Leu Glu
755 760 765
Ala Arg Leu Gln Gln Leu Gly Glu Ala His Gln Ala Glu Thr Glu Val
770 775 780
Leu Arg Arg Glu Leu Ala Glu Ala Met Ala Ala Gln His Thr Ala Glu
785 790 795 800
Ser Glu Cys Glu Gln Leu Val Lys Glu Val Ala Ala Trp Arg Glu Arg
805 810 815
Tyr Glu Asp Ser Gln Gln Glu Glu Ala Gln Tyr Gly Ala Met Phe Gln
820 825 830
Glu Gln Leu Met Thr Leu Lys Glu Glu Cys Glu Lys Ala Arg Gln Glu
835 840 845
Leu Gln Glu Ala Lys Glu Lys Val Ala Gly Ile Glu Ser His Ser Glu
850 855 860
Leu Gln Ile Ser Arg Gln Gln Asn Glu Leu Ala Glu Leu His Ala Asn
865 870 875 880
Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gln Val Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Gln
885 890 895
Lys Leu Ala Asp Asp Leu Ser Thr Leu Gln Glu Lys Met Ala Ala Thr
900 905 910
Ser Lys Glu Val Ala Arg Leu Glu Thr Leu Val Arg Lys Ala Gly Glu
915 920 925
Gln Gln Glu Thr Ala Ser Arg Glu Leu Val Lys Glu Pro Ala Arg Ala
930 935 940
Gly Asp Arg Gln Pro Glu Trp Leu Glu Glu Gln Gln Gly Arg Gln Phe
945 950 955 960
Cys Ser Thr Gln Ala Ala Leu Gln Ala Met Glu Arg Glu Ala Glu Gln
965 970 975
Met Gly Asn Glu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Ala Leu Met Glu Ser Gln
980 985 990
Gly Gln Gln Gln Glu Glu Arg Gly Gln Gln Glu Arg Glu Val Ala Arg
995 1000 1005
Leu Thr Gln Glu Arg Gly Arg Ala Gln Ala Asp Leu Ala Leu Glu Lys
1010 1015 1020
Ala Ala Arg Ala Glu Leu Glu Met Arg Leu Gln Asn Ala Leu Asn Glu
1025 1030 1035 1040
Gln Arg Val Glu Phe Ala Thr Leu Gln Glu Ala Leu Ala His Ala Leu
1045 1050 1055
Thr Glu Lys Glu Gly Lys Asp Gln Glu Leu Ala Lys Leu Arg Gly Leu
1060 1065 1070
Glu Ala Ala Gln Ile Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Gln Thr Val Lys
1075 1080 1085
Gln Leu Lys Glu Gln Leu Ala Lys Lys Glu Lys Glu His Ala Ser Gly
1090 1095 1100
Ser Gly Ala Gln Ser Glu Ala Ala Gly Arg Thr Glu Pro Thr Gly Pro
1105 1110 1115 1120
Lys Leu Glu Ala Leu Arg Ala Glu Val Ser Lys Leu Glu Gln Gln Cys
1125 1130 1135
Gln Lys Gln Gln Glu Gln Ala Asp Ser Leu Glu Arg Ser Leu Glu Ala
1140 1145 1150
Glu Arg Ala Ser Arg Ala Glu Arg Asp Ser Ala Leu Glu Thr Leu Gln
1155 1160 1165
Gly Gln Leu Glu Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly His Ser Gln Ser Ala
1170 1175 1180
Leu Ala Ser Ala Gln Arg Glu Leu Ala Ala Phe Arg Thr Lys Val Gln
1185 1190 1195 1200
Asp His Ser Lys Ala Glu Asp Glu Trp Lys Ala Gln Val Ala Arg Gly
1205 1210 1215
Arg Gln Glu Ala Glu Arg Lys Asn Ser Leu Ile Ser Ser Leu Glu Glu
1220 1225 1230
Glu Val Ser Ile Leu Asn Arg Gln Val Leu Glu Lys Glu Gly Glu Ser
1235 1240 1245
Lys Glu Leu Lys Arg Leu Val Met Ala Glu Ser Glu Lys Ser Gln Lys
1250 1255 1260
Leu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Leu Gln Ala Glu Thr Ala Ser Asn Ser
1265 1270 1275 1280
Ala Arg Ala Ala Glu Arg Ser Ser Ala Leu Arg Glu Glu Val Gln Ser
1285 1290 1295
Leu Arg Glu Glu Ala Glu Lys Gln Arg Val Ala Ser Glu Asn Leu Arg
1300 1305 1310
Gln Glu Leu Thr Ser Gln Ala Glu Arg Ala Glu Glu Leu Gly Gln Glu
1315 1320 1325
Leu Lys Ala Trp Gln Glu Lys Phe Phe Gln Lys Glu Gln Ala Leu Ser
1330 1335 1340
Thr Leu Gln Leu Glu His Thr Ser Thr Gln Ala Leu Val Ser Glu Leu
1345 1350 1355 1360
Leu Pro Ala Lys His Leu Cys Gln Gln Leu Gln Ala Glu Gln Ala Ala
1365 1370 1375
Ala Glu Lys Arg His Arg Glu Glu Leu Glu Gln Ser Lys Gln Ala Ala
1380 1385 1390
Gly Gly Leu Arg Ala Glu Leu Leu Arg Ala Gln Arg Glu Leu Gly Glu
1395 1400 1405
Leu Ile Pro Leu Arg Gln Lys Val Ala Glu Gln Glu Arg Thr Ala Gln
1410 1415 1420
Gln Leu Arg Ala Glu Lys Ala Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ser Met Leu
1425 1430 1435 1440
Lys Lys Ala His Gly Leu Leu Ala Glu Glu Asn Arg Gly Leu Gly Glu
1445 1450 1455
Arg Ala Asn Leu Gly Arg Gln Phe Leu Glu Val Glu Leu Asp Gln Ala
1460 1465 1470
Arg Glu Lys Tyr Val Gln Glu Leu Ala Ala Val Arg Ala Asp Ala Glu
1475 1480 1485
Thr Arg Leu Ala Glu Val Gln Arg Glu Ala Gln Ser Thr Ala Arg Glu
1490 1495 1500
Leu Glu Val Met Thr Ala Lys Tyr Glu Gly Ala Lys Val Lys Val Leu
1505 1510 1515 1520
Glu Glu Arg Gln Arg Phe Gln Glu Glu Arg Gln Lys Leu Thr Ala Gln
1525 1530 1535
Val Glu Gln Leu Glu Val Phe Gln Arg Glu Gln Thr Lys Gln Val Glu
1540 1545 1550
Glu Leu Ser Lys Lys Leu Ala Asp Ser Asp Gln Ala Ser Lys Val Gln
1555 1560 1565
Gln Gln Lys Leu Lys Ala Val Gln Ala Gln Gly Gly Glu Ser Gln Gln
1570 1575 1580
Glu Ala Gln Arg Leu Gln Ala Gln Leu Asn Glu Leu Gln Ala Gln Leu
1585 1590 1595 1600
Ser Gln Lys Glu Gln Ala Ala Glu His Tyr Lys Leu Gln Met Glu Lys
1605 1610 1615
Ala Lys Thr His Tyr Asp Ala Lys Lys Gln Gln Asn Gln Glu Leu Gln
1620 1625 1630
Glu Gln Leu Arg Ser Leu Glu Gln Leu Gln Lys Glu Asn Lys Glu Leu
1635 1640 1645
Arg Ala Glu Ala Glu Arg Leu Gly His Glu Leu Gln Gln Ala Gly Leu
1650 1655 1660
Lys Thr Lys Glu Ala Glu Gln Thr Cys Arg His Leu Thr Ala Gln Val
1665 1670 1675 1680
Arg Ser Leu Glu Ala Gln Val Ala His Ala Asp Gln Gln Leu Arg Asp
1685 1690 1695
Leu Gly Lys Phe Gln Val Ala Thr Asp Ala Leu Lys Ser Arg Glu Pro
1700 1705 1710
Gln Ala Lys Pro Gln Leu Asp Leu Ser Ile Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1715 1720 1725
Cys Glu Glu Gly Thr Pro Leu Ser Ile Thr Ser Lys Leu Pro Arg Thr
1730 1735 1740
Gln Pro Asp Gly Thr Ser Val Pro Gly Glu Pro Ala Ser Pro Ile Ser
1745 1750 1755 1760
Gln Arg Leu Pro Pro Lys Val Glu Ser Leu Glu Ser Leu Tyr Phe Thr
1765 1770 1775
Pro Ile Pro Ala Arg Ser Gln Ala Pro Leu Glu Ser Ser Leu Asp Ser
1780 1785 1790
Leu Gly Asp Val Phe Leu Asp Ser Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Arg
1795 1800 1805
Arg Arg Thr Thr Gln Ile Ile Asn Ile Thr Met Thr Lys Lys Leu Asp
1810 1815 1820
Val Glu Glu Pro Asp Ser Ala Asn Ser Ser Phe Tyr Ser Thr Arg Ser
1825 1830 1835 1840
Ala Pro Ala Ser Gln Ala Ser Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Gln Ser
1845 1850 1855
Leu Ala Arg Leu Gly Ser Pro Asp Tyr Gly Asn Ser Ala Leu Leu Ser
1860 1865 1870
Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Thr Thr Arg Ser Ser Ala Arg Arg Ser Gln
1875 1880 1885
Ala Gly Val Ser Ser Gly Ala Pro Pro Gly Arg Asn Ser Phe Tyr Met
1890 1895 1900
Gly Thr Cys Gln Asp Glu Pro Glu Gln Leu Asp Asp Trp Asn Arg Ile
1905 1910 1915 1920
Ala Glu Leu Gln Gln Arg Asn Arg Val Cys Pro Pro His Leu Lys Thr
1925 1930 1935
Cys Tyr Pro Leu Glu Ser Arg Pro Ser Leu Ser Leu Gly Thr Ile Thr
1940 1945 1950
Asp Glu Glu Met Lys Thr Gly Asp Pro Gln Glu Thr Leu Arg Arg Ala
1955 1960 1965
Ser Met Gln Pro Ile Gln Ile Ala Glu Gly Thr Gly Ile Thr Thr Arg
1970 1975 1980
Gln Gln Arg Lys Arg Val Ser Leu Glu Pro His Gln Gly Pro Gly Thr
1985 1990 1995 2000
Pro Glu Ser Lys Lys Ala Thr Ser Cys Phe Pro Arg Pro Met Thr Pro
2005 2010 2015
Arg Asp Arg His Glu Gly Arg Lys Gln Ser Thr Thr Glu Ala Gln Lys
2020 2025 2030
Lys Ala Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gln Ala Asp Arg Arg Gln Ser Met
2035 2040 2045
Ala Phe Ser Ile Leu Asn Thr Pro Lys Lys Leu Gly Asn Ser Leu Leu
2050 2055 2060
Arg Arg Gly Ala Ser Lys Lys Ala Leu Ser Lys Ala Ser Pro Asn Thr
2065 2070 2075 2080
Arg Ser Gly Thr Arg Arg Ser Pro Arg Ile Ala Thr Thr Thr Ala Ser
2085 2090 2095
Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Gly Ala Thr Pro Arg Ala Lys Gly Lys
2100 2105 2110
Ala Lys His
2115
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Pro Val Ser Glu Arg Leu Asp Phe Val Cys Ser Phe Leu Gln Lys Asn
1 5 10 15
Arg Lys His Pro Ser Ser Pro Glu Cys Leu
20 25
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Thr Pro Lys Lys Leu Gly Asn Ser Leu Leu Arg Arg Gly Ala Ser Lys
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ser Lys Ala Ser Pro Asn Thr Arg Ser Gly Thr Arg Arg
20 25 30
Ser Pro Arg Ile Ala
35
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Phe Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Gln Gln Gln Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Gln Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Thr Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Gly
1 5
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Gly Tyr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 12
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
gatattgtga tgactcagac acctagctct ctggcaatga gcgtgggtca gaaggtgact 60
atgaactgta agtcaagcca gtccctgttg aactctagca accaaaagaa ctatctggcc 120
tggtaccagc agaagcccgg tcagagccca aaattgctga tatatttcgc cagtacacgg 180
gaatccggcg ttccagaccg ttttattggt agcgggtccg gcacagactt taccctgact 240
attagctccg tgcaagcaga ggatctggcc gattatttct gtcagcagca gtataacaca 300
cctctgacct tcggtgccgg taccaagctg gagattaag 339
<210> 13
<211> 357
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
cagattcaac tggtgcagag cggacctgaa ctgaaaaagc caggagaaac cgtaaagttg 60
tcctgcaagg cctccggcta cacattcact aatagcggga tgaactgggt caaacaggca 120
ccaggaaagg gattgaagtg gatgggctgg atcaacacat acactggtga acctacttac 180
gccgatgact ttaaaggacg gttcgctttc tctctcgaga cttccgctag tacagcttac 240
ctgcagctga acaacttgcg agccgaggat actgggattt attactgtac ttcaacagga 300
ggctacaatg gatactttaa ctactggggg cagggcacac ttgtcactgt gagtgca 357
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
Asn Ala Lys
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Leu Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 18
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 19
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 20
Ala Arg Val Gly Gly Leu Thr Thr Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 21
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Gln Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Gly Gly Leu Thr Thr Asn Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 22
gatattcaga tgacacagtc tcctgcttct cttagtgctt ccgtgggaga aaccgttact 60
attacttgca gagcatctga gaatatttat tcctatctcg cctggtacca gcagaaacag 120
ggaaagagcc ctcaattgtt ggtgtacaac gctaagaccc tggccgaagg agtgccctcc 180
agatttagcg ggcttggttc cggcacacag tttagcttga aaattaactc actccagcca 240
gaggatttcg ggaactacta ctgtcagcac cattatggaa caccttggac cttcggcggc 300
ggtaccaagc ttgagattaa a 321
<210> 23
<211> 360
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 23
caggtcacat tgaaagaaag tggccctggt attctccagc catcacagac actgtctttg 60
acctgttcct tctccggctt tagtctgtcc acctcaggca tgggagtagg ctggattcgc 120
cagccttctg gaaagggtct tgagtggctt gcccaaatat ggtgggatga tgataaatat 180
tacaacactg ccctgaagag ccgtcttacc attagcaaag acacaagcaa gaatcaggtc 240
tttctgaaga tcgcctccgt cgacacagcc gactccgcta cttactactg cgctcgagtg 300
gggggcttga ccaccaactt cgatgtctgg ggaacaggga ccactgtaac tgtgtctagt 360

Claims (8)

1.一种NMP22抗体对，其特征是：包括与NMP22的N端表位如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_N和与NMP22的C端表位如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相结合的单克隆抗体AntiNMP22_C，
所述AntiNMP22_N包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区，所述AntiNMP22_C包括如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区。
2.根据权利要求1所述的一种NMP22抗体对，其特征是：所述AntiNMP22_N的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:4所示、LCDR2如SEQ ID NO:5所示、LCDR3如SEQ ID NO:6所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_N的重链包含HCDR1如SEQ ID NO:8所示、HCDR2如SEQ ID NO:9所示、HCDR3如SEQ ID NO:10所示三个氨基酸序列，
所述AntiNMP22_C的轻链包含LCDR1如SEQ ID NO:14所示、LCDR2如SEQ ID NO:15所示、LCDR3如SEQ ID NO:16所示三个氨基酸序列，所述AntiNMP22_C的重链包含HCDR1如SEQ IDNO:18所示、HCDR2如SEQ ID NO:19所示、HCDR3如SEQ ID NO:20所示三个氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种NMP22抗体对，其特征是：所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C是IgG型单克隆抗体，所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可以变换成NMP22结合片段Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv。
4.根据权利要求1所述的一种NMP22抗体对，其特征是：所述AntiNMP22_N为捕获抗体，所述AntiNMP22_C抗体为检测抗体。
5.根据权利要求1或4所述的一种NMP22抗体对，其特征是：所述AntiNMP22_C的检测标记是酶、荧光基团、放射性同位素。
6.根据权利要求1所述的一种NMP22抗体对，其特征是：所述AntiNMP22_N、所述AntiNMP22_C可与检测标记蛋白重组表达，所述检测标记蛋白为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶。
7.根据权利要求1或6所述的一种NMP22抗体对，其特征是：通过免疫学检测法方法检测生物样品中NMP22含量，所述免疫学检测方法包括酶联免疫(ELISA)、化学发光检测、蛋白质印迹检测和免疫组化(IHC)检测。
8.一种化学发光检测试剂盒，其特征是：包含与NMP22的N端表位结合的AntiNMP22_N和与MP22的C端表位结合的AntiNMP22_C抗体对，以化学发光检测方法特异性识别AntiNMP22_C，用于检测NMP22的含量。
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