CN112646007B - 用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂,所述组合蛋白为由TBCG_03312蛋白或TBCG_03312蛋白部分氨基酸与Rv1681抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1932抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1956抗原蛋白的B细胞抗原决定簇以及Rv3368c的B细胞抗原决定簇中的任意两个或以上通过软性接头组合形成的组合蛋白。形成的组合蛋白具有更强的敏感性和特异性,将组合蛋白应用于快速检测方法中能够更精确地、更快速针对疑似活动性结核病人的血清进行检测,以快速、准确的辅助对活动性结核病人诊断和治疗,提高结核病患者的治愈率,避免结核病的传播。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫检测技术领域,特别涉及一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂。
背景技术
尽管有90年的疫苗接种和60年的化疗史,结核病仍然是世界上因传染而死亡的主要原因,自2007年以来一直位居单一传染性疾病死因之首。世界卫生组织估计,全球结核潜伏感染人群约17亿,占全人群的1/4左右。2018年约有1040万新发病例,170万人死于结核病。这些新病例中有三分之一(约300万人)仍不为卫生***所知,许多人没有得到适当的治疗。
只要及时诊断和正确治疗,几乎所有的药敏性肺结核患者都能治愈,但从疾病开始诊断到确诊开始治疗之间的时间通常是漫长的,这种延误造成了疾病传播。结核病的临床诊断对于结核病的早发现和早治疗具有重要意义。
随着科学技术的进步,结核分枝杆菌检测技术也有了突飞猛进的发展,新的血清学检测技术、细胞学检测技术(基于流式细胞仪的细胞分型实验、γ-干扰素释放实验)以及基于核酸扩增试验的分子生物学检测技术都在临床上得以应用。不管结核病诊断的新奇和即兴技术的发展如何,病原菌的涂片染色镜检和分离培养依然是活动性结核病的最可靠和首选诊断方法,特别是对于发展中国家的资源限制的情况下。但涂片染色镜检方便但不敏感,国外报道成人结核病病例抗酸染色灵敏度能达到50%,国内报道更低,灵敏度为10-30%。分离培养法检查往往需4-8周或更长的时间,常延误临床的诊断和治疗。因此,快速、准确的辅助检测方法仍然是必要的。
在近年来出现的新的诊断方法中,γ-干扰素释放实验和Xpert-MTB/RIF试验最受关注,Xpert-MTB/RIF是一种自动化的脱氧核糖核酸(DNA)扩增试验,可快速、灵敏地检测结核分枝杆菌和利福平的耐药性。该***集成了样本处理和实时聚合酶链反应,可供相对不熟练的医疗保健工作者使用,并在两小时内提供结果,但这个***非常昂贵,推广困难。γ-干扰素释放实验检测灵敏度高,但用该方法检测时,需要二次刺激,引起免疫记忆细胞反应,不仅是结核患者,凡是感染过结核分枝杆菌的人(包括潜伏感染者和治愈患者),检测结果都是阳性,需要进一步排除。
发明内容
基于此,针对传统的分离培养法检查往往需要较长检测周期,延误临床的诊断和治疗,而γ-干扰素释放实验检测结果需要进一步排除,Xpert-MTB/RIF试验价格昂贵推广困难的技术问题,本发明提出了一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂。
本发明提出的一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,所述组合蛋白为由TBCG_03312蛋白或TBCG_03312蛋白部分氨基酸与Rv1681抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1932抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1956抗原蛋白的B细胞抗原决定簇以及Rv3368c的B细胞抗原决定簇中的任意两个或以上通过软性接头组合形成的组合蛋白。
在其中的一个实施例中,所述TBCG_03312蛋白部分氨基酸为所述TBCG_03312蛋白C端109个氨基酸。
在其中的一个实施例中,所述组合蛋白包括第一组合蛋白和/或第二组合蛋白,所述第一组合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述第二组合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
在其中的一个实施例中,利用所述组合蛋白作为抗原用于制备与所述抗原对应的抗体。
在其中的一个实施例中,所述抗原和/或所述抗体用于制备ELISA检测试剂或金标检测试剂。
本发明还提出了一种用于结核分枝杆菌的检测试剂,所述检测试剂包括如权利要求1至3任意一项所述的组合蛋白。
在其中的一个实施例中,所述检测试剂用于金标检测,所述组合蛋白通过胶体金标记后包被用于金标检测的渗滤板上。
在其中的一个实施例中,所述组合蛋白包括所述第一组合蛋白以及所述第二组合蛋白,所述第一组合蛋白与所述第二组合蛋白的质量比为1:(0.5~1.5)。
在其中的一个实施例中,用于包被的所述第一组合蛋白的浓度为1.0mg/mL~3.0mg/mL,体积为1.0uL~3.0uL;用于包被的所述第二组合蛋白的浓度为1.0mg/mL~3.0mg/mL,体积为1.0uL~3.0uL。
上述用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂,形成组合蛋白的B细胞抗原决定簇存在的抗原蛋白(Rv1681、Rv1932、Rv1956以及Rv3368c)存在于结核病人的尿液,这些抗原蛋白相比于结核病人血清中的其他抗原蛋白具有更好的特异性,与结核病康复患者以及卡介苗接种者血清中的抗原种类不同,其在活动性结核病患者血清中的浓度较高,并且这些抗原蛋白引起人体的保护性免疫反应产生特异性抗体的水平也较高,将这些抗原蛋白通过特定的组合能够使形成的组合蛋白具有更强的敏感性和特异性,将组合蛋白应用于快速检测方法中能够更精确地、更快速针对疑似活动性结核病人的血清进行检测,以快速、准确的辅助对活动性结核病人诊断和治疗,提高结核病患者的治愈率,避免结核病的传播。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明,但并不用于限定本发明。
本发明针对传统的分离培养法检查往往需要较长检测周期,延误临床的诊断和治疗,而γ-干扰素释放实验检测结果需要进一步排除,Xpert-MTB/RIF试验价格昂贵推广困难的技术问题,提出了一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂。
本发明提出的一实施例的用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,组合蛋白为由TBCG_03312蛋白或TBCG_03312蛋白部分氨基酸与Rv1681抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1932抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1956抗原蛋白的B细胞抗原决定簇以及Rv3368c的B细胞抗原决定簇中的任意两个或以上通过软性接头组合形成的组合蛋白。
上述用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,形成组合蛋白的B细胞抗原决定簇存在的抗原蛋白(Rv1681、Rv1932、Rv1956以及Rv3368c)存在于结核病人的尿液,这些抗原蛋白相比于结核病人血清中的其他抗原蛋白具有更好的特异性,与结核病康复患者以及卡介苗接种者血清中的抗原种类不同,其在活动性结核病患者血清中的浓度较高,并且这些抗原蛋白引起人体的保护性免疫反应产生特异性抗体的水平也较高,将这些抗原蛋白通过特定的组合能够使形成的组合蛋白具有更强的敏感性和特异性,将组合蛋白应用于快速检测方法中能够更精确地、更快速针对疑似活动性结核病人的血清进行检测,以快速、准确的辅助对活动性结核病人诊断和治疗,提高结核病患者的治愈率,避免结核病的传播。
虽然传统的研究认为,结核分枝杆菌抗原与其他细菌抗原有一定交叉,病人治愈后抗体可能长期存在,广泛的卡介苗接种也会有产生抗体,导致活动性结核病人抗体的检测特异性较差。但是,本发明研究表明,结核病人治愈一年后,体内结核抗体水平与正常人基本一致;卡介苗接种后,接种者体内抗结核抗体水平也没有明显变化。
抗体检测与γ-干扰素释放检测方法相比,不需要二次刺激引起免疫记忆细胞反应能够避免所有感染过结核分枝杆菌的人群(包括治愈的人和潜伏感染者)的检测结果都是阳性的错误检测结果,能够通过检测结果确定真正的活动性结核患者。并且从理论上来说,只有活动性结核患者体内抗结核抗体水平才明显升高,血清学抗体的检测可用于诊断活动性结核。
本发明选用的抗原蛋白Rv1681、Rv1932、Rv1956、Rv3368c以及TBCG_03312都是从结核病患者尿液中检测得到的抗原蛋白,这些蛋白经过血液循环才能进入尿液内,从而能够推定这些抗原蛋白在血液中的浓度较高,并且研究发现这些抗原蛋白引起人体的保护性免疫反应产生特异性抗体水平也较高,能够用于进行活动性结合病人血清中抗体的检测。本发明进一步通过不同的分子生物学软件分析这些抗原蛋白的B细胞抗原决定簇,将从这些抗原蛋白上选定的决定簇通过如GGGGSGGGGS这样的软性接头连接起来,从而能够形成组合蛋白,相比于单一完整蛋白抗原,本发明的组合蛋白具有更高检测的灵敏度和特异性。
基于该组合蛋白进行结合分枝杆菌抗体检测,灵敏度高,操作简单,检测快速、省时,特异性强,并且能够区分是因为接种卡介苗、以及与环境中多种非结核分枝杆菌接触而造成的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染,可广泛用于临床结核病的临床血清学诊断。
作为一种可选实施方式,TBCG_03312蛋白部分氨基酸为TBCG_03312蛋白C端109个氨基酸。
优选的,组合蛋白包括第一组合蛋白和/或第二组合蛋白,第一组合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;第二组合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明通过计算机软件等手段研究由TBCG_03312蛋白或TBCG_03312蛋白部分氨基酸与Rv1681抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1932抗原蛋白的B细胞抗原决定簇、Rv1956抗原蛋白的B细胞抗原决定簇以及Rv3368c的B细胞抗原决定簇中的任意两个或以上通过软性接头组合形成的组合蛋白的空间结构,创造性地发现其中2个组合蛋白的空间结构尤其适合进行抗体检测,即如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列以及如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过体外表达、纯化获得的组合蛋白进行结核分枝杆菌的抗体检测效果更为优异。
上述第一组合蛋白和第二组合蛋白的编码基因两端均含有限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点,在制备过程中,可将合成的基因片段通过内切酶NdeⅠ、XhoⅠ从克隆载体上切下,克隆到表达载体上,诱导表达。
具体可选地,上述组合蛋白的制备方法为:
合成目标基因,通过内切酶NdeⅠ、XhoⅠ从克隆载体上将目标基因片段切下,克隆到表达载体PET28b上,诱导表达;
采用chelating sephrose凝胶纯化表达蛋白。
作为一种可选实施方式,利用组合蛋白作为抗原用于制备与抗原对应的抗体。进一步可选的,抗原和/或抗体用于制备ELISA检测试剂或金标检测试剂。
本发明的组合蛋白可为包被抗原,用于制备结核分枝杆菌抗体ELISA(间接法)检测试剂。本发明通过组合蛋白制备的抗体也可作为包被抗体,用于制备结核分枝杆菌抗原ELISA(双抗体夹心法)检测试剂。
本发明的第二大方面提出了一种用于结核分枝杆菌的检测试剂,检测试剂包括上述的组合蛋白。
可选的,检测试剂用于金标检测,组合蛋白通过胶体金标记后包被用于金标检测的渗滤板上。本发明的组合蛋白通过包被制备成渗滤板,进而通过金标渗滤法进行血清中抗体的检测,具有快速、易操作的特点,不需要人员培训及昂贵的仪器设备,便于临床推广应用,对于结核病检测,确诊具有重要意义,可广泛用于临床结核病的临床血清学诊断。
进一步可选的,组合蛋白包括第一组合蛋白以及第二组合蛋白,第一组合蛋白与第二组合蛋白的质量比为1:(0.5~1.5)。
可选的,用于包被的第一组合蛋白的浓度为1.0mg/mL~3.0mg/mL,体积为1.0uL~3.0uL;用于包被的第二组合蛋白的浓度为1.0mg/mL~3.0mg/mL,体积为1.0uL~3.0uL。优选的,用于包被的第一组合蛋白的浓度为2.0mg/mL,体积为2.0uL;用于包被的第二组合蛋白的浓度为2.0mg/mL,体积为2.0uL
实施例1
用于结核分枝杆菌的检测试剂的制备方法如下:
1)、将本发明的第一组合蛋白和第二组合蛋白的合成基因片段从克隆载体上用限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ切下,克隆到表达载体PET28b上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,培养至OD600为0.6时加入IPTG至终浓度为0.1M诱导表达,通过凝胶电泳及Western Blotting进行鉴定分析;
2)、采用凝胶(Pharmacia公司chelating sephrose fast flow生产),经过金属鏊合层析来纯化表达蛋白;
3)、将人IgG(购买自天根生物公司)采用标准的免疫程序免疫家兔,制备兔免疫人IgG抗体(还可包括IgM、IgA);
4)、通过柠檬酸还原法制备胶体金;即0.01%氯化金水溶液100mL加热煮沸,磁力搅拌下加入1%柠檬酸三钠水溶液4mL,继续加热煮沸使溶液呈亮红色为止;冷却后调pH至5.8,按每mL胶体金加6ug兔抗人IgG抗体的比例,将二者混合,加入适量聚乙而醇,然后高速离心纯化;
5)、经方阵滴定,确定第一组合蛋白和第二组合蛋白的浓度均为2mg/mL,等量混合后,取2uL滴在纤维素滤膜上,并取2mg/mL的兔抗人IgG 1uL滴在纤维素滤膜上,制备金标渗滤板。
6)、配备封闭缓冲液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL缓冲液,含1%BSA,0.05%Tween-20),洗涤缓冲液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL缓冲液,0.05%Tween-20)。
用于结核分枝杆菌的检测试剂的检测方法如下:
取上述金标渗滤板一块,加封闭液2-4滴,待封闭液完全渗干后,加入病人血清2-4滴,待血清完全渗干后,加入洗涤缓冲液2-4滴,待洗涤缓冲液完全渗干后,加入金标二抗2-4滴,二抗渗干后,加入洗涤缓冲液2-4滴,等5-10分钟,待左边质控点完全显色后,观察右边点是否显色,若呈红色则为阳性结果,若无点出现则为阴性结果。
采用上述方法制备的用于结核分枝杆菌的检测试剂按照上述检测方法分别检测200份活动性结核病人的血清以及健康人的血清;以结核杆菌抗体诊断盒(市购)分别检测200份活动性结核病人的血清以及健康人的血清作为对比,检测结果如表1所示。
表1不同检测试剂检测不同类型血清的阳性率
由表1的结果可以看出,本发明用于结核分枝杆菌的检测试剂检测结核病人血清中抗体的敏感性为68%,特异性为97.5%,明显高于FD结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒的52%和96%。
实施例2
用于结核分枝杆菌的检测试剂的制备方法如下:
1)、将本发明的第一组合蛋白和第二组合蛋白的合成基因片段从克隆载体上用限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ切下,克隆到表达载体PET28b上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,培养至OD600为0.6时加入IPTG至终浓度为0.1M诱导表达,通过凝胶电泳及Western Blotting进行鉴定分析;
2)、采用凝胶(Pharmacia公司chelating sephrose fast flow生产),经过金属鏊合层析来纯化表达蛋白;
3)、将人IgG(购买自天根生物公司)采用标准的免疫程序免疫家兔,制备兔免疫人IgG抗体(还可包括IgM、IgA);
4)、通过柠檬酸还原法制备胶体金;即0.01%氯化金水溶液100mL加热煮沸,磁力搅拌下加入1%柠檬酸三钠水溶液4mL,继续加热煮沸使溶液呈亮红色为止;冷却后调pH至5.8,按每mL胶体金加6ug兔抗人IgG抗体的比例,将二者混合,加入适量聚乙而醇,然后高速离心纯化;
5)、经方阵滴定,确定第一组合蛋白和第二组合蛋白的浓度均为2mg/mL,等量混合后,取2uL滴在纤维素滤膜上,并取2mg/mL的兔抗人IgG 1uL滴在纤维素滤膜上,制备金标渗滤板。
6)、配备封闭缓冲液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL缓冲液,含1%BSA,0.05%Tween-20),洗涤缓冲液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL缓冲液,0.05%Tween-20);
7)、在结核分枝杆菌金标渗滤抗体检测试剂的基础上,配备银染液(乙酸银0.11%,对苯二酚0.35%,***树胶7.14%)试剂;制备结核分枝杆菌金标渗滤(银加强)抗体检测试剂。
用于结核分枝杆菌的检测试剂的检测方法如下:
取上述金标渗滤板一块,加封闭液2-4滴,待封闭液完全渗干后,加入病人血清2-4滴,待血清完全渗干后,加入洗涤缓冲液2-4滴,待洗涤缓冲液完全渗干后,加入金标二抗2-4滴,二抗渗干后,加入洗涤缓冲液2-4滴,等5-10分钟,待左边质控点完全显色后,观察右边点是否显色,若呈红色则为阳性结果,若无点出现则为阴性结果。
采用上述方法制备的用于结核分枝杆菌的检测试剂按照上述检测方法分别检测200份活动性结核病人的血清以及健康人的血清;以结核杆菌抗体诊断盒(市购)分别检测200份活动性结核病人的血清以及健康人的血清作为对比,检测结果如表1所示。
由表1的结果可以看出,本发明用于结核分枝杆菌的检测试剂检测结核病人血清中抗体的敏感性为71%,特异性为98.9%,明显高于FD结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒的51%和96%。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第八医学中心
<120> 用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白及检测试剂
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catatggtgc gccgcggcca tccgcctgac ccggcaagcg tgttgggccc cgaccggcta 60
cccggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcgccaacg cccggggcta cctcagcggg 120
ccggcgcccg agtaccccga cggcgacacc cgcggcgagc ggatggggcg ggtccgcgat 180
tcggcgacct atctcgccga acacggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcgaacac 240
cgcgacgagc acacgcaaga cgccggagac aaagacggcc gcaccctgcg tgagggcggc 300
ggcggcagcg gcggcggcgg cagctactgc tgcgtctcgt cgtcaccaag caccccgcat 360
cgcgaactgg gggcggagcg gatcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagccggctc 420
tcctcttatc ggggctccgc acgggaccac caggtccggg tgggtgcaga caaggaaatc 480
ctgtagctcg ag 492
<210> 2
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catatgggcg atctgggggt gatcagcagc gaccagttcc ggggtaagtc cgtgggcggc 60
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcccgcga ttcggcgacc tatctcgccg aacacatgca 120
ccgggcgccg gtgctgctga tcccctgcct gaaaggccgg gaagacgagt cggcggtggg 180
tggcgtgtcg ttttgggcct cactgttccc ggcggtgtgg agcttctgcc tggcgttgcg 240
ctcccgcggg ctgggttcgt gctggacgac gctgcacctg ctcgacaacg gcgagcacaa 300
ggtggccgac gtgctcggca ttccctacga cgaatacagc caaggcgggc tgcttccgat 360
cgcctacaca caaggcatcg acttccggcc ggccaagcgg ctgccggccg atagctcgag 420
Claims (7)
1.一种用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,其特征在于,
所述组合蛋白包括第一组合蛋白和第二组合蛋白,所述第一组合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述第二组合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,其特征在于,利用所述组合蛋白作为抗原用于制备与所述抗原对应的抗体。
3.根据权利要求2所述的用于结核分枝杆菌检测的组合蛋白,其特征在于,所述抗原和/或所述抗体用于制备ELISA检测试剂或金标检测试剂。
4.一种用于结核分枝杆菌的检测试剂,其特征在于,所述检测试剂包括如权利要求1所述的组合蛋白。
5.根据权利要求4所述的用于结核分枝杆菌的检测试剂,其特征在于,所述检测试剂用于金标检测,所述组合蛋白通过胶体金标记后包被用于金标检测的渗滤板上。
6.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌的检测试剂,其特征在于,所述组合蛋白包括所述第一组合蛋白以及所述第二组合蛋白,所述第一组合蛋白与所述第二组合蛋白的质量比为1:(0.5~1.5)。
7.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌的检测试剂,其特征在于,用于包被的所述第一组合蛋白的浓度为1.0 mg/mL~3.0 mg/mL,体积为1.0 uL~3.0 uL;用于包被的所述第二组合蛋白的浓度为1.0 mg/mL~3.0 mg/mL,体积为1.0 uL~3.0 uL。
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