CN112852953A - 检测高尿酸血症相关基因的突变位点的引物、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

检测高尿酸血症相关基因的突变位点的引物、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的引物，包括：用于扩增DNA样品连接产物的引物和用于扩增捕获文库的引物，所述用于扩增DNA样品连接产物的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述的用于扩增捕获文库的引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。本发明还公开了一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒及其检测方法。本发明通过利用分子分型的方法辅助临床诊断，有利于医生选择和研究更具针对性的个性化治疗药物。

Description

检测高尿酸血症相关基因的突变位点的引物、检测试剂盒和 检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种检测高尿酸血症相关基因突变位点的引物、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
高尿酸血症是一组由于尿酸生成增加和/或肾脏和肠的***减少引起的以高尿酸血症为特征的慢性代谢性疾病。血尿酸水平的升高，是导致一系列并发症发生发展的原因。血尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度可在关节局部形成尿酸钠晶体并沉积，诱发局部炎症反应和组织破坏，即痛风；可在肾脏沉积引发急性肾病、慢性间质性肾炎或肾结石，称之为尿酸性肾病。国内外研究表明高尿酸血症和痛风是慢性肾病、高血压、心脑血管疾病及糖尿病等疾病的独立危险因素，是过早死亡的独立预测因子。在全球范围内，高尿酸血症在不同种族中的患病率为2.6％-36％，痛风为0.03％～15.3％。Meta分析显示，中国高尿酸血症的总体患病率为13.3％，痛风为1.1％，已成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病，据推算中国目前有1.8亿的高尿酸血症的患者。近年来，随着人们生活水平的提高、饮食条件的改善，高尿酸血症的患病率呈现明显上升和年轻化趋势。最新的数据显示，中国山东12-18岁中男性高尿酸血症的患病率高达42.3％，其中高尿酸血症的阳性家族史是高尿酸血症发生的重要危险因素。
遗传危险因素和生活方式危险因素共同造成高尿酸血症及痛风的形成，其中大约90％的高尿酸血症和痛风患者是由于尿酸***量减少和尿酸的重吸收增多引起的。GWAS表明ABCG2、SLC17A1和SLC2A9等基因功能缺陷型变异是引起尿酸***障碍的主要遗传因素。SLC17A3编码磷酸钠转运蛋白(NPT4)，其大鼠同源物位于肾近端小管细胞的顶膜。该基因编码的蛋白质与尿酸的转运有关，是有机阴离子转运蛋白，协同转运尿酸***。国外研究也表明该基因基因与尿酸浓度和痛风风险相关。
目前高尿酸血症和痛风最准确的检测方法为关节滑液或痛风石的抽吸物中的尿酸盐晶体检测，但是尿酸盐晶体检测不仅会带给患者创伤和较重的疼感，而且关节滑液的穿刺吸取比较困难。除临床指征外，其他辅助检测包括：影像诊断(常规X线放射，超声，双能CT)，血尿酸检测，尿酸检测。这些检查都需要昂贵的高端设备，费用高，步骤多，耗时长，更重要的是，这些检查需要医学专业人士承担，不可能作为家用辅助诊断和疾病长期监控指标。所以，痛风的分子生物学研究日益受到国内外的重视，需要敏感而特异性的无创性的血清学指标，从分子水平上提高对痛风的检测水平。此外，病理形态相同的高尿酸血症，可能在分子水平上呈现高度异质，因此以致病基因位点为基础提出的高尿酸血症基因分型，能更精确地反应该病的生物学行为，判断预后，并有利于选择和研究更具针对性的个性化治疗药物。
发明内容
本发明针对现有的技术不足，其目的是研究一种可以快速、准确、适于区分高尿酸血症及痛风疾病的临床分子诊断与分型方法，以便于医生对高尿酸血症及痛风相关疾病进行临床分型及指导用药。经研究，本发明的方法可以辅助检测肾脏***不良型高尿酸血症和痛风。因此，本发明的第一个目的是提供一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的引物。本发明的第二个目的是提供一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的引物，包括：用于扩增DNA样品连接产物的引物和用于扩增捕获文库的引物，所述用于扩增DNA样品连接产物的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述的用于扩增捕获文库的引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，所述DNA样品连接产物，其是通过提取人SLC17A3基因组DNA并进行DNA片段化，获得DNA样品，然后将DNA样品依次通过磁珠纯化、末端修复、磁珠纯化、3'端加A碱基、磁珠纯化、两端加接头序列而成。
进一步的，所述捕获文库，其是将DNA样品连接产物依次通过磁珠纯化、与生物素标记的探针杂交、捕获获得。
作为本发明的第二个方面，一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒，包括用于扩增DNA样品连接产物的反应体系和用于扩增捕获文库的反应体系；
所述用于扩增DNA样品连接产物的反应体系包括带有不同序列标签的连接产物文库、无核酸酶水、上述所述的用于扩增DNA样品连接产物的引物、5×PCR Buffer、100mMdNTP Mix、DNA聚合酶；
所述用于扩增捕获文库的反应体系包括捕获文库、无核酸酶水、5×PCR Buffer、上述所述的用于扩增捕获文库的引物、100mM dNTP Mix、DNA聚合酶。
根据本发明，所述用于扩增DNA样品连接产物的反应体系包括带有不同序列标签的连接产物文库15μL、无核酸酶水21μL、上述所述的用于扩增DNA样品连接产物的引物各1.25μL、5×PCR Buffer 10μL、100mM dNTP Mix 0.5μL、DNA聚合酶1μL。
根据本发明，所述的检测试剂盒还包括用于扩增DNA样品连接产物的反应条件，反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共循环4次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物，即获得两端有接头的PCR产物，用作后序步骤的捕获文库。
根据本发明，所述用于扩增捕获文库的反应体系包括捕获文库14μL、无核酸酶水22.5μL、5×PCR Buffer 10μL、上述所述的用于扩增捕获文库的引物各1μL、100mM dNTPMix 0.5μL、DNA聚合酶1μL。
根据本发明，所述的检测试剂盒还包括用于扩增捕获文库的反应条件，反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环12次；最终72℃延伸10min。
作为本发明的第三个方面，一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的检测方法，包括如下步骤：
步骤一、提取人SLC17A3基因组DNA并进行DNA片段化，获得DNA样品，然后将DNA样品依次通过磁珠纯化、末端修复、磁珠纯化、3'端加A碱基、磁珠纯化，获得DNA样品连接产物；接着，以DNA样品连接产物为模板进行PCR扩增；
步骤二、DNA样品连接产物依次通过磁珠纯化、与生物素标记的探针杂交、捕获获得捕获文库，接着以捕获文库为模板进行PCR扩增；
步骤三、将步骤二的PCR扩增产物进行磁珠纯化；然后进行定量，使用Q-PCR进行质检；接着，使用高通量二代测序技术进行末端测序，检测是人SLC17A3基因否存在突变位点c.298G>A、c.1344T>C、c.577T>G中的一个或多个。
作为本发明的第四个方面，一种检测肾脏***不良型高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒的应用，其用于非疾病诊断和治疗目的的检测人SLC17A3基因的基因突变信息来对检测对象进行分子分型，从而确定是否属于尿酸***不良造成的肾脏***不良型高尿酸血症。
根据本发明，所述基因突变信息包括尿酸***关键路径的基因的等位基因检测结果。
本发明的有益效果：通过利用分子分型的方法辅助临床诊断，综合了高尿酸血症及痛风的分子遗传机制及临床发病机制，通过分子分型对患者进行科学的临床分型，有利于医生选择和研究更具针对性的个性化治疗药物。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
实施例1候选基因变异位点的确定
1、样本来源
上海第十人民医院十名痛风患者。
2、方法
SLC17A3基因突变定义为肾脏***不良型，与临床诊断尿酸***不良型对应。本实施例是采用Miseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测，具体操作步骤如下：
1、按照说明书操作，使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit(高纯度PCR模板制备试剂盒)提取受检人的血浆中的基因组DNA。
2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。
本实施例中，使用Covaris超声破碎仪，按照标准操作，将3μg DNA片段化。
3、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用50μL去核酸酶水洗脱，具体操作如表1所示。
表1磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000041
Figure BDA0002971881760000051
4、使用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4 PNK(T4多聚核苷酸激酶)进行末端修复。反应体系如表2所示。
表2反应体系
成份 体积(μL)
DNA sample(DNA样品) 48
Nuclease-Free water(无核酸酶水) 35.2
10×End Repair Buffer(二代测序末端修复反应缓冲液) 10
dNTP Mix(dNTP预混溶液) 1.6
T4 DNA Polymerase(T4 DNA聚合酶) 1
Klenow DNA Polymerase(Klenow DNA聚合酶) 2
T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶) 2.2
反应条件为：20℃，30min。
5、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品(步骤4中的末端修复产物)，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μL洗脱，具体操作如表3所示。
表3磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000052
Figure BDA0002971881760000061
6、使用Exo(-)Klenow酶对步骤5纯化的DNA样品进行3'端加A碱基。反应体系如表4所示。
表4反应体系
成份 体积(μL)
DNA sample(DNA样品) 30
Nuclease-Free water(无核酸酶水) 11
10×Klenow Polymerase Buffer(Klenow聚合酶缓冲液) 5
dATP 1
Exo(-)Klenow酶 3
反应条件为：37℃，30min。
7、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用15μL洗脱，具体操作如表5所示。
表5磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000062
Figure BDA0002971881760000071
8、使用TA DNA连接酶在模板(步骤7纯化的DNA样品)两端加接头序列。反应体系如表6所示。
表6反应体系
Figure BDA0002971881760000072
反应条件为：20℃，15min。
9、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μL洗脱，具体操作如表7所示。
表7磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000081
10、对连接产物进行扩增，反应体系如表8所示。
表8反应体系
Figure BDA0002971881760000082
PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共循环4次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物，即获得两端有接头的PCR产物，用作后序步骤的捕获文库。
其中，引物如下：
Primer F:
5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQ ID NO:1)。
PRIMER R:
5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQ ID NO:2)。
11、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品(步骤10的PCR产物)，磁珠与样品体积比为1.5:1，用30μL洗脱，具体操作如表9所示。
表9磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000091
12、对SLC17A3基因的突变位点进行设计的生物素标记的探针与样品(步骤11纯化的PCR产物)杂交，反应体系如表10所示。
表10反应体系
Figure BDA0002971881760000092
Figure BDA0002971881760000101
其中，library为SLC17A3基因的相关位点进行设计的生物素标记的探针中的至少一种。Capture Liprary为步骤11纯化的PCR产物。
反应条件为：95℃，5min变性，之后保持在65℃，16-24h。
13、使用链霉亲和素标记的磁珠，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如表11所示。
表11步骤
Figure BDA0002971881760000102
14、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。反应体系如表12所示。
表12反应体系
Figure BDA0002971881760000103
Figure BDA0002971881760000111
PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环12次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。
其中，PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；
(SEQ ID NO:3)。
TrueSeq Primer-Index4:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO:4)。
15、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用30μL去核酸酶水洗脱，具体操作如表13所示。
表13磁珠纯化样品的步骤
Figure BDA0002971881760000112
16、文库质检定量。
将上一步得到的文库
Figure BDA0002971881760000122
2.0(Invitrogen)进行定量，使用Q-PCR进行质检。
17、上机测序及数据分析。
将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。具体结果如下：
Figure BDA0002971881760000121
实施例2 SLC17A3变异位点的应用
临床上选择10名痛风患者，参照实施例1中的方法进行基因检测。
结果显示有2名患者发生了SLC17A3基因突变，突变位点为c.298G>A、c.1344T>C。
经临床上诊段，该两名患者为肾脏***不良型，说明采用实施例1的方法获得的突变位点，用于辅助诊断高尿酸血症具有良好的应用前景。
综上所述，本发明的人SLC17A3基因位点的检测方法，可以用于检测人SLC17A3基因否存在突变位点c.298G>A、c.1344T>C、c.577T>G中的一个或多个，从而预测是否存在高尿酸血症，因此可以用于辅助诊断高尿酸血症。进一步的，可以将用于检测人SLC17A3基因否存在突变位点c.298G>A、c.1344T>C、c.577T>G的引物、反应体系制备成检测试剂盒，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。进一步的，还可以将该SLC17A3基因的试剂盒与用于检测其他高尿酸血症相关基因的突变位点的引物制备而成的试剂盒等一同使用，共同辅助诊断高尿酸血症，提高检测结果的准确性。因此，其具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市第十人民医院
上海昂朴生物科技有限公司
<120> 检测高尿酸血症相关基因突变位点的引物、检测试剂盒和检测方法
<130> 211033
<141> 2021-03-11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactctctt tccctacacg acgctcttcc gatct 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtactggagt tcagacgtgt gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64

Claims (9)

1.一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的引物，其特征在于，包括：用于扩增DNA样品连接产物的引物和用于扩增捕获文库的引物，所述用于扩增DNA样品连接产物的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述的用于扩增捕获文库的引物的序列如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述DNA样品连接产物，其是通过提取人SLC17A3基因组DNA并进行DNA片段化，获得DNA样品，然后将DNA样品依次通过磁珠纯化、末端修复、磁珠纯化、3'端加A碱基、磁珠纯化、两端加接头序列而成。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述捕获文库，其是将DNA样品连接产物依次通过磁珠纯化、与生物素标记的探针杂交、捕获获得。
4.一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒，其特征在于，包括用于扩增DNA样品连接产物的反应体系和用于扩增捕获文库的反应体系；
所述用于扩增DNA样品连接产物的反应体系包括带有不同序列标签的连接产物文库、无核酸酶水、如权利要求1-3任一项所述的用于扩增DNA样品连接产物的引物、5×PCRBuffer、100mM dNTP Mix、DNA聚合酶；
所述用于扩增捕获文库的反应体系包括捕获文库、无核酸酶水、5×PCR Buffer、如权利要求1-3任一项所述的用于扩增捕获文库的引物、100mM dNTP Mix、DNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增DNA样品连接产物的反应体系包括带有不同序列标签的连接产物文库15μL、无核酸酶水21μL、上述所述的用于扩增DNA样品连接产物的引物各1.25μL、5×PCR Buffer 10μL、100mM dNTP Mix 0.5μL、DNA聚合酶1μL。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增捕获文库的反应体系包括捕获文库14μL、无核酸酶水22.5μL、5×PCR Buffer 10μL、上述所述的用于扩增捕获文库的引物各1μL、100mM dNTP Mix 0.5μL、DNA聚合酶1μL。
7.一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提取人SLC17A3基因组DNA并进行DNA片段化，获得DNA样品，然后将DNA样品依次通过磁珠纯化、末端修复、磁珠纯化、3'端加A碱基、磁珠纯化，获得DNA样品连接产物；接着，以DNA样品连接产物为模板进行PCR扩增；
步骤二、DNA样品连接产物依次通过磁珠纯化、与生物素标记的探针杂交、捕获获得捕获文库，接着以捕获文库为模板进行PCR扩增；
步骤三、将步骤二的PCR扩增产物进行磁珠纯化；然后进行定量，使用Q-PCR进行质检；接着，使用高通量二代测序技术进行末端测序，检测是人SLC17A3基因否存在突变位点c.298G>A、c.1344T>C、c.577T>G中的一个或多个。
8.一种检测高尿酸血症相关基因的突变位点的检测试剂盒的应用，其特征在于，其用于非疾病诊断和治疗目的的检测人SLC17A3基因的基因突变信息来对检测对象进行分子分型。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因突变信息包括尿酸***关键路径的基因的等位基因检测结果。
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