CN111088332A - 一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，包括以下步骤：S1.提取检测对象的基因组DNA；S2.对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库；S3.对文库进行定量操作；S4.上机测序；S5.数据分析得到致病位点相关信息。本发明方法具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法。
背景技术
脑血管病是我国居民死亡和成人致残的第一原因，中国脑血管病的疾病经济负担远高于心血管病，最新中国心血管病报告显示，每年脑血管病防治费用逾千亿元。仅2014年缺血性脑血管病住院总费用就高达470亿元，是缺血性心血管病的3.5倍。脑血管病已经成为严重威胁我国人口健康、阻碍社会经济发展的主要公共卫生问题。脑小血管病(cerebralsmall vessel disease，CSVD)是脑血管病的一种，是指各种病因影响脑内小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所导致的一系列临床、影像、病理综合征。由于病理学资料难以获得，临床习惯上多指小的穿支动脉和小动脉病变所导致的临床和影像学表现，通常累及直径＜300μm的动脉血管。脑小血管具有重要的功能，包括血液运输、血脑屏障、维持大脑微环境的稳定等作用。因此当脑小血管病变时上述多个功能将被破坏，最终经多种机制导致脑实质性损伤。
许多病因均可引起脑小血管病，但随着分子遗传学的发展，证实了单基因遗传的脑小血管病是诱发缺血、出血性卒中和弥漫性脑白质病变以及导致血管性痴呆的主要原因。脑小血管病占卒中的20％-30％，更显著地提高了未来卒中的发病率。脑小血管病急性发作表现为腔隙性脑梗死或者脑实质性出血；慢性脑小血管病变突出表现为脑白质病变或者脑微出血，临床特点为隐袭性起病，持续性、进展性病程；严重的脑白质病变可以引起认知功能下降、抑郁、步态障碍等异常。脑小血管病因其发病的隐匿性及临床表现的多样性越来越引起学者的关注。
脑小血管病的临床表现缺乏特异性，目前诊断主要依靠影像学检查。头颅MRI是检查脑小血管病最重要的手段，但往往由于敏感度低。常需要结合常规检查序列如T1、T2、DWI等手段才能更敏感的反应脑微出血信息，操作复杂，费时且价格昂贵，对于脑小血管病的筛查及预防不具备普遍的意义。
尽管遗传性脑小血管病具有不同的特点和表现，但是遗传分析仍是诊断的金标准。通过对遗传性脑小血管病患者进行基因检测，可明确诊断，对脑血管病患者早期个体化防治提供有力证据。目前常见的有关脑小血管病基因检测方法主要是基于Sanger测序技术或一代测序技术，这些技术是以DNA单链为模板，经过PCR扩增得到各种连续的DNA片段，然后检测各个片段末端的碱基种类，这些方法不仅通量低、效率差，而且检测灵敏度度低(Sanger测序技术最低灵敏度为10％左右而检测低于10％的突变时误差极大；一代测序技术检测灵敏度为2％)，而二代测序技术检测灵敏度高达0.1％。
二代测序技术是目前公认的重要临床基因检测技术，其具有测序通量高、成本低、可检测突变范围广等特点。随着二代测序技术突飞猛进的发展，脑血管病致病基因突变不断被揭示，但是目前没有一种产品或技术可以一次性检测所有脑血管病相关致病基因突变。
发明内容
有鉴于此，针对遗传性脑小血管致病突变检测技术现状，本发明提出一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，该方法具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
所采用的技术方案为：
一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，包括以下步骤：
S1.提取检测对象的基因组DNA；
S2.对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库；
S3.对文库进行定量操作；
S4.上机测序；
S5.数据分析得到致病位点相关信息；
其中，步骤S2中构建文库的具体步骤如下：
S21.将基因组DNA进行片段化；
S22.将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A；
S23.将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以进行有效连接产物的富集；
S24.将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；
S25.使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；
S26.将捕获的目标片段分离；
S27.加上完整接头获得捕获文库。
优选地，S1中的基因组DNA来源于人类。
优选地，S1中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
优选地，S2和S3中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
优选地，S21中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。
优选地，S24中，使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：
Primer F:
5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
Primer R:
5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；
使用以下引物序列进行第二次PCR扩增：
TrueSeq Universal Primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
TrueSeq Primer-Index X:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；
其中NNNNNN为index标签。
优选地，S25中的探针为针对遗传性脑小血管病相关基因、相关突变点设计得到；捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。
优选地，S25中的探针包括ATRIP、TREX1、COL4A1、COL4A2、AGT、AGTR1、APOE、NOTCH3、CETP、PRKCH、MTHFR、TGFBR1、TGFBR2、NR3C1、ITGB6、NOS3、MYLK、IL-6、F3、CYP11B2、HTRA1中的至少一种。
优选地，S4中的上机测序通过二代测序平台进行。
优选地，S5的具体操作如下：通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病突变相关信息。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对脑小血管相关突变检测，提供了一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，该方法能够同时对一个样本的多个脑小血管相关突变进行分析，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
具体实施方式
本发明提供了一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，主要技术流程包括提取基因组DNA、文库制备、文库质检定量、上机测序及数据分析。具体如下：
根据本发明的一个实施例，目标基因捕获的方法不受限制。可以使用PCR富集的方法捕获目标基因。根据本发明的一个实施例，可以使用生物素标记的液相探针与待测样品中的目标区域进行杂交，之后使用链霉亲和素标记的磁珠将杂交产物分离出来，最后通过PCR富集目标区域同时在目标区域两侧连接完整的接头，形成文库。由此，可以将目标基因序列从基因组中捕获并富集。
根据本发明的一个实施例，基因组DNA样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例，基因组DNA样本是从受检人的血浆中分离。根据本发明的进一步的实施例，基因组DNA样本是从遗传性脑小血管病患者血浆中分离的。由此，可以有效地对遗传性脑小血管病患者的基因组DNA样本进行检测。
根据本发明的一个实施例，探针是针对遗传性脑小血管病相关的21个基因的相关位点进行设计。
根据本发明的一个实施例，使用纯化柱纯化基因组DNA，之后进行凝胶回收电泳，确认DNA质量。
根据本发明的一个实施例，基因组DNA纯化定量之后，取3μg进行DNA片段化，其中使用的片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切、限制性内切酶酶切，优先选用超声破碎。
根据本发明的一个实施例，将片段化DNA进行末端修复及3'末端添加碱基A。
根据本发明的一个实施例，将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头。
根据本发明的一个实施例，将连接产物进行PCR扩增。
根据本发明的一个实施例，将生物素标记探针与富集的样品中的目标区域进行杂交。
根据本发明的一个实施例，使用链霉亲和素标记磁珠将杂交有目标区域DNA的探针捕获下来。
根据本发明的一个实施例，使用PCR富集捕获的目标区域DNA，同时在两端加上完整的文库接头序列。
根据本发明的一个实施例，将文库定量，使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit。
根据本发明的一个实施例，使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：
Primer F:
5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO.1)
Primer R:
5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO.2)
根据本发明的一个实施例，使用Illumina公司通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增，包括一条通用的上游引物，和一条带有标签(Index)序列的下游引物，使用高效的PCR扩增酶进行PCR。使用带有标签(Index)序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。
PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQID NO.3)
TrueSeq Primer-Index X:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQ ID NO.4)
其中，下划线N部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物，用于不同的文库的区分。
根据本发明的一个实施例，为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行，可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化或琼脂糖胶电泳纯化，优选磁珠纯化。
根据本发明的一个实施例，使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量，其中以Ilumina P5、P7作为引物，使用Illumina phix control kit v3作为标准品。
根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Miseq平台，并进行数据分析，确定是否存在突变。
下面结合实施例1，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例是采用Miseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测，具体操作步骤如下:
1、按照说明书操作，使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit提取受检人的血浆中的基因组DNA。
2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。
本实施例中，使用Covaris超声破碎仪，按照标准操作，将3μg DNA片段化。
3、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用50μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：
4、使用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4 PNK进行末端修复。反应体系如下：
反应条件为：20℃，30min。
5、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μl洗脱，具体操作如下：
6、使用Exo(-)Klenow酶进行3'端加A碱基。反应体积如下：
反应条件为：37℃，30min。
7、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用15μl洗脱，具体操作如下：
8、使用TA DNA连接酶在模板两端加接头序列。反应体系如下：
反应条件为：20℃，15min。
9、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μl洗脱，具体操作如下：
10、对连接产物进行扩增，反应体系如下：
PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共循环4次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。
备注：
Primer F:
5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQ ID NO.1)
Primer R:
5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。(SEQ ID NO.2)
11、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用30μl洗脱，具体操作如下：
12、使用生物素标记的探针与样品杂交，反应如下体系：
| 成份 | 体积(μl) |
| library | 3.4 |
| Hybridizationbuffer | 13 |
| CaptureLiprary | 7 |
| BlockBuffer | 5.6 |
反应条件为：95℃，5min变性，之后保持在65℃，16-24h。
13、使用链霉亲和素标记的磁珠，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如下：
14、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。反应体系如下：
PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环12次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。
备注：PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；(SEQID NO.3)
TrueSeq Primer-Index4:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。(SEQ ID NO.5)
15、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用30μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：
16、文库质检定量。
将上一步得到的文库
2.0(Invitrogen)进行定量，使用Q-PCR进行质检。
17、上机测序及数据分析。
将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。
18、数据分析。
Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，对于illumina Miseq产生的原始数据进行质控以获得高质量DNA序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点，利用多个数据库对产生的高质量变异位点进行注释，将注释过的变异位点信息更新到ADMD(Amplicongene Diabetes Mellitus Database)中，并使用ADMD对变异位点进行进一步注释，配合临床表现对可疑位点进行筛选，对于未找到可疑位点的样本进行CNV(拷贝数据变异)筛选，整理诊断报告，具体结果如下：
在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸(英文：
Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语：“Q-PCR”为实时荧光定量核酸扩增(英文：Real-timeQuantitative PCR)。一种利用荧光检测达到实时检测PCR状况的PCR技术。
在本文中所使用的术语：“reads”为测得的DNA序列。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本发明的检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。
高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：(1)高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。(2)高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市第五人民医院
上海昂朴生物科技有限公司
泰州昂朴医学检验有限公司
<120> 一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactctctt tccctacacg acgctcttcc gatct 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtactggagt tcagacgtgt gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
Claims (10)
1.一种用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取检测对象的基因组DNA；
S2.对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库；
S3.对文库进行定量操作；
S4.上机测序；
S5.数据分析得到致病位点相关信息；
其中，步骤S2中构建文库的具体步骤如下：
S21.将基因组DNA进行片段化；
S22.将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A；
S23.将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以进行有效连接产物的富集；
S24.将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；
S25.使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；
S26.将捕获的目标片段分离；
S27.加上完整接头获得捕获文库。
2.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S1中的基因组DNA来源于人类。
3.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S1中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
4.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S2和S3中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
5.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S21中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。
6.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S24中，使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：
Primer F:
5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
Primer R:
5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；
使用以下引物序列进行第二次PCR扩增：
TrueSeq Universal Primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
TrueSeq Primer-Index X:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCT-3'；
其中NNNNNN为index标签。
7.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S25中的探针为针对遗传性脑小血管病相关基因、相关突变点设计得到；捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。
8.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S25中的探针包括ATRIP、TREX1、COL4A1、COL4A2、AGT、AGTR1、APOE、NOTCH3、CETP、PRKCH、MTHFR、TGFBR1、TGFBR2、NR3C1、ITGB6、NOS3、MYLK、IL-6、F3、CYP11B2、HTRA1中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S4中的上机测序通过二代测序平台进行。
10.根据权利要求1所述的用于获取遗传性脑小血管致病基因突变相关信息的检测方法，其特征在于，S5的具体操作如下：通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病突变相关信息。
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|---|---|---|---|---|
| CN111793678A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-20 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒 |
| CN112941165A (zh) * | 2021-03-09 | 2021-06-11 | 上海市第五人民医院 | 一种针对妊娠糖尿病的高通量检测试剂盒及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US20160053301A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Clearfork Bioscience, Inc. | Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna |
| CN107177670A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-09-19 | 上海昂朴生物科技有限公司 | 一种高通量检测帕金森病致病基因突变的方法 |
| CN108504729A (zh) * | 2017-06-21 | 2018-09-07 | 北京金准基因科技有限责任公司 | 遗传性脑小血管病基因检测试剂盒 |
-
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