CN112941165A - 一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用,属于生物医药技术领域。本发明为针对妊娠糖尿病相关基因突变进行检测,提供了一种针对妊娠糖尿病多个相关位点的高通量检测方法和相关检测试剂盒,该方法能够同时对一个样本的多个妊娠糖尿病相关基因突变进行分析,具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用,属于生物医药技术领域。
背景技术
妊娠糖尿病(GDM)是妊娠期常见并发症之一,主要表现为妊娠期间不同程度的糖代谢异常。根据一项来自不同国家的多中心前瞻性临床研究显示:GDM的发生率为9.3%-25.5%,即几乎每5个孕妇中就会出现一例GDM患者。中国GDM发病率约为17.5%。GDM常伴发先兆子痫、巨大儿,胎儿发育畸形、围产儿死亡等不良妊娠结局。并且易增加“胎源性疾病”。
迄今,妊娠糖尿病确切病因尚不十分清楚。临床诊断GDM的时间是在妊娠24-28周,通过糖耐试验确定。然而在此时间点诊断,尽管通过积极干预能够改善预后,但在干预前母儿的健康实际上已受到不同程度的影响。因此,GDM的早期筛查十分重要。近年来遗传学研究发现了TCF7L2、GCKR、KCNJ11等致病基因,并且发现这些相关基因的突变与妊娠期糖尿病有一定的相关性。但以往的分子学诊断依赖Sanger测序,而常规的一代测序中每个基因需要多次PCR,DNA用量大,花费高且实验周期长,往往需要逐一检测多个候选基因,在成本与耗时方面不能满足大规模测序的需求。而靶向捕获二代测序技术对于遗传性妊娠糖尿病的分子诊断具有明显优势,弥补了一代测序的缺陷,可实现同时筛查多个样本及同一类疾病的多个致病基因,为妊娠糖尿病的诊断开辟了新的领域。
发明内容
本发明的目的是为解决如何同时筛查多个样本及妊娠糖尿病的多个致病基因的技术问题。
为达到解决上述问题的目的,本发明所采取的技术方案是提供一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂,包括核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物;所述INSR突变是杂合突变;所述INSR突变的突变位置是chr19-7132208,位于外显子14,而且所述突变的碱基变化是c.2803T>C。
本发明提供一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂,包括核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的引物;所述INSR突变是杂合突变;所述INSR突变的突变位置是chr19-7132208,位于外显子14,而且所述突变的碱基变化是c.2803T>C。
本发明提供一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测的高通量检测试剂盒,包括上述的试剂。
优选地,上述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂在制备妊娠糖尿病鉴定、评估或辅助治疗的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供上述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂应用于妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测的方法,包括以下步骤:
步骤1:提取检测对象的基因组DNA,所述基因组DNA样本是从妊娠糖尿病患者血浆中分离的;
步骤2:对提取的基因组DNA进行定量,并取3μg建立文库;
步骤3:对文库进行定量操作;
步骤4:上机测序,所述上机测序通过二代测序平台进行;
步骤5:通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比,最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析,得到致病突变相关信息。
优选地,上述步骤2中建立文库的具体步骤如下:
步骤2.1:将基因组DNA进行片段化;
步骤2.2:将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A;
步骤2.3:将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头,以便进行有效连接产物的富集;
步骤2.4:采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物将连接产物进行PCR扩增,富集有效产物;
步骤2.5:使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获,其中,探针包括捕获INSR的探针,捕获方法为液相探针捕获或固相芯片杂交捕获;
步骤2.6:将捕获的目标片段分离;
步骤2.7:采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增目标片段,同时加上完整接头,获得捕获文库。
优选地,上述步骤1中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
优选地,上述步骤2,步骤3中的定量采取的方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量或电泳法。
优选地,上述步骤2.1中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切或限制性内切酶酶切。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明针对妊娠糖尿病相关基因突变进行检测,提供了一种针对妊娠糖尿病多个相关位点的高通量检测方法,该方法能够同时对一个样本的多个妊娠糖尿病相关基因突变进行分析,具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下:
针对目前妊娠糖尿病致病突变检测的技术现状,本发明提出一种针对妊娠糖尿病突变基因的高通量检测方法和运用该方法的检测试剂盒,该方法能够在一轮测序中检测多个妊娠糖尿病相关致病基因突变位点的突变状况。该方法具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
采用一种高通量检测妊娠糖尿病致病基因突变的方法构建的检测试剂盒,该方法用于非诊断及非治疗目的,包括以下步骤:
步骤1):提取检测对象的基因组DNA;
步骤2):对提取的基因组DNA进行定量,并取3μg建立文库;
步骤3):对文库进行定量操作;
步骤4):上机测序;
步骤5):数据分析得到致病位点相关信息。
其中,所述步骤2)中的建立文库的具体步骤如下:
a)将基因组DNA进行片段化;
b)将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A;
c)将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头,以便进行有效连接产物的富集;
d)将连接产物进行PCR扩增,富集有效产物;
e)使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获;
f)将捕获的目标片段分离;
j)加上完整接头获得捕获文库。
为了进一步优化上述技术方案,本发明所采取的技术措施还包括:
上述步骤1)中的基因组DNA来源于人类。
上述步骤1)中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
上述步骤2)中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
上述步骤a)中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。
上述步骤e)中的探针为针对妊娠糖尿病相关基因、相关突变点设计得到。
上述步骤e)中的探针包括INSR、TCF7L2、GCKR、KCNJ11的至少一种。
上述步骤e)中的捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。
上述步骤3)中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
上述步骤4)中的上机测序通过二代测序平台进行。
上述步骤5)的具体操作如下:通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进性对比,最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析,得到致病突变相关信息。
实施例
本发明提供了一种高通量检测妊娠糖尿病致病基因突变的方法,主要技术流程:提取基因组DNA、文库制备、文库质检定量、上机测序及数据分析。具体如下:
根据本发明的一个实施例,目标基因捕获的方法不受限制。可以使用PCR富集的方法捕获目标基因。根据本发明的一个实施例,可以使用生物素标记的液相探针与待测样品中的目标区域进行杂交,之后使用链霉亲和素标记的磁珠将杂交产物分离出来,最后通过PCR富集目标区域同时在目标区域两侧连接完整的接头,形成文库。由此,可以将目标基因序列从基因组中捕获并富集。
根据本发明的一个实施例,基因组DNA样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例,基因组DNA样本是从受检人的血浆中分离。根据本发明的进一步的实施例,基因组DNA样本是从妊娠糖尿病患者血浆中分离的。由此,可以有效地对妊娠糖尿病患者的基因组DNA样本进行检测。
根据本发明的一个实施例,探针是针对妊娠糖尿病至少4个基因的相关位点进行设计。
根据本发明的一个实施例,使用纯化柱纯化基因组DNA,之后进行凝胶回收电泳,确认DNA质量。
根据本发明的一个实施例,基因组DNA纯化定量之后,取3μg进行DNA片段化,其中使用的片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切、限制性内切酶酶切,优先选用超声破碎。
根据本发明的一个实施例,将片段化DNA进行末端修复及3'末端添加碱基A。
根据本发明的一个实施例,将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头。
根据本发明的一个实施例,将连接产物进行PCR扩增。
根据本发明的一个实施例,将生物素标记探针与富集的样品中的目标区域进行杂交。
根据本发明的一个实施例,使用链霉亲和素标记磁珠将杂交有目标区域DNA的探针捕获下来。
根据本发明的一个实施例,使用PCR富集捕获的目标区域DNA,同时在两端加上完整的文库接头序列。
根据本发明的一个实施例,将文库定量,使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit。
根据本发明的一个实施例,使用以下引物序列进行第一次PCR扩增:
Primer F:
5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ (SEQ ID NO.1)
Primer R:
5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’ (SEQ ID NO.2)
根据本发明的一个实施例,使用Illumina公司通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增,包括一条通用的上游引物,和一条带有标签(Index)序列的下游引物,使用高效的PCR扩增酶进行PCR。使用带有标签(Index)序列的引物进行PCR以后,可以将不同来源的文库进行混合,然后上机测序。
PCR引物序列如下:
TrueSeq Universal Primer:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;(SEQ ID NO.3)
TrueSeq Primer-Index X:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’; (SEQ ID NO.4)
其中,下划线N部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合,从而产生更多的、不同标签的引物,用于不同的文库的区分。
根据本发明的一个实施例,为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行,可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收,纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖胶电泳纯化,优选磁珠纯化。
根据本发明的一个实施例,使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量,其中以Ilumina P5、P7作为引物,使用Illumina phix control kit v3作为标准品。
根据本发明的一个实施例,通过高通量测序平台进行测序,优选Illumina Miseq平台,并进行数据分析,确定是否存在突变。
下面结合实施例1,对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例是采用Miseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测,具体操作步骤如下:
1、按照说明书操作,使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit提取受检人的血浆中的基因组DNA。
2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。
本实施例中,使用Covaris超声破碎仪,按照标准操作,将3μg DNA片段化。
3、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.5:1,用50μl去核酸酶水洗脱,具体操作如下:
4、使用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4 PNK进行末端修复。反应体系如下:
成份 | 体积(μl) |
DNA sample | 48 |
Nuclease-Free water | 35.2 |
10×End Repair Buffer | 10 |
dNTP Mix | 1.6 |
T4 DNA Polymerase | 1 |
Klenow DNA Polymerase | 2 |
T4 Polynucleotide Kinase | 2.2 |
反应条件为:20℃,30min。
5、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.5:1,用32μl洗脱,具体操作如下:
6、使用Exo(-)Klenow酶进行3'端加A碱基。反应体积如下:
反应条件为:37℃,30min。
7、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.5:1,用15μl洗脱,具体操作如下:
8、使用TA DNA连接酶在模板两端加接头序列。反应体系如下:
成份 | 体积(μl) |
DNA sample | 13 |
Nuclease-Free water | 15.5 |
5×T4 DNA Ligase Buffer | 10 |
Adaptor Mix | 10 |
T4 DNA Ligase | 1.5 |
反应条件为:20℃,15min。
9、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.5:1,用32μl洗脱,具体操作如下:
10、对连接产物进行扩增,反应体系如下:
PCR反应条件为:98℃预变性2min;98℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共循环4次;最终72℃延伸10min。由此,获得PCR产物。
备注:
Primer F:
5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’; (SEQ ID NO.1)
Primer R:
5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。 (SEQ ID NO.2)
11、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.5:1,用30μl洗脱,具体操作如下:
12、使用生物素标记的探针与样品杂交,反应如下体系:
成份 | 体积(μl) |
library | 3.4 |
Hybridization buffer | 13 |
Capture Liprary | 7 |
Block Buffer | 5.6 |
反应条件为:95℃,5min变性,之后保持在65℃,16-24h。
13、使用链霉亲和素标记的磁珠,通过生物素与链霉亲和素结合,将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如下:
14、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。反应体系如下:
PCR反应条件为:98℃预变性2min;98℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,共循环12次;最终72℃延伸10min。由此,获得PCR产物。
备注:PCR引物序列如下:
TrueSeq Universal Primer:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;(SEQ ID NO.3)
TrueSeq Primer-Index4:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。 (SEQ ID NO.5)
15、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品,磁珠与样品体积比为1.8:1,用30μl去核酸酶水洗脱,具体操作如下:
16、文库质检定量。
17、上机测序及数据分析。
将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序,以便获得测序结果,具体操作流程详见Miseq操作说明书。
18、数据分析。
Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列,对于illumina Miseq产生的原始数据进行质控以获得高质量DNA序列数据,将reads在人类基因组上进行定位,根据reads定位信息获取原始变异信息,对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点,利用多个数据库对产生的高质量变异位点进行注释,将注释过的变异位点信息更新到APDD(Amplicongene Parkinson Disease Database)中,并使用APDD对变异位点进行进一步注释,配合临床表现对可疑位点进行筛选,对于未找到可疑位点的样本进行CNV(拷贝数据变异)筛选,整理检测报告,
具体结果如下:
根据检测报告和患者其他症状以及其他检测结果,做出最终的诊断结果。
在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文:Deoxyribonucleicacid,缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运行,其碱基排列顺序构成了遗传信息,所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语:“Q-PCR”为实时荧光定量核酸扩增(英文:Real-timeQuantitative PCR)。一种利用荧光检测达到实时检测PCR状况的PCR技术。
在本文中所使用的术语:“read”为每个测得的DNA序列。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展,本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例,可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。
高通量测序技术,例如Miseq测序技术具有以下优势:(1)高灵敏度:高通量测序,例如Miseq的测序通量大,目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据,高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下,使得每条序列获得高的测序深度,所以可以检测到含量更低的突变,同时因其测序深度高,其测序结果也更为可靠。(2)高通量,低成本:利用根据本发明实施例的标签序列,通过一次测序可以检测上万份样本,从而大大降低了成本。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<120> 一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactctctt tccctacacg acgctcttcc gatct 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtactggagt tcagacgtgt gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
Claims (9)
1.一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂,其特征在于:包括核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物;所述INSR突变是杂合突变;所述INSR突变的突变位置是chr19-7132208,位于外显子14,而且所述突变的碱基变化是c.2803T>C。
2.一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂,其特征在于:包括核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的引物;所述INSR突变是杂合突变;所述INSR突变的突变位置是chr19-7132208,位于外显子14,而且所述突变的碱基变化是c.2803T>C。
3.一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测的高通量检测试剂盒,其特征在于:包括权利要求1或2所述的试剂。
4.如权利要求1或2所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂在制备妊娠糖尿病鉴定、评估或辅助治疗的试剂或试剂盒中的应用。
5.如权利要求1或2所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测试剂应用于妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测的方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤1:提取检测对象的基因组DNA,所述基因组DNA样本是从妊娠糖尿病患者血浆中分离的;
步骤2:对提取的基因组DNA进行定量,并取3μg建立文库;
步骤3:对文库进行定量操作;
步骤4:上机测序,所述上机测序通过二代测序平台进行;
步骤5:通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比,最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析,得到致病突变相关信息。
6.如权利要求5所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测方法,其特征在于:所述步骤2中建立文库的具体步骤如下:
步骤2.1:将基因组DNA进行片段化;
步骤2.2:将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A;
步骤2.3:将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头,以便进行有效连接产物的富集;
步骤2.4:采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物将连接产物进行PCR扩增,富集有效产物;
步骤2.5:使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获,其中,探针包括捕获INSR的探针,捕获方法为液相探针捕获或固相芯片杂交捕获;
步骤2.6:将捕获的目标片段分离;
步骤2.7:采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增目标片段,同时加上完整接头,获得捕获文库。
7.如权利要求5所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测方法,其特征在于:所述步骤1中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
8.如权利要求5所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测方法,其特征在于:所述步骤2,步骤3中的定量采取的方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量或电泳法。
9.如权利要求6所述的一种针对妊娠糖尿病致病基因INSR突变的基因检测方法,其特征在于:所述步骤2.1中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切或限制性内切酶酶切。
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